李時(shí)超，陳 騰，秦鳳鳳，陳 超，李五生，王 杰*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062； 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；3.安徽醫(yī)科大學(xué)上海普陀中心臨床學(xué)院，上海 200062； 4.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610075）

胃癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，雖然在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率有所下降，位居惡性腫瘤的第6 位，但是其死亡率卻位居第3 位［1］。我國是胃癌的高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的第2 位［2］。胃癌的治療是以手術(shù)為主，輔以化療、放療等綜合治療。中醫(yī)藥是胃癌防治中重要的組成部分，在癌前病變的預(yù)防，延長患者生存期，減輕化療不良反應(yīng)等方面有一定的優(yōu)勢［3］。

華蟾素是蟾酥的提取物，可用于治療胃癌，研究顯示，華蟾素能提高晚期胃癌化療的反應(yīng)率和疾病控制率，改善晚期胃癌患者的生活質(zhì)量［4］，但是由于華蟾素有效成分比較復(fù)雜，進(jìn)一步對(duì)其有效成分和作用機(jī)制的研究是促進(jìn)華蟾素臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)，通過將藥物、靶點(diǎn)、疾病靶基因交集在具有多層次交互作用的生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中的一門新學(xué)科［5］。分子對(duì)接是基于計(jì)算機(jī)模擬結(jié)構(gòu)的方法，通過對(duì)接的手段在分子水平上預(yù)測配體-受體的相互作用，或評(píng)估構(gòu)效關(guān)系，以識(shí)別具有治療意義的化合物的一項(xiàng)新技術(shù)［6］。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，研究華蟾素治療胃癌的分子機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用華蟾素輔助治療胃癌提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 華蟾素成分篩選及預(yù)測靶點(diǎn)獲取 檢索PubMed、CNKI、萬方、VIP 數(shù)據(jù)庫得到華蟾素抗腫瘤的主要物質(zhì)，檢索PubChem 數(shù)據(jù)庫 （http： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov） 獲取華蟾素成分的分子結(jié)構(gòu)及Canonical SMILES 號(hào)，通過 SwissTargetPrediction （ http： / /swisstargetprediction.ch/）、PharmMapper （http： / /lilab-ecust.cn/pharmmapp）、TargetNet （http： / /targetnet.scbdd.com/homeer） 網(wǎng)站預(yù)測華蟾素成分靶點(diǎn)，采用UniProt Knowledgebase （UniProtKB，http： / /www.uniprot.org/） 校 正 后，以 SwissTarget Prediction Prob ≥ 0.10、TargetNet Prob ≥ 0.60 或PharmMapper Fit≥0.60 為條件篩選預(yù)測靶點(diǎn)。

1.2 胃癌疾病基因獲取 以“gastric cancer” 為關(guān)鍵詞，種屬限定為“Homosapiens”，搜索治療目標(biāo)數(shù)據(jù)庫（TTD，http： / /bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd）、在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫 （ OMIM，http： / /www.omim.org/）、DisGeNET 數(shù) 據(jù) 庫 （ http： / /www.disgenet.org ）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫 （https： / /www.genecards.org/），以GeneCards 得分≥10 分、DisGeNET≥0.10 為篩選條件，刪除重復(fù)基因，得到胃癌疾病基因。

1.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)及其蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過R 軟件將華蟾素主要成分的預(yù)測靶點(diǎn)與胃癌疾病基因取交集，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)。通過String 平臺(tái)構(gòu)建藥物-疾病共同靶點(diǎn)的蛋白相互作用（PPI） 網(wǎng)絡(luò)，將蛋白種類設(shè)置為 “Homosapines”，最低相互作用閾值設(shè)為中等“medium confidence” （0.4），其他為默認(rèn)設(shè)置。然后下載tsv 格式文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值來評(píng)價(jià)主要靶點(diǎn)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1 個(gè)基因，度值與節(jié)點(diǎn)相連節(jié)點(diǎn)的數(shù)量相關(guān)，度值越大，節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

表1 華蟾素主要成分信息

1.4 華蟾素-胃癌共同靶點(diǎn)生物功能和通路分析 采用ClusterProfiler R 軟件對(duì)華蟾素-胃癌共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO） 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 的通路富集分析。

1.5 藥物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將華蟾素與胃癌共同靶點(diǎn)PPI 的tsv 格式文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病可視化的網(wǎng)絡(luò)模型，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)代表藥物成分、疾病靶基因，通過度值篩選華蟾素治療胃癌的關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)與胃癌預(yù)后的相關(guān)性 通過Kaplan-Meier 在線網(wǎng)站（http： /kmplot.com/analysis/） 選擇胃腺癌數(shù)據(jù)庫，輸入篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)，得到與胃癌總體生存期相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)比（HR） 和log rank 檢驗(yàn)的P值，P＜0.05 表示該靶點(diǎn)與胃癌的臨床預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

