王遠敏,羅 敏,蘇 穆,李美燕,徐明興
[遵義市第一人民醫(yī)院(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院),貴州 遵義 563000]
肺部纖維化(pulmonary fibrosis,PF) 是由于慢性支氣管疾病、病毒性肺炎等肺部疾病,以及長期的吸煙、環(huán)境等因素導(dǎo)致的不同程度呼吸困難的疾病,是一種慢性、進行性、致命性的纖維化間質(zhì)疾病,可導(dǎo)致肺組織硬化、肺功能喪失,最終死亡,臨床治療多以激素控制,副作用較大[1]。尼達尼布和吡非尼酮是最新開發(fā)的抗纖維化藥物,在減輕肺功能下降和肺部纖維化進展方面有一定的應(yīng)用前景[2-3],但它們不能逆轉(zhuǎn)或阻止結(jié)構(gòu)損傷和肺功能的喪失,因此,開發(fā)治療肺纖維化的新藥或治療方法仍任重道遠?,F(xiàn)有研究表明,山柰酚屬于黃酮類化合物,存在于多種藥材、水果、蔬菜中,如八角茴香、白果、貫眾黃芪等[4],其因具有防癌、抗癌、抗感染、抗菌、抗病毒等多種功效而受到人們的廣泛關(guān)注[5],可用于治療多種急慢性炎癥、椎間盤退變、結(jié)腸炎、絕經(jīng)后骨丟失、急性肺損傷等疾病。此外,山柰酚有益于癌癥、肝損傷、糖尿病、肥胖患者,可抑制血管內(nèi)皮炎癥,保護顱神經(jīng)和心臟功能,但其對于肺部纖維化是否具有預(yù)防或治療作用未見報道。本研究探索山柰酚對博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的作用和對MRC-5人胚肺成纖維細胞的增殖、膠原生成的影響。
1.1 藥物 山柰酚對照品,購自成都德思特生物技術(shù)有限公司,純度≥98%,批號1092382910。
1.2 動物與細胞 SPF 級C57BL/6 小鼠40 只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2) g,由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK (湘) 2019-0014]。MRC-5人胚肺成纖維細胞株,購自中國科學(xué)院上海細胞庫。
1.3 試劑 磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline,PBS) 溶液; 博來霉素(批號S1214,上海藍木化工有限公司); 二甲苯、無水乙醇分析純?nèi)芤海ㄅ?0190801、20180907,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司); β-actin 蛋白抗體[批號4970,賽信通(上海) 生物試劑有限公司]; 轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1) 抗體、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA) 抗體、Ⅰ型膠原蛋白 (Collagen Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白( Collagen Ⅲ) 抗 體 [批 號 ab215715、ab124964、ab270993、ab7778,艾博抗(上海) 貿(mào)易有限公司]; 辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)、極超敏(enhanced chemiluminescent,ECL) 化學(xué)發(fā)光試劑盒、蘇木素伊紅染色液、CCK-8 試劑盒 (批號A0181、P0018FS、C0105M、C0037,上海碧云天生物技術(shù)有限公司); 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 制備試劑盒、Masson染色試劑盒、羧甲基纖維素鈉、MEM 培養(yǎng)基、羥脯氨酸試劑盒(批號P1200、G1340、C8621、41500、BC0250,北京索萊寶生物科技有限公司); MinuteTM動物細胞/組織總蛋白提取試劑盒(批號SD-1,北京英文特生物技術(shù)有限公司); 微量BCA 