胡春暉，于磊，趙先誠，郁全勝，劉豪

宿遷市第一人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇 宿遷 223800

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在全球男性惡性腫瘤發(fā)病和死亡譜中，前列腺癌分別居第2 位和第5 位[1]。近年來，隨著中國人口老齡化的加劇，前列腺癌的發(fā)病率和病死率均呈明顯上升趨勢[2]。2020 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國前列腺癌發(fā)病例數(shù)占全球8.2%，死亡例數(shù)占全球13.6%[3]。前列腺癌的確切病因尚未闡明，因此，積極篩選前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關鍵分子，對于尋求前列腺癌治療新策略具有非常重要的意義。Rab 蛋白家族是Ras 超家族中最大的亞家族，由小分子鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合蛋白組成，參與細胞內(nèi)吞作用和細胞囊泡轉(zhuǎn)運中的許多關鍵過程，主要調(diào)節(jié)細胞中囊泡轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)交換，Rab 表達失調(diào)被證實與包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病關系密切[4]。Rab25 是Rab蛋白家族成員，在細胞內(nèi)作為轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮關鍵作用，能夠與GTP 結(jié)合后將GTP 水解，對細胞囊泡轉(zhuǎn)運的各個階段進行調(diào)控[5]。Rab25 表達水平與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，其在頭頸部腫瘤、胃癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌和腎癌中高表達并發(fā)揮致癌作用，但在食管鱗狀細胞癌、三陰性乳腺癌和結(jié)直腸癌中低表達并發(fā)揮抑癌作用[6]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認為是導致腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制[7]，也是致癌的關鍵標志[8]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路是激活腫瘤EMT 的一條關鍵通路[9]。研究表明，TGF-β通過誘導EMT 加速腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。已有研究表明，Rab25 在乳腺癌EMT 過程中具有至關重要的作用[11]，然而Rab25 在前列腺癌中的功能和作用機制尚不清楚。本研究探討Rab25沉默對TGF-β誘導的前列腺癌LNCaP 細胞EMT 的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

LNCaP 細胞株購自上海吉凱基因科技有限公司，293T 細胞購自南京科佰生物科技有限公司，DNA 內(nèi)切酶和DNA marker 均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，DNA 連接酶購自日本Takara公司，DNA 凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Axygen 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Mix 均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，TRIzol 購自美國Invitrogen 公司，RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Corning 公司，結(jié)晶紫購自生工生物工程（上海）股份有限公司，聚凝胺（Polybrene）購自上海吉瑪制藥技術有限公司，Rab25 一抗購自美國CST 公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 PLKO.1-puro-Rab25-短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）重組干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.2.1 shRNA 干擾序列的設計和合成本研究共設計3條靶向Rab25基因的干擾序列，干擾靶點見表1，過表達質(zhì)粒是PLKO.1 質(zhì)粒。載體PLKO.1 帶有EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點。應用EcoRⅠ和AgeⅠ對載體PLKO.1 進行酶切后，使用T4 連接酶將經(jīng)過雙酶切的質(zhì)粒和干擾靶點連接到一起，構(gòu)建PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-1、PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-2、PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-3 重組質(zhì)粒，分別作為shRab25-1 組、shRab25-2 組、shRab25-3 組，并設置空白對照NC 組。

表1 針對Rab25基因的3個干擾靶點

1.2.2 細胞培養(yǎng)、慢病毒包裝及病毒感染細胞培養(yǎng)：使用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI1640 培養(yǎng)基（含1.5 mg/L 谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml 鏈霉素）常規(guī)培養(yǎng)LNCaP 細胞，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。慢病毒包裝：培養(yǎng)293T 細胞，培養(yǎng)至80%～90%融合時，傾去培養(yǎng)液，采用3 ml 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞2 次，加入1 ml 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）溶液，再加入1 ml DMEM 培養(yǎng)液，平均鋪到2 個10 cm2皿中。待細胞培養(yǎng)至60%～70%融合時進行轉(zhuǎn)染：2 個1.5 ml 管中分別加入5 μg shRab25和5 μg NC 質(zhì)粒，再加入包裝質(zhì)粒5 μg psPAX2 和2.5 μg pMD2.G，用1 ml 無血清RPMI1640 培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，再加入20 μl Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，混勻。室溫靜置20 min 后加入細胞。轉(zhuǎn)染8 h后換新鮮的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后收集培養(yǎng)基上清，分裝，感染LNCaP 細胞。

1.2.3 穩(wěn)篩株構(gòu)建將LNCaP 細胞按1×105/孔的濃度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞30%～40%融合時加入慢病毒2 ml，并加入終濃度為5 μg/ml的聚凝胺。待細胞80%～90%融合時加入嘌呤霉素，終濃度為2 μg/ml，同時設立空白對照組。維持嘌呤霉素濃度，隔天換液，連續(xù)觀察4 天，至空白對照組細胞全部死亡后，可認為已經(jīng)獲得穩(wěn)篩株。穩(wěn)篩株細胞擴增收樣。