1.7 華蟾素主要成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接 從PubChem數(shù)據(jù)庫（https： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下載配體化合物的3D 結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)換格式，從PDB 數(shù)據(jù)庫（https： / /www.rcsb.org/） 中下載受體蛋白3D 結(jié)構(gòu)，采用Pymol 軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、加氫等操作，Auto Dock軟件將化合物及靶蛋轉(zhuǎn)換為*pdbqt 格式，Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，Pymol 軟件分析配體和受體的相互作用。

1.8 核心靶點(diǎn)與胃癌臨床預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的單因素、多因素Cox回歸分析 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接、臨床預(yù)后數(shù)據(jù)庫結(jié)果篩選出核心基因靶點(diǎn)，通過R 語言中的survival 包在TCGA、GEO （GSE15459） 胃癌數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行單因素Cox回歸分析，在TCGA 數(shù)據(jù)庫中將篩選出的核心基因靶點(diǎn)通過R 語言中的survival 包進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，以評(píng)價(jià)核心靶點(diǎn)與胃癌臨床風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后的關(guān)系。再計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，公式為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分＝基因1 表達(dá)量×多因素Cox 回歸系1＋…＋基因N表達(dá)量×多因素Cox 回歸系數(shù)N（其中N代表基因數(shù)），計(jì)算每例患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，通過survival 包中的surv_ cutpoint 函數(shù)計(jì)算cutoff 值，將患者劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，采用R 語言中的survminer包繪制Kaplan-Meier （KM） 生存曲線，計(jì)算2 組患者的生存率以評(píng)價(jià)模型性能。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素主要成分及其預(yù)測靶點(diǎn) 參考文獻(xiàn)［7-8］ 報(bào)道，蟾毒內(nèi)酯類、吲哚生物堿類為華蟾素抗腫瘤的主要活性成分，將這2 類成分所含的化合物通過檢索PubChem 數(shù)據(jù)庫得到含有分子結(jié)構(gòu)的化合物28 個(gè)，其中蟾毒內(nèi)酯類有20 個(gè)，分別為華蟾毒它靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、遠(yuǎn)華蟾蜍精、日蟾蜍他靈、沙蟾毒精、蟾毒靈、蟾蜍他靈、偽異沙蟾毒精、resibufaginol、脂蟾蜍精、去乙酰華蟾蜍精、華蟾蜍毒醇、去乙酰華蟾毒它靈、蟾毒它靈寧、海蟾蜍精、19-羥基蟾毒靈、嚏根草醇、蟾蜍它里定、偽異沙蟾毒精；吲哚生物堿類有8 個(gè)，分別為蟾蜍硫堇、蟾蜍特尼定、蟾毒色胺、五羥色胺、脫氫蟾蜍色胺、N-乙酰羥色胺、5-羥基吲哚-3-甲醛、蟾蜍色胺C，具體見表1。按篩選條件將各數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點(diǎn)匯總，去重后得到484 個(gè)華蟾素主要成分的預(yù)測靶點(diǎn)。

2.2 胃癌疾病靶點(diǎn) 按篩選條件，得到各數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)為TTD 數(shù)據(jù)庫41 個(gè)、OMIM 數(shù)據(jù)庫484 個(gè)、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫290 個(gè)、GeneCards 數(shù)據(jù)庫311 個(gè)，刪除重復(fù)基因后得到胃癌疾病基因981 個(gè)。

2.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)及其PPI 網(wǎng)絡(luò) 將華蟾素主要成分的預(yù)測靶點(diǎn)與胃癌疾病基因取交集，得到兩者共同靶點(diǎn)70 個(gè)。通過String 平臺(tái)和Cytoscape 3.7.2 軟件得到70 個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1～2。PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中，SRC （度值50）、CTNNB1 （度值48）、MAPK1 （度值47）、MAPK3 （度值47）、STAT3 （度值46）、EGFR （度值44）、ALB （度值43）、MTOR （度值42）、ESR1 （度值41）、IL6（度值40） 是度值靠前的節(jié)點(diǎn)，可能為華蟾素治療胃癌的主要靶點(diǎn)。

圖1 華蟾素與胃癌共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖2 華蟾素與胃癌共同靶點(diǎn)（排名前20 位）

2.4 華蟾素-胃癌共同靶點(diǎn)GO 生物功能分析 華蟾素治療胃癌的靶點(diǎn)影響了1 399 個(gè)生物學(xué)過程、75 個(gè)分子功能，生物過程主要包括肽基絲氨酸磷酸化、肽基絲氨酸修飾、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、蛋白激酶B 信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、對(duì)活性氧的反應(yīng)等，分子功能主要包括蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、組蛋白激酶活性、核受體活性等。排名前二十的生物過程、分子功能富集結(jié)果見圖3～4。

