袁鄉(xiāng)石，蘇羽屾，榮冬蕓，曹 煜，王 葉，唐姍姍

（貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004）

宮頸癌是人類最常見的乳頭狀瘤病毒（HPV） 相關(guān)癌癥，疫苗接種在很大程度上仍然無法普及，一旦確診，預(yù)后較差，特別是轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)性病例［1］。免疫治療和靶向治療已經(jīng)能夠延長整體生存期［2］，然而存在與化療相關(guān)的缺點，包括頻繁復(fù)發(fā)、耐藥性、對剩余的非癌細(xì)胞的副作用［3］。因此，尋找適合的藥物治療宮頸癌已成為科研界密切關(guān)注的問題。珊瑚姜為苗醫(yī)常用藥材，具有抗細(xì)菌、抗真菌及抗腫瘤等活性［4-5］，松油烯-4-醇是其主要成分之一［6-7］，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌等活性［8-9］。松油烯-4-醇被證明對人黑色素瘤細(xì)胞［10］、人非小細(xì)胞肺癌［11］、人白血病細(xì)胞［8］、人胃腸腫瘤細(xì)胞［12］具有抑制作用。但對于人宮頸癌Siha 細(xì)胞的影響及其作用機制方面的研究卻少有報道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，松油烯-4-醇具有較強的抗宮頸癌活性，表明它也是一種很好的抗宮頸癌候選藥物。因此，本研究將進一步探索松油烯-4-醇對人宮頸癌Siha 細(xì)胞的影響及其作用機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人宮頸癌Siha 細(xì)胞系購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至85%左右時進行傳代及后續(xù)細(xì)胞實驗。

1.2 試劑 松油烯-4-醇（純度≥95%，貨號1125A021，北京索萊寶科技有限公司）。一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號C1086，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Annexin V-FITC/PI 試劑盒、JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（貨號MA0220-1、MA0338，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；RT-qPCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ［貨號RR036A，生工生物工程（上海） 股份有限公司］； 山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（貨號ZB2301、ZB2305，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）； RTqPCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 將Siha 細(xì)胞以每孔1×105個的密度接種至6 孔板，貼壁后分別用0 （即0.1% DMSO 處理的對照組）、5、7.5、10 μmol/L 松油烯-4-醇、10 μmol/L 順鉑（陽性對照組） 處理24 h，通過共聚焦顯微鏡（×200） 明場視野觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.2 MTT 法檢測細(xì)胞相對增殖率 將Siha 細(xì)胞以每孔5 000個的密度接種至96 孔板，貼壁后分別用0、5、7.5、10 μmol/L 松油烯-4-醇及10 μmol/L 順鉑處理細(xì)胞，24 h后加入10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，采用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm 波長處的吸光度（A），計算細(xì)胞增殖率。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 按“2.1” 項下方法處理細(xì)胞，用不含EDTA 的胰酶消化，離心并用流式緩沖液吹散細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI 避光室溫孵育15 min，流式細(xì)胞儀上機檢測并記錄。細(xì)胞凋亡率＝早期細(xì)胞凋亡率＋晚期細(xì)胞凋亡率。

2.4 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡水平 按“2.1” 項下方法處理細(xì)胞，PBS 洗滌1 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌后用含0.3%TritonX-100 的PBS 室溫孵育5 min，PBS 洗滌后加50 μL TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育60 min。通過共聚焦顯微鏡觀察各組Siha 細(xì)胞染色情況，以細(xì)胞核呈綠色熒光為TUNEL 陽性細(xì)胞，統(tǒng)計高倍鏡（×400） 下陽性細(xì)胞數(shù)目，評估Siha 細(xì)胞凋亡水平。

2.5 線粒體膜電位檢測 按“2.1” 項下方法處理細(xì)胞，PBS 洗滌1 次，加入1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，37 ℃孵育20 min，吸棄上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次，再加入2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，通過共聚焦顯微鏡（×200） 觀察。當(dāng)線粒體膜電位（Δψm） 大于120 mV 時，JC-1 在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，被490 nm 波長激發(fā)光激發(fā)后發(fā)出紅光； 當(dāng)線粒體膜電位（Δψm）小于120 mV 時，JC-1 不能聚集在線粒體基質(zhì)中，單體JC-1 被490 nm 波長激發(fā)光激發(fā)后發(fā)出綠光，采用Image J 軟件統(tǒng)計紅色和綠色熒光強度，以紅色和綠色熒光的比值表示線粒體膜電位的變化。