1.3 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（quantitation reverse transcription- polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測Rab25 mRNA 相對表達量

收集各組細胞，TRIzol法提取總RNA，瓊脂糖電泳檢查RNA的完整性，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。Rab25上游引物5'-GGGAATGGAACTGAGGAAGATTA-3'，下游引物5'-CGTGAATCGGGAGAGTAGATTG-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，下游引物5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。逆轉(zhuǎn)錄反應體系為20 μl，其中2×SYBR Green Mix 10 μl，總RNA 1 μg，加焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水至20 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s。PCR 反應體系為20 μl，其中2×PCR Master Mix 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 模板0.5 μl，加ddH2O 至20 μl。PCR 反應條件：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。60～95 ℃緩慢升溫，產(chǎn)生Rab25和GAPDH的溶解曲線。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細胞中Rab25 蛋白表達水平

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（350 mA 恒流1.5 h）；用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h；加入一抗（1∶2000），室溫孵育1.5 h；用TBST緩沖液沖洗3 次，每次5～10 min；加入相應的二抗，室溫孵育30 min；用TBST 緩沖液沖洗3 次，每次5～10 min；用TBST 緩沖液潤洗2 次；加入適量的電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液，借助凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.5 Rab25 沉默對TGF-β介導的前列腺癌LNCaP細胞EMT 影響的實驗研究

培養(yǎng)NC 組和shRab25-1 組細胞，加入TGF-β（5 ng/ml）或不加入TGF-β，分別作為NC 組、NC+TGF-β組、shRab25-1 組、shRab25-1+TGF-β組，使用相差顯微鏡觀察各組LNCaP 細胞的形態(tài)學變化，采用Western Blot 檢測EMT 生物標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達情況。具體實驗步驟同1.4。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0、Graphpad Prism9.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重組shRNA 表達質(zhì)粒的DNA 測序結(jié)果

本研究設計了針對Rab25基因的3 個干擾靶點，并成功地將目的基因片段克隆到載體PLKO.1中。測序結(jié)果顯示，插入的堿基序列與設計的干擾靶點完全一致。PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-1、PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-2、PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-3 插入序列部分測序圖見圖1～圖3。

圖1 PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-1插入序列部分測序圖

圖2 PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-2插入序列部分測序圖

圖3 PLKO.1-puro-Rab25-shRNA-3插入序列部分測序圖

2.2 Rab25 mRNA 相對表達量的比較

RNA 電泳28S rRNA、18S rRNA 條帶清晰可見，說明RNA 未降解（圖4）；Rab25和GAPDH擴增曲線呈現(xiàn)平滑S形狀，熔解曲線主峰清晰，無雜峰出現(xiàn)，提示本次PCR 擴增產(chǎn)物較純，并無非特異性擴增（圖5）。shRab25-1 組、shRab25-2 組、shRab25-3組細胞中Rab25mRNA 相對表達量均低于NC 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中shRab25-1 細胞中Rab25mRNA 相對表達量最低（表2）。

圖4 RNA提取質(zhì)量檢測結(jié)果

圖5 Rab25和內(nèi)參GAPDH擴增曲線及熔解曲線

表2 各組細胞中Rab25 mRNA 相對表達量的比較（±s）

表2 各組細胞中Rab25 mRNA 相對表達量的比較（±s）

注：*與NC組比較，P＜0.05

組別NC組shRab25-1組shRab25-2組shRab25-3組Rab25 mRNA相對表達量0.985±0.014 0.322±0.021*0.586±0.024*0.576±0.025*

2.3 Rab25 蛋白表達水平的比較

shRab25-1 組、shRab25-2 組、shRab25-3 組中Rab25 蛋白相對表達量均低于NC 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中shRab25-1 組Rab25 蛋白表達水平最低（圖6、表3），故選取shRab25-1 作為后續(xù)實驗用的干擾載體。

圖6 Western blot檢測各組細胞中Rab25蛋白表達情況

表3 各組細胞中Rab25 蛋白相對表達量的比較（±s）

表3 各組細胞中Rab25 蛋白相對表達量的比較（±s）

注：*與NC組比較，P＜0.05

組別NC組shRab25-1組shRab25-2組shRab25-3組Rab25蛋白相對表達量0.475±0.068 0.167±0.018*0.335±0.012*0.326±0.036*

2.4 Rab25 沉默對TGF-β介導的前列腺癌細胞EMT 的影響

Rab25沉默后會降低細胞密度，加入TGF-β會部分逆轉(zhuǎn)這種抑制作用，同時各組細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯破壞（圖7）。shRab25-1 組細胞中E-cadherin 蛋白相對表達量高于NC 組，N-cadherin 蛋白相對表達量低于NC 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NC+TGF-β組細胞中E-cadherin 蛋白相對表達量低于NC 組，N-cadherin 蛋白相對表達量高于NC 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；shRab25-1+TGF-β組細胞中E-cadherin 蛋白相對表達量低于shRab25-1 組，N-cadherin 蛋白相對表達量低于NC+TGF-β組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（圖8、表4）