圖3 華蟾素與胃癌共同靶蛋白涉及的生物過程GO 富集分析

圖4 華蟾素與胃癌共同靶蛋白涉及的分子功能GO 富集分析

2.5 華蟾素-胃癌共同靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析 共得到145 條信號(hào)通路，P值排名前20 位的見圖5，主要包括EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗、癌癥中的蛋白聚糖、胃癌、ErbB 信號(hào)通路、乳腺癌、神經(jīng)膠細(xì)胞瘤等。

圖5 華蟾素與胃癌共同靶蛋白KEGG 富集分析（排名前20 位）

2.6 構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò) 由圖6 可知，華蟾素治療胃癌的主要化合物是華蟾毒它靈（度值15）、蟾毒它靈（度值12）、華蟾酥毒基（度值8）、蟾蜍色胺C（度值8）、蟾毒靈（度值6），關(guān)鍵靶點(diǎn)有SRC （度值51）、CTNNB1 （度值49）、MAPK1 （度值48）、MAPK3 （度值48）、STAT3 （度值47）、EGFR （度值45）、ALB （度值44）、ESR1 （度值43）、MTOR （度值42）、IL6 （度值41）。

圖6 華蟾素-靶點(diǎn)-胃癌相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)與胃癌預(yù)后的相關(guān)性 結(jié)果見表2、圖7A～7B，可知SRC、CTNNB1、MAPK1、MAPK3、EGFR、ALB、ESR1 的log rank 檢驗(yàn)P＜0.05，表明這些靶點(diǎn)與胃癌總體生存期存在明顯相關(guān)性，也與胃癌的臨床預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

圖7 部分核心靶點(diǎn)與胃癌預(yù)后的相關(guān)性及與resibufaginol 的分子對(duì)接圖

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)與胃癌總體生存期的相關(guān)性

2.8 華蟾素主要成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接 分子對(duì)接結(jié)合能小于0，表示配體與受體可自發(fā)結(jié)合，并且當(dāng)結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 時(shí)，小分子配體與受體結(jié)合較好［9］。將華蟾素主要成分分別與 SRC、CTNNB1、MAPK1、MAPK3、STAT3、EGFR、ALB、MTOR、ESR1、IL6 進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合能大多小于等于-5.0 kJ/mol，見圖7C～7D、圖8，說明華蟾素主要成分與胃癌關(guān)鍵靶點(diǎn)間有較好的結(jié)合活性，其中所有關(guān)鍵靶點(diǎn)與華蟾素主要成分resibufaginol（-112.4 kJ/mol）、華蟾酥毒基（-81.9 kJ/mol）、偽異沙蟾毒精（-79.9 kJ/mol）、沙蟾毒精（-79.7 kJ/mol）、華蟾蜍毒醇（-79.3 kJ/mol） 結(jié)合能較好，華蟾素主要與關(guān)鍵靶點(diǎn)EGFR （- 143.0 kJ/mol）、MTOR （-139.8 kJ/mol）、MAPK3 （-139.3 kJ/mol）、ALB （-137.9 kJ/mol）、STAT3（-136.3 kJ/mol） 結(jié)合能較好，表明這些靶點(diǎn)與華蟾素的主要成分更容易結(jié)合。結(jié)合“2.7” 項(xiàng)下結(jié)果可知，這些靶點(diǎn)中EGFR、MAPK3、ALB 與胃癌預(yù)后密切相關(guān)，推測三者可能是華蟾素治療胃癌的核心靶點(diǎn)。

圖8 華蟾素主要成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接熱圖

2.9 核心靶點(diǎn)與胃癌臨床預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的單因素、多因素Cox回歸分析 對(duì)篩選出的3 個(gè)核心基因靶點(diǎn) （EGFR、MAPK3、ALB） 進(jìn)行單因素Cox 回歸分析，發(fā)現(xiàn)在TCGA數(shù)據(jù)庫中核心靶點(diǎn)EGFR、ALB 與胃癌臨床預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，在GEO 數(shù)據(jù)庫中核心靶點(diǎn)MAPK3 與胃癌臨床預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，具體見表3。在TCGA 數(shù)據(jù)庫中對(duì)3 個(gè)核心基因靶點(diǎn)進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，得到胃癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，公式為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分＝EGFR 表達(dá)值×0.153 ＋MAPK3 表達(dá)值× （-0.067 2） ＋ALB 表達(dá)值×0.09，對(duì)每例胃癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，通過surv_ cutpoint 函數(shù)計(jì)算出cutoff 值為0.285 197 9，并據(jù)此分為高風(fēng)險(xiǎn)組（96 例） 和低風(fēng)險(xiǎn)組（292 例）。KM 分析結(jié)果顯示，與低風(fēng)險(xiǎn)組比較，高風(fēng)險(xiǎn)組患者總體生存率更低（P＜0.01），表明華蟾素治療胃癌的3 個(gè)核心靶點(diǎn)與胃癌臨床預(yù)后密切相關(guān)，見圖9。