蛋白定量試劑盒(批號CW0014,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司); PVDF 膜(批號ISEQ00010,密理博中國有限公司); 免疫組化試劑盒、DAB 顯影液(批號PV-9000、ZLI-9018,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司); GIBCO 胎牛血清(批號2045512CP,上海賽默飛世爾科技公司); 重組人TGF-β1 蛋白[批號abs04204,愛必信(上海) 生物科技有限公司]; Collagen Ⅰ、Collagen ⅢELISA 試劑盒(批號CSB-E08082h、CSB-E04799h,武漢華美生物工程有限公司)。
1.4 儀器 WBP 動物無創(chuàng)肺功能呼吸檢測系統(tǒng)(上海塔望智能科技有限公司); 免疫組化成像系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司); 酶標(biāo)分析儀和細胞培養(yǎng)箱(上海賽默飛世爾科技公司); SW-CJ-2D 超凈工作臺(上海谷寧儀器有限公司)。
2.1 動物分組及處理 將小鼠隨機分為假手術(shù)組(10 只)和模型組(30 只),腹腔注射4%水合氯醛溶液進行麻醉,碘伏酒精消毒頸部皮膚,剪開頸部皮膚,剝離頸前組織(避免出血) 并仔細分離出氣管,假手術(shù)組氣管內(nèi)注射0.1 mL生理鹽水,模型組氣管內(nèi)注射生理鹽水溶解的博來霉素(5 mg/kg),每組0.1 mL,注射后小鼠快速倒立旋轉(zhuǎn),使博來霉素注射液或生理鹽水混勻于肺組織內(nèi),術(shù)后小鼠保溫蘇醒后正常喂食喂水飼養(yǎng)。將博來霉素誘導(dǎo)后肺纖維化小鼠模型隨機分為假手術(shù)組、模型組、山柰酚組(20 mg/kg)、吡非尼酮組(100 mg/kg),每組10 只。第2天開始,假手術(shù)組和模型組灌胃純凈水,給藥組灌胃相應(yīng)劑量藥物,給藥28 d,其間小鼠正常飲水進食。末次給藥1 h 后檢測每組小鼠呼吸功能,隨后脫頸處死并測量臟器系數(shù),摘取左肺用于檢測羥脯氨酸水平,右肺用于Masson 膠原染色、免疫組化檢測。
2.2 小鼠呼吸功能檢測和臟器系數(shù)分析 將小鼠放入WBP 動物無創(chuàng)肺功能呼吸檢測系統(tǒng)附帶的密閉容器內(nèi),設(shè)定參數(shù),先讓其適應(yīng)陌生黑暗環(huán)境10 min,啟動機器監(jiān)測記錄潮氣量(tidal volume,TVB)、吸氣時間(inspiration time,Ti)、呼氣時間(expiration time,Te)。小鼠稱重后快速脫頸處死,摘取肺臟并稱重,記錄并計算臟器系數(shù)。
2.3 小鼠肺組織羥脯氨酸水平檢測 根據(jù)試劑盒要求將0.2 g 小鼠左肺樣本組織放入試管中,將組織盡量剪碎以便消化,蓋子稍松不密閉,加入2 mL 的提取液,置于110 ℃烘箱中消化6 h 至無明顯團塊,25 ℃、16 000 r/min 離心20 min,用10 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至6~8,蒸餾水定容至4 mL,取上清液并加入相應(yīng)檢測試劑,混勻,60 ℃水浴20 min 后室溫靜置15 min,于560 nm 波長處測定吸光度。
2.4 Masson 膠原染色觀察小鼠肺組織膠原增殖情況 取每組左肺于多聚甲醛中固定12 h,自來水沖洗,70%乙醇中浸泡24 h,隨后經(jīng)80%、90%、100% 乙醇各浸泡3 h,二甲苯透明20 min,液體石蠟浸泡3 h,包埋組織,蠟塊室溫冷卻后以4 μm 厚度切片,37 ℃烘干后二甲苯脫蠟30 min,切片分別經(jīng)100%、90%、80%、70% 乙醇浸泡,Masson 膠原染色試劑染色,90% 乙醇脫水后二甲苯浸泡5 min,中性樹膠封片,鏡下觀察并評價肺組織膠原增殖程度變化。根據(jù)Szapiel 病理評價方法評分,0 分為無纖維化;1 分為輕度纖維化,病變范圍≤全肺20%; 2 分為中度纖維化,病變范圍全肺20% ~50%; 3 分為重度纖維化,病變范圍≥全肺50%,并且結(jié)構(gòu)改變。