圖7 相差顯微鏡觀察LNCaP細胞經(jīng)相應處理后的細胞形態(tài)學變化（×200）

圖8 Western blot檢測各組細胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達情況

表4 各組細胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達量的比較（±s）

表4 各組細胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達量的比較（±s）

注：a與NC組比較，P＜0.05；b與shRab25-1組比較，P＜0.05；c與NC+TGF-β組比較，P＜0.05

E-cadherin蛋白相對表達量0.338±0.027 0.458±0.015a 0.197±0.020a 0.282±0.022b N-cadherin蛋白相對表達量0.427±0.047 0.270±0.083a 0.719±0.035a 0.316±0.023c組別NC組shRab25-1組NC+TGF-β組shRab25-1+TGF-β組

3 討論

Rab25 是囊泡轉(zhuǎn)運和膜動力學的主要調(diào)節(jié)因子，在細胞轉(zhuǎn)運這一正常生理過程中發(fā)揮重要作用，其與配體相互作用的改變及其活性的改變均能引起細胞轉(zhuǎn)導發(fā)生異常，從而影響腫瘤細胞生長、增殖、凋亡、遷移和侵襲[12]。目前的研究表明，Rab25 參與腫瘤細胞遷移和侵襲，在多種腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[13]。體外沉默Rab25可抑制高級別非小細胞肺癌[14]、成膠質(zhì)細胞瘤[15]、腎細胞癌[16]和前列腺癌[17]細胞遷移和侵襲。在胃癌細胞中可以觀察到沉默Rab25可以抑制腫瘤細胞侵襲[18]。在膀胱癌的研究中，沉默Rab25不僅能夠抑制體外腫瘤細胞遷移，還能減少體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。

EMT是一種進化上保守的發(fā)育程序，與致癌有關，通過增強侵襲能力和對凋亡刺激的抵抗力賦予腫瘤細胞轉(zhuǎn)移特性，被認為是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化中的一個基本事件[20]。隨著對Rab25 及EMT 的不斷深入研究，Rab25 被證實與多種腫瘤的EMT 密切相關。Yin等[21]研究報道，微小RNA（microRNA，miRNA）-577通過抑制乳腺癌中Rab25 的表達來抑制EMT。Jeong 等[22]研究報道，Rab25 可以通過血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）/血管內(nèi)皮細胞生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1）信號通路誘導snail家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1（snail family transcriptional repressor 1，SNAIL）表達，導致腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和EMT。Calvo等[23]在體外對前列腺癌小鼠模型的研究表明，Rab25的過表達與腫瘤細胞生長、侵襲和新生血管生成有關，并在體外保留了具有增加腫瘤進展的致瘤性特征。既往研究表明，Rab25在前列腺癌中表達升高，體外研究發(fā)現(xiàn)Rab25表達下調(diào)可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，然而Rab25在前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用機制尚無深入研究[17]。

在前列腺癌的發(fā)展過程中，上皮細胞可以發(fā)生EMT，其特點是表型從立方體到紡錘形的形態(tài)變化，導致細胞與細胞間黏附力喪失，從而使細胞遷移或轉(zhuǎn)移到不同器官[24]。這種生物行為與生化改變有關，其中上皮細胞標志物如E-cadherin 表達下調(diào)，而間質(zhì)標志物如波形蛋白和N-cadherin 表達上調(diào)[25]。上皮性腫瘤中最有效的EMT 誘導劑是TGF-β[26]，TGF-β誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT 常通過SMAD 介導或非SMAD 信號轉(zhuǎn)導通路，并導致侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生[27]。TGF-β誘導的EMT 在多種腫瘤中已被證實可被一些特異的分子靶標通過靶向EMT 信號通路抑制[26]。因此，抑制EMT 過程是一種有希望的治療腫瘤轉(zhuǎn)移的策略。

本研究成功完成了沉默Rab25的PLKO.1-puro-Rab25-shRNA 重組干擾質(zhì)粒的構(gòu)建，并成功篩選出能夠高效抑制LNCaP 細胞中Rab25 表達的重組干擾質(zhì)粒。本研究發(fā)現(xiàn)，Rab25沉默后可以減少TGF-β介導的LNCaP 細胞的EMT，表明Rab25 是TGF-β誘導前列腺癌LNCaP 細胞EMT 的一個關鍵中間因子，目前的證據(jù)證明Rab25沉默后可以部分逆轉(zhuǎn)TGF-β介導的前列腺癌細胞的EMT，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，Rab25沉默可逆轉(zhuǎn)TGF-β介導的前列腺癌LNCaP細胞的EMT，這為Rab25成為評估前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要生物標志物提供了理論依據(jù)，Rab25可能成為治療前列腺癌的新型分子靶標。