圖9 核心靶點(diǎn)與胃癌臨床預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的多因素Cox 回歸分析

表3 核心靶點(diǎn)與胃癌臨床預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的單因素Cox 回歸分析

3 討論

中醫(yī)藥在腫瘤防治中的作用越來越引起人們的重視，但由于中醫(yī)藥成分的復(fù)雜性和作用機(jī)制的不確定性，阻礙了中醫(yī)藥在腫瘤疾病中的廣泛應(yīng)用［10］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體的角度闡明中醫(yī)藥的作用機(jī)制和作用成分，有利于中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究［11］。胃癌屬中醫(yī)“噎膈” “胃返” “積聚”等范疇，病機(jī)以正虛為本、癌毒為標(biāo)，而癌毒蘊(yùn)結(jié)于胃是其發(fā)病的關(guān)鍵，癌毒不除，疾病難愈［12］?！督饏T要略心典》曰： “毒者，邪氣蘊(yùn)蓄不解之謂”，因此癌毒致病，法當(dāng)解毒。而華蟾素具有解毒、消腫、止痛之功，在胃癌的輔助治療中具有良好的療效。

本研究顯示，華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾酥毒基、蟾蜍色胺C、蟾毒靈是華蟾素治療胃癌的關(guān)鍵成分，除蟾蜍色胺C 外都是華蟾素的主要成分之一，這些關(guān)鍵成分在多種腫瘤的治療中顯示多重作用。研究表明，華蟾毒它靈增加耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［13］。蟾毒它靈能促進(jìn)黑色素瘤［14］和食道癌［15］細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的增殖。華蟾素主要成分的華蟾酥毒基的作用較為廣泛，可以通過抑制自噬增加胃癌細(xì)胞的凋亡［16］，對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有抗增殖和促凋亡作用［17］，抑制腸癌的血管生成［18］、逆轉(zhuǎn)P-gp 介導(dǎo)的腸癌多藥耐藥性［19］。蟾蜍色胺C 是一種新型的吲哚類生物堿，有研究顯示它對(duì)肺癌A549 細(xì)胞的毒性強(qiáng)于5-FU［20］。蟾毒靈是華蟾素成分中研究最熱門的物質(zhì)，在胃癌中蟾毒靈能通過下調(diào)Wnt/ASCL2 表達(dá)來抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［21］，逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性［22］，抑制保護(hù)性自噬發(fā)揮抗胃癌作用［23］。

本研究篩選出了華蟾素治療胃癌的核心靶點(diǎn)是EGFR、MAPK3 （又稱ERK1）、ALB，相關(guān)文獻(xiàn)也證實(shí)了篩選結(jié)果。另外，華蟾素的關(guān)鍵成分蟾毒靈能通過EGFR/AKT/ERK 信號(hào)通路抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖［24］； 蟾毒靈可通過調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中的ERK 信號(hào)通路來發(fā)揮抗癌作用［23］； 蟾毒靈可通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中ALB 和AFP 的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的惡性表型并促進(jìn)其分化和成熟［25］。

本研究中華蟾素抗胃癌涉及的KEGG 核心通路是EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路，富集了最多的靶點(diǎn)。在篩選出華蟾素治療胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)中，SRC、MAPK1、MAPK3、STAT3、EGFR、mTOR 與核心通路EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路相關(guān)，華蟾素及其主要成分對(duì)核心通路中的這些靶點(diǎn)的作用都有相關(guān)研究報(bào)道。其有效成分蟾毒靈是SRC-3 和SRC-1 的有效小分子抑制劑［26］，能夠抑制EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路的激活； 華蟾素可以通過抑制c-Met/ERK 信號(hào)通路的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來阻止肝癌HepG2 細(xì)胞遷移和侵襲［27］； 華蟾酥毒基可通過阻斷IL-6/STAT3 信號(hào)通路抑制骨肉瘤細(xì)胞的活力和成瘤能力［28］； 蟾毒靈可通過靶向mTOR/HIF-α 途徑抑制卵巢癌增殖和遷移［29］。

綜上所述，華蟾素治療胃癌的關(guān)鍵成分為華蟾毒它靈、蟾毒它靈、華蟾酥毒基、蟾蜍色胺C、蟾毒靈，可能通過調(diào)控EGFR、MAPK3、ALB、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、內(nèi)分泌抵抗、癌癥中的蛋白聚糖等多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮對(duì)胃癌的治療作用，以期為進(jìn)一步的臨床或?qū)嶒?yàn)研究提供科學(xué)依據(jù)和研究思路。