張文將，段麗芳，孟 濤，李 鑫，楊冬梨，劉圓月

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046； 2.益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南 益陽 413000；3.湖南省白沙溪茶廠股份有限公司，湖南 安化 413500）

非酒精性脂肪肝 （nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 為慢性進(jìn)行性肝臟疾病，我國NAFLD 患病率高達(dá)29.2%，已經(jīng)逐漸超越病毒性肝炎，成為我國第一大肝病，該病可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，同時(shí)NAFLD 的長期存在增加了動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS） 和2 型糖尿病罹患風(fēng)險(xiǎn)，且中晚期很難逆轉(zhuǎn)，因此早期防治尤為關(guān)鍵［1-3］?！岸未驌簟?學(xué)說無法解釋NAFLD 形成的復(fù)雜機(jī)制，“多重平行打擊” 學(xué)說認(rèn)為慢性、持續(xù)性、低度非感染性炎癥反應(yīng)為NAFLD 發(fā)展過程中的一個(gè)重要病理特征［4］。有研究證實(shí)長期高脂飲食可破壞腸黏膜屏障功能，大量內(nèi)毒素隨門靜脈入血進(jìn)入肝臟，激活肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝庫普弗細(xì)胞上的Toll 樣受體4 （Toll-like receptor 4，TLR4） /髓樣分化因子88 （myeloid differentiation factor88，MyD88） /核因子Kappa B （nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路，引起肝臟炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的發(fā)生，促使脂質(zhì)在肝臟的沉積，從而為NAFLD 的發(fā)生創(chuàng)造條件［5］。

NAFLD 防治尚無特效藥物，抗氧化劑的應(yīng)用為防治NAFLD 提供新思路。茯磚茶屬于黑茶類，除了具有抗氧化作用的茶多糖及茶多酚外，在發(fā)酵過程中形成了冠突散囊菌屬等優(yōu)勢益生菌，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有應(yīng)用潛力的微生物［6-7］。課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)茯磚茶可通過抑制甘油三酯合成，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，抑制肥胖和AS 形成，降低肝重及肝指數(shù)，但是深入機(jī)制尚不明確［8］。因此，本研究通過高脂飲食連續(xù)喂養(yǎng)載脂蛋白E 敲除 （apolipoprotein E，ApoE-/-） 小鼠4 個(gè)月的方法復(fù)制NAFLD 模型，同時(shí)予以茯磚茶灌胃干預(yù)，檢測TLR4/MyD88/NF-κB 通路上的關(guān)鍵因子的基因表達(dá)變化，以期為NAFLD 的早期防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 50 只8 周齡SPF 級雄性ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量（20±5） g，品系名ApoE Cas9-KO，遺傳背景C57BL/6； 10只8 周齡C57BL/6J 雄性野生型小鼠，購于南京大學(xué)生物模式中心［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （蘇） 2015-0001］。小鼠飼養(yǎng)于SPF 實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)IVC 獨(dú)立送風(fēng)隔離籠，儀器壓差20 Pa，相對濕度50% ～70%，溫度（24±0.5）℃，晝夜光照節(jié)律，每籠5 只，各組小鼠定量喂養(yǎng)，自由飲水（Ⅲ級水），每2 d 更換1 次墊料，籠具及水瓶定期消毒。ApoE-/-小鼠采用高脂輻照飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇，貨號H10141，北京華阜康生物科技股份有限公司） 喂養(yǎng)，飼料于-20 ℃下保存，取需用量于4 ℃冰箱中短期保存。

1.2 藥物 2014 年茯磚茶（湖南省白沙溪茶廠），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉柏炎教授鑒定原料為茶葉一級嫩料壓筑而成，色澤黑褐，金花茂盛。阿托伐他?。ㄝx瑞制藥有限公司，批號110590）。

1.3 試劑 TRIzol 試劑 （美國Invitrogen 公司，批號50175111）； 熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號A152172A）； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （美國 Thermo Fisher Scientific 公司，批號00692424）。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。

1.4 儀器 Z32HK 型高速冷凍離心機(jī)（德國Hermle 公司）； BX-51 型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）； 核酸蛋白濃度測定儀（英國Bio-Drop 公司）； PCR 擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad 公司）； 熒光定量PCR 儀（德國Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 茯磚茶掰成分散片狀后用無菌紗布包裹投入無菌燒杯中，加入實(shí)驗(yàn)用Ⅲ級水浸泡30 min （加水量沒過茶葉2～3 cm），武火煮開后文火煎煮30 min，藥液冷卻后過濾，取汁； 二次煎煮加水量以淹沒藥包為準(zhǔn)，沸騰后冷卻，將2 次濾液合并，濃縮至所需體積，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫罁?jù)茶吸收實(shí)驗(yàn)推薦成人每日攝入量為10 g （166.7 mg/kg），參照人與小鼠體表面積換算得小鼠所需劑量為1.44 g/kg［9］，設(shè)置茯磚茶高、中、低劑量分別為2.16、1.44、0.72 g/kg。阿托伐他汀使用前將藥片放入干凈研缽中碾碎，加入生理鹽水溶解，攪拌成混懸液，按10 mg/kg劑量進(jìn)行灌胃，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 分組、造模與給藥 將50 只8 周齡雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為模型組（10 mL/kg 生理鹽水）、阿托伐他汀組（10 mg/kg） 和茯磚茶高、中、低劑量組（2.16、1.44、0.72 g/kg），每組10 只，定量予以高脂飼料喂養(yǎng)； 另設(shè)同周齡雄性C57BL/6J 小鼠10 只作為空白組，定量予以普通維持飼料喂養(yǎng)。各組小鼠于每天早上9 點(diǎn)予以相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃干預(yù)17 周［10-11］。

2.3 標(biāo)本收集與處理 各組小鼠給藥第17 周末禁食不禁水12 h，麻醉后摘眼球取血，全血室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取血清于-80 ℃冰箱中保存待測。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟稱重，預(yù)冷生理鹽水漂洗，取各組小鼠相同部位肝葉（約1 cm×1 cm×1 cm） 于4%多聚甲醛中固定，用于HE 染色； 取約100 mg 肝組織于盛有1 mL 預(yù)冷TRIzol 的無RNA 酶凍存管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，用于RT-qPCR 檢測。

2.4 HE 染色觀察肝組織病理形態(tài) 肝組織于4 ℃、4%多聚甲醛中固定48 h，經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、4 μm 切片、烤片、染色后封片，于顯微鏡下觀察。按照《NASH 臨床研究網(wǎng)病理工作指南》 對NAFLD 活動度積分 （NAFLD activity score，NAS） 進(jìn)行半定量分析［12］，具體評判標(biāo)準(zhǔn)為①肝細(xì)胞脂肪變，0 分（＜5%），1 分（5% ～33%），2 分（34% ～66%），3 分（＞66%）； ②小葉內(nèi)炎癥（20 倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶），0 分（無），1 分（＞2 個(gè)），2 分（2 ～4 個(gè)），3 分（＞4 個(gè)）； ③肝細(xì)胞氣球樣變，0 分（無），1 分（少見），2 分（多見）。

2.5 RT-qPCR 法檢測肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達(dá) TRIzol 法提取肝組織總RNA，采用核酸蛋白濃度測定儀測定RNA 濃度和質(zhì)量，按試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃，60 min；70 ℃，5 min； 4 ℃維持。隨后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，循環(huán)40 次。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA 相對表達(dá)，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 茯磚茶對小鼠肝組織病理形態(tài)的影響

3.1.1 肉眼觀察 如圖1 所示，空白組小鼠肝臟大小適中，暗紅色，邊緣銳利； 模型組小鼠肝臟體積增大，黃色油膩感，邊緣較鈍； 茯磚茶高劑量組小鼠肝臟稍大，暗紅為主，色稍黃，邊緣稍鈍； 茯磚茶中劑量組小鼠肝臟體積適中，顏色暗紅，邊緣銳利； 茯磚茶低劑量組小鼠肝臟體積增大，顏色黃色油膩感，邊緣變鈍； 阿托伐他汀組小鼠肝臟體積變大，黃色油膩感，邊緣鈍。

圖1 各組小鼠肝臟肉眼觀察

3.1.2 HE 染色鏡觀察 如圖2 所示，空白組低倍鏡下肝小葉輪廓清晰，中央靜脈居中，肝索放射狀分布，肝血竇清晰； 高倍鏡下肝細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞核居中，胞質(zhì)均質(zhì)紅染。模型組低倍鏡下肝小葉輪廓模糊，肝索非放射狀排列，肝血竇不清； 高倍鏡下肝細(xì)胞體積變大，大小不一，界限不清，胞漿疏松化，有大量的空泡形成。茯磚茶高劑量組低倍鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈居中，部分細(xì)胞核偏位，胞漿淡染疏松化； 高倍鏡下肝細(xì)胞大小較均勻，細(xì)胞核居中，胞漿淡染，部分胞漿有少量空泡形成。茯磚茶中劑量組低倍鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈居中，肝索呈放射狀，肝血竇較為清晰； 高倍鏡下細(xì)胞核居中、胞漿淡染疏松化，有部分體積較小空泡形成。茯磚茶低劑量組低倍鏡下肝小葉輪廓及肝血竇欠清晰； 高倍鏡下可見大量的空泡變性。阿托伐他汀組低倍鏡下肝小葉輪廓及肝血竇紋理欠清晰； 高倍鏡下可見胞漿淡染疏松化、細(xì)胞核偏位，存在大小不等的空泡形成。

圖2 各組小鼠肝組織HE 染色

3.1.3 NAS 評分 與空白組比較，模型組小鼠肝臟NAS 評分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，阿托伐他汀組和茯磚茶各劑量組小鼠肝臟NAS 評分降低（P＜0.05）； 與阿托伐他汀組比較，茯磚茶各劑量組小鼠肝臟NAS 評分降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠肝臟NAS 評分比較（±s，n＝10）

表2 各組小鼠肝臟NAS 評分比較（±s，n＝10）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05。

組別NAS 評分/分空白組0.00±0.00模型組6.72±0.49*阿托伐他汀組4.43±0.52＃茯磚茶高劑量組3.24±0.42?！鬈虼u茶中劑量組2.92±0.57?！鬈虼u茶低劑量組3.82±0.42＃△

3.2 茯磚茶對TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關(guān)因子mRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿托伐他汀組和茯磚茶各劑量組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）； 與阿托伐他汀組比較，茯磚茶高、中劑量組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、FASmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），茯磚茶高劑量組小鼠肝組織IL-1βmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FAS mRNA 表達(dá)比較（±s，n＝10）

表3 各組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FAS mRNA 表達(dá)比較（±s，n＝10）

注： 與空白組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與阿托伐他汀組比較，△P＜0.05。

組別TLR4MyD88NF-κBIL-1βFAS空白組1.00±0.071.09±0.071.12±0.181.06±0.121.01±0.13模型組5.64±0.80*2.05±0.16*2.00±0.27*3.04±0.84*3.74±0.49*阿托伐他汀組3.55±0.45＃1.58±0.26＃1.60±0.20＃1.37±0.38＃2.32±0.44＃茯磚茶高劑量組1.96±0.54?！?.35±0.12?！?.34±0.28＃△1.14±0.17?！?.42±0.20?！鬈虼u茶中劑量組1.82±0.41?！?.32±0.10?！?.27±0.30＃△1.44±0.27＃1.21±0.19?！鬈虼u茶低劑量組2.96±0.36＃△1.70±0.08＃1.58±0.34＃1.73±0.28?！?.26±0.65＃

4 討論

近年來提出的“腸-肝軸” 理論認(rèn)為，腸道菌群失調(diào)在NAFLD 的形成中發(fā)揮著重要作用［13］。研究顯示，NAFLD患者比正常人群更容易出現(xiàn)小腸細(xì)菌過度生長，導(dǎo)致富有脂多糖 （Lipopolysaccharide，LPS） 成分的細(xì)菌含量升高［14］。腸道內(nèi)毒素通過門脈系統(tǒng)到達(dá)肝臟，被肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的TLR4或者Kupffer 細(xì)胞所識別［15-16］。LPS 激活TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路后促使大量炎癥因子的釋放，造成肝細(xì)胞的損傷［17］。通過阻斷TLR4通路來抑制炎癥反應(yīng)，已經(jīng)成為了干預(yù)肝臟疾病的有效途徑之一［18］。

課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，茯磚茶預(yù)防性灌胃給藥可減輕NAFLD 小鼠肝臟氧化損傷［19］，降低血清IL-1β、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 等炎癥因子表達(dá)［8］，由此證實(shí)NAFLD 模型小鼠確實(shí)存在慢性非感染性炎癥現(xiàn)象，而茯磚茶灌胃給藥可以起到抑制炎癥反應(yīng)的效果，但其抗炎機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，茯磚茶各劑量組和阿托伐他汀組預(yù)防性灌胃給藥均可抑制小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達(dá)，其中茯磚茶高、中劑量組抑制效果優(yōu)于低劑量組和阿托伐他汀組，由此可見適當(dāng)濃度茯磚茶預(yù)防性灌胃給藥發(fā)揮著較好預(yù)防NAFLD 形成效果。阿托伐他汀為臨床抑制膽固醇合成常用降脂藥物，在本實(shí)驗(yàn)中雖可抑制NAFLD 形成，但其效果不如茯磚茶高、中劑量組，考慮可能是研究過程中阿托伐他汀所用劑量并非治療最佳劑量所致。FAS 為催化乙酰輔酶A 和丙二酸單酰輔酶A 合成脂肪酸的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)量的增加會導(dǎo)致甘油三酯在體內(nèi)的蓄積，由此可見FAS 系統(tǒng)在NAFLD 的發(fā)生與發(fā)展中起到關(guān)鍵作用［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝臟FAS基因表達(dá)和肝臟脂肪變性程度呈正相關(guān)，由此可見茯磚茶預(yù)防性灌胃給藥可抑制肝臟脂類物質(zhì)的合成，從而達(dá)到了延緩肝脂變的效果。

茯磚茶作為一種后發(fā)酵茶，有報(bào)道顯示茯磚茶水提物可明顯恢復(fù)高脂飲食小鼠引起的厚壁菌門/擬桿菌門比值的升高，提高雙歧桿菌科細(xì)菌的相對豐度［21］。茯磚茶中的冠突散囊菌增加了小鼠腸道中產(chǎn)生乙酸和丁酸的細(xì)菌，可以部分逆轉(zhuǎn)高脂飲食小鼠腸道菌群失調(diào)［22］。由此可見對腸道菌群失衡的調(diào)節(jié)可能是茯磚茶發(fā)揮作用的重要因素，但茯磚茶是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群而抑制肝臟TLR4/MyD88/NF-κB 通路激活尚不明確，后續(xù)將完善通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)，并配合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對該通路進(jìn)一步驗(yàn)證。