2.5 免疫組化法檢測小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達 每組右肺石蠟切片后二甲苯脫蠟30 min,切片分別經(jīng)100%、90%、80%、70%乙醇浸泡,PBS 水化組織切片,根據(jù)PV-9000 試劑盒說明書進行操作,3%過氧化氫封閉30 min,PBS 緩沖液沖洗后滴加一抗(1 ∶100),4 ℃孵育過夜后PBS 緩沖液沖洗,滴加二抗室溫孵育60 min,PBS 緩沖液沖洗后,DAB 顯影5 min,自來水沖洗,蘇木素復(fù)染5 min,自來水沖洗,95%乙醇浸泡10 min,二甲苯浸泡透明10 min 后中性樹膠封片,鏡下觀察棕黃色顆粒為陽性表達,計算光密度。
2.6 細胞培養(yǎng)及處理 MRC-5 細胞采用含10% 胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),細胞生長至80%時胰酶消化傳代,以每孔5.0×103個的密度接種至96 孔板,貼壁24 h 后參考文獻[6] 報道設(shè)置空白組、TGF-β 組(10 ng/mL) 和20、40、80 μmol/L 山柰酚組(10 ng/mL TGF-β1+20、40、80 μmol/L 山柰酚),每組4個復(fù)孔,加入相應(yīng)試劑和藥物后孵育48 h,加入CCK-8 試劑繼續(xù)孵育4 h,于酶標(biāo)儀上450 nm 波長處檢測吸光度,計算抑制率,重復(fù)上述操作,取細胞培養(yǎng)基,檢測CollagenⅠ、Collagen Ⅲ水平。
2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理,數(shù)據(jù)以(±s) 表示,組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD 法。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
3.1 山柰酚對肺纖維化小鼠呼吸功能的影響 如表1 所示,與假手術(shù)組比較,模型組小鼠呼吸功能明顯受到限制,潮氣量降低(P<0.01),且吸氣時間和呼吸時間延長(P<0.01); 與模型組比較,山柰酚組和吡非尼酮組小鼠呼吸功能有所改善,潮氣量增加(P<0.05),吸氣時間、呼吸時間縮短(P<0.05)。
表1 山柰酚對肺纖維化小鼠呼吸功能的影響(±s,n=10)
表1 山柰酚對肺纖維化小鼠呼吸功能的影響(±s,n=10)
注: 與假手術(shù)組比較,**P<0.01; 與模型組比較,#P<0.05。
組別TVB/mLTi/msTe/ms假手術(shù)組0.44±0.1266.60±15.2552.11±12.49模型組0.24±0.11** 164.30±32.11** 154.30±20.20**山柰酚組0.36±0.08#90.41±22.21#101.50±11.38#吡非尼酮組0.38±0.11#88.43±20.46#99.40±14.06#
3.2 山柰酚對肺纖維化小鼠肺臟系數(shù)的影響 如表2 所示,與假手術(shù)組比較,模型組小鼠肺臟系數(shù)升高 (P<0.01); 與模型組比較,山柰酚組和吡非尼酮組小鼠肺臟系數(shù)降低(P<0.05)。
表2 山柰酚對肺纖維化小鼠肺臟系數(shù)的影響(±s,n=10)
表2 山柰酚對肺纖維化小鼠肺臟系數(shù)的影響(±s,n=10)
注: 與假手術(shù)組比較,**P<0.01; 與模型組比較,#P<0.05。
組別肺臟系數(shù)/(mg·g-1)假手術(shù)組0.004±0.002模型組0.024±0.010**山柰酚組0.013±0.002#吡非尼酮組0.013±0.004#
3.3 山柰酚對肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸水平的影響 如表3 所示,與假手術(shù)組比較,模型組小鼠肺組織羥脯氨酸水平升高(P<0.01); 與模型組比較,山柰酚組和吡非尼酮組小鼠肺組織羥脯氨酸水平降低(P<0.01)。
表3 山柰酚對肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸水平的影響(±s,n=10)
表3 山柰酚對肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸水平的影響(±s,n=10)