2.6 Western blot 法檢測細(xì)胞 Bax、Bcl-2、cleavedcaspase9、cytochrome c 蛋白表達 Siha 細(xì)胞以每皿3.0×106個的密度接種至培養(yǎng)皿中，貼壁后分別用0、5、7.5、10 μmol/L 松油烯-4-醇及10 μmol/L 順鉑處理細(xì)胞24 h，收集各組細(xì)胞并提取總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后孵育一抗、二抗，化學(xué)發(fā)光試劑（ECL） 顯影，采用Image J 軟件進行灰度分析。

2.7 RT-qPCR 法檢測細(xì)胞Bax、caspase9、cytochromec、HPVE6/E7 mRNA 表達 TRIzol 試劑提取Siha 細(xì)胞中RNA，使用cDNA 合成試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進行RT-qPCR 分析，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 松油烯-4-醇對Siha 細(xì)胞形態(tài)變化的影響 各濃度松油烯-4-醇、10 μmol/L 順鉑處理Siha 細(xì)胞后，細(xì)胞變小變圓，細(xì)胞質(zhì)濃縮、形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞間距離增加，出現(xiàn)很多漂浮細(xì)胞，培養(yǎng)基中出現(xiàn)細(xì)胞碎片，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)變化（×200）

3.2 松油烯-4-醇對Siha 細(xì)胞增殖率的影響 與對照組比較，各濃度松油烯-4-醇組、10 μmol/L 順鉑組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈劑量依賴性； 與10 μmol/L 順鉑組比較，10 μmol/L 松油烯-4-醇組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組細(xì)胞相對增殖率變化（±s，n＝6）

3.3 松油烯-4-醇對Siha 細(xì)胞凋亡的影響

3.3.1 流式細(xì)胞術(shù) 與對照組比較，各濃度松油烯-4-醇組、10 μmol/L 順鉑組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈劑量依賴性； 與10 μmol/L 順鉑組比較，10 μmol/L松油烯-4-醇組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組細(xì)胞凋亡率變化（±s，n＝3）

3.3.2 TUNEL 染色 與對照組比較，各濃度松油烯-4-醇組、10 μmol/L 順鉑組凋亡細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈劑量依賴性； 與10 μmol/L 順鉑組比較，10 μmol/L松油烯-4-醇組凋亡細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組凋亡細(xì)胞數(shù)變化（±s，n＝3）

3.4 松油烯-4-醇對Siha 細(xì)胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位偏高的對照組細(xì)胞發(fā)出強烈的紅色熒光，隨著松油烯-4-醇濃度增加，紅色熒光逐漸減弱，而綠色熒光逐漸增加，10 μmol/L 順鉑組細(xì)胞膜上仍可見大量紅色熒光。與對照組比較，各濃度松油烯-4-醇組、10 μmol/L 順鉑組線粒體膜電位降低（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈劑量依賴性； 與10 μmol/L 順鉑組比較，10 μmol/L 松油烯-4-醇組線粒體膜電位降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組細(xì)胞線粒體膜電位變化（±s，n＝3）

3.5 松油烯-4-醇對Siha 細(xì)胞Bax、caspase9、cytochromec、HPVE6、HPVE7 mRNA 表達的影響 與對照組比較，各濃度松油烯-4-醇組、10 μmol/L 順鉑組HPVE6/E7 mRNA 表達降低（P＜0.05），Bax、caspase9、cytochromecmRNA 表達升高（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈劑量依賴性；與10 μmol/L 順鉑組比較，10 μmol/L 松油烯-4-醇組細(xì)胞HPVE6/E7 mRNA 表達降低 （P＜0.05），Bax、caspase9、cytochromecmRNA 表達升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組細(xì)胞Bax、caspase9、cytochrome c、HPV E6、HPV E7 mRNA 表達變化（±s，n＝3）

