張艷慧，董亞娜，談秀鳳

（1.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450063； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

金絲桃苷是普遍存在于金絲桃科、藤黃科、桔?？?、杜鵑花科、豆科植物中的一種黃酮醇苷類化合物［1］，具有抑制痛經(jīng)、抗抑郁、抗炎、心腦血管保護(hù)、抗血栓、抗急性肝損傷等作用［1］，并且在婦科腫瘤方面中的應(yīng)用也較多，可用于治療卵巢功能不全、卵巢癌、子宮癌等［1-3］，但其水溶性差［4］，體外溶出度低［5］，口服吸收生物利用度僅為10%左右［6］，導(dǎo)致藥理作用無法充分發(fā)揮。前期報(bào)道，F(xiàn)eng 等［7］制備了金絲桃苷脂質(zhì)體，但工藝復(fù)雜； Shen 等［8］制備了金絲桃苷納米混懸劑，但粒徑達(dá)384 nm，可能會(huì)限制其生物利用度提高程度［9］。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體具有較高的包封率、載藥量，可有效提高生物利用度、藥效［10-13］，是制劑學(xué)領(lǐng)域研究的熱門技術(shù)之一。因此，本實(shí)驗(yàn)制備金絲桃苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為相關(guān)制劑學(xué)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 BSA224S 型電子天平（德國Sartorius 公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器、溫控進(jìn)樣盤（美國Agilent 公司）； JP-060S 型超聲儀（深圳市明望科技有限公司）； Alpha 1-4 型真空冷凍干燥機(jī)（北京博勱行儀器有限公司）； Nano-ZS90 型粒度分析儀 （英國Malvern Panalytical 儀器有限公司）； HJ-4A 型恒溫磁力攪拌器（常州市凱航儀器有限公司）； D-37520 型高速離心機(jī)（德國Kendro 儀器公司）； UGC-12M 型氮?dú)獯祾邇x（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 金絲桃苷原料藥（批號(hào)20190719，純度＞90%，杭州甫