注: 與假手術(shù)組比較,**P<0.01; 與模型組比較,##P<0.01。
組別羥脯氨酸/(μg·mg-1)假手術(shù)組0.88±0.54模型組2.27±1.15**山柰酚組1.10±0.66##吡非尼酮組1.03±0.49##
3.4 山柰酚對肺纖維化小鼠肺組織膠原蛋白增殖的影響 如圖1、表4 所示,假手術(shù)組箭頭所示在肺泡和細支氣管周圍有少量的膠原,組織結(jié)構(gòu)完整,無出血滲出; 與假手術(shù)組比較,模型組箭頭所示膠原蛋白圍繞氣管和肺泡大量增殖,導(dǎo)致正常肺泡結(jié)構(gòu)消失并有粘連、充血,病理評分升高(P<0.01); 與模型組比較,山柰酚組和吡非尼酮組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)較完整,雖有膠原蛋白異常增殖,但程度較輕,病理評分降低(P<0.01)。
圖1 各組小鼠肺組織Masson 染色(×100)
表4 山柰酚對肺纖維化小鼠肺組織膠原蛋白增殖的影響(±s,n=10)
表4 山柰酚對肺纖維化小鼠肺組織膠原蛋白增殖的影響(±s,n=10)
注: 與假手術(shù)組比較,**P<0.01; 與模型組比較,##P<0.01。
組別病理評分/分假手術(shù)組0.13±0.32模型組2.22±0.71**山柰酚組1.47±0.70##吡非尼酮組1.73±0.48##
3.5 山柰酚對肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達的影響 如圖2、表5 所示,假手術(shù)組TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白平均光密度較低; 與假手術(shù)組比較,模型組TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白平均光密度升高(P<0.01); 與模型組比較,山柰酚組、吡非尼酮組小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白平均光密度降低(P<0.05,P<0.01)。
圖2 各組小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ免疫組化染色(×200)
表5 山柰酚對肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達的影響(±s,n=10)
表5 山柰酚對肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達的影響(±s,n=10)
注: 與假手術(shù)組比較,**P<0.01; 與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。
組別TGF-β1ɑ-SMACollagen ⅠCollagen Ⅲ假手術(shù)組0.22±0.100.11±0.050.02±0.010.06±0.04模型組0.44±0.11**0.43±0.10**0.33±0.06**0.34±0.06**山柰酚組0.25±0.09##0.22±0.12##0.14±0.11#0.24±0.06##吡非尼酮組0.26±0.13##0.19±0.16##0.15±0.10#0.19±0.10##
3.6 山柰酚對MRC-5 人胚肺成纖維細胞增殖活性和Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ水平的影響 如表6 所示,與空白組比較,TGF-β1 組MRC-5 細胞增殖抑制率無明顯變化(P>0.05),Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ水平升高(P<0.01);與TGF-β1 組比較,各濃度山柰酚組MRC-5 細胞增殖抑制率升高(P<0.01),Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ水平降低(P<0.01),并呈劑量依賴性。
表6 山柰酚對MRC-5 細胞增殖和Collagen Ⅰ、CollagenⅢ水平的影響(±s,n=4)