3.6 松油烯-4-醇對 Siha 細(xì)胞 Bax、Bcl-2、cleavedcaspase9、cytochrome c 蛋白表達的影響 與對照組比較，各濃度松油烯-4-醇組、10 μmol/L 順鉑組細(xì)胞Bax、cleavedcaspase9、cytochrome c 蛋白表達升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05），并且松油烯-4-醇作用呈劑量依賴性； 與10 μmol/L 順鉑組比較，10 μmol/L 松油烯-4-醇組細(xì)胞Bax、cleaved-caspase9、cytochrome c 蛋白表達升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 各組細(xì)胞Bax、Bcl2、caspase9、cleaved-caspase9、cytochrome c 蛋白表達變化（±s，n＝3）

4 討論

松油烯-4-醇是一種從芳香植物中提取的精油［13］，主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌活性［8，10-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，松油烯-4-醇對Siha 細(xì)胞有較強的抑制作用，包括抑制細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞內(nèi)癌基因表達等。越來越多的證據(jù)表明，Bax 是宮頸癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，激活Bax可能是宮頸癌治療的新策略［14］。Bax 是Bcl-2 家族的一個關(guān)鍵促凋亡蛋白，是線粒體途徑的主要調(diào)節(jié)因子［15］，其可促進細(xì)胞凋亡［16-17］。線粒體是活細(xì)胞中產(chǎn)生能量的重要細(xì)胞器，其功能障礙與細(xì)胞凋亡、壞死和自噬有關(guān)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度松油烯-4-醇作用于Siha 細(xì)胞后，細(xì)胞變小、變圓，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞間距離增加，出現(xiàn)很多漂浮細(xì)胞，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡率及凋亡細(xì)胞數(shù)增多，Bax 蛋白和mRNA 表達均升高，Bcl-2 蛋白表達降低，并呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，提示松油烯-4-醇可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2 家族相關(guān)蛋白的表達誘導(dǎo)Siha 細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，線粒體膜電位（Δψm） 隨著松油烯-4-醇濃度增加而逐漸降低，造成線粒體功能障礙，提示線粒體參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控。線粒體膜電位的喪失總是伴隨著cytochrome c 的釋放［19］。cytochrome c 在dATP 或ATP 存在的情況下直接激活A(yù)paf-1，并誘導(dǎo)形成名為“凋亡小體”的多聚體復(fù)合物，該復(fù)合物介導(dǎo)了啟動子caspase-9 的激活［20-21］。本研究結(jié)果顯示，caspase9 蛋白表達沒有明顯變化，但cleaved-caspase9、cytochrome c 蛋白和mRNA 表達均升高，提示松油烯-4-醇可能啟動線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡途徑，導(dǎo)致線粒體功能障礙，線粒體膜電位降低，釋放大量cytochrome c，同時激活caspase-9，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

大約5%的宮頸癌與人乳頭瘤病毒感染有關(guān)，幾乎所有宮頸癌病例都可歸因于高危HPV 感染［22］。大多數(shù)HPV 感染是無害和自發(fā)清除的，但持續(xù)的高危HPV 感染（特別是16 型和18 型） 可導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生［23-25］。高危乳頭狀瘤病毒有2 種癌基因，即病毒E6 和E7 基因，HPVE6/E7 癌基因的表達對HPV 的轉(zhuǎn)化活性至關(guān)重要，可以影響細(xì)胞mRNA 的合成，因此深入了解HPVE6/E7 癌基因的表達具有重要作用［26］。本研究表明，松油烯-4-醇可降低細(xì)胞內(nèi)HPVE6/E7 mRNA 表達，可能通過抑制細(xì)胞內(nèi)相關(guān)癌基因的表達從而起到抑制宮頸癌的作用。

綜上所述，松油烯-4-醇具有較強的抗腫瘤細(xì)胞作用，可抑制Siha 細(xì)胞增殖，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，升高凋亡相關(guān)蛋白Bax、cytochrome c、cleaved-caspase9 的表達，降低Bcl-2 的表達，同時降低HPVE6/E7 癌基因的表達。本研究為臨床開發(fā)中藥治療宮頸癌提供了實驗依據(jù)，有望為臨床治療宮頸癌提供有效藥物。