表6 山柰酚對MRC-5 細胞增殖和Collagen Ⅰ、CollagenⅢ水平的影響(±s,n=4)
注: 與空白組比較,**P<0.01; 與TGF-β1 組比較,##P<0.01。
組別抑制率/%Collagen Ⅰ/(ng·mL-1)Collagen Ⅲ/(ng·mL-1)空白組0.00±0.0025.35±0.4328.76±0.35 TGF-β1 組0.00±0.0040.78±0.67** 47.44±0.61*20 μmol/L 山柰酚組 14.37±2.35##35.12±0.35## 37.23±0.58##40 μmol/L 山柰酚組 21.56±1.73##36.22±0.21## 36.55±0.62##80 μmol/L 山柰酚組 26.15±2.43##33.37±0.40## 36.79±0.43##
肺部纖維化是以肌成纖維細胞異?;罨?、細胞外基質(zhì)過度積聚、肺瘢痕形為主要特征[7],其中肺細胞外基質(zhì)在肺纖維化過程中可發(fā)生生物特性的改變并促進肺纖維化的發(fā)展。多種細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白參與了肺纖維化的病理過程,如膠原蛋白、羥脯氨酸等蛋白與細胞增殖、遷移、分化、氣道上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換以及各種分泌型介質(zhì)的產(chǎn)生和激活,在肺纖維化的發(fā)展中起重要的促進作用,因此,細胞外基質(zhì)可作為肺纖維化治療的潛在靶點[8]。
本研究發(fā)現(xiàn),博來霉素誘導(dǎo)的肺部纖維化小鼠肺組織潮氣量降低,呼氣時間和吸氣時間延長,經(jīng)山柰酚干預(yù)可有效改善肺部纖維化小鼠的呼吸功能,增加小鼠肺組織潮氣量,縮短吸氣時間,與陽性藥相當(dāng)。Masson 染色發(fā)現(xiàn),模型組肺部纖維化小鼠肺組織膠原蛋白水平升高,肺組織結(jié)構(gòu)病理性改變,正常的肺泡結(jié)構(gòu)被大量異常增殖的膠原組織替代,肺泡間氣體交換功能損害; 經(jīng)山柰酚和吡非尼酮干預(yù)后,小鼠膠原蛋白水平整體下降,殘留的肺泡結(jié)構(gòu)較多,有效改善了肺纖維小鼠的通氣功能。羥脯氨酸是膠原蛋白的組成成分,占其氨基酸總量的13%,本研究結(jié)果表明,模型組小鼠肺組織羥脯氨酸水平較高; 給予山柰酚和吡非尼酮干預(yù)后降低,提示山柰酚和吡非尼酮都具有改善博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化膠原形成的作用。
TFG-β1 是一種重要的生長因子,參與了成纖維細胞的分化和微環(huán)境的形成[9],是目前已開發(fā)肺纖維化治療藥物針對的關(guān)鍵靶點之一,如吡非尼酮[10-11]。ɑ-SMA 作為細胞骨架蛋白,是成纖維細胞活化的標(biāo)志,其表達與肺纖維化程度呈正相關(guān)性[12-13]。Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白是肺組織細胞外基質(zhì)中膠原的主要成分[14],肺組織細胞外基質(zhì)與肺纖維化關(guān)系最為密切,肺組織損傷后,細胞外基質(zhì)過量沉積于肺間質(zhì),使肺結(jié)構(gòu)破壞,換氣面積減少,肺泡膜增厚,最終發(fā)生呼吸衰竭[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達均升高;經(jīng)山柰酚和吡非尼酮干預(yù)后,這些蛋白表達降低,表明山柰酚和吡非尼酮都能夠改善肺纖維化小鼠肺組織細胞外基質(zhì)的過度沉積或表達。體外MRC-5 人胚肺成纖維細胞增殖實驗驗證,山柰酚能降低MRC-5 細胞分泌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ水平。
綜上所述,山柰酚能夠改善因博來霉素引發(fā)的小鼠肺纖維化病理改變,抑制體外TGF-β1 刺激的MRC-5 細胞增殖活性,其機制可能與下調(diào)TGF-β/smad 通路中的TGF-β1蛋白表達來減少膠原蛋白和纖維的形成,以及下調(diào)ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達有關(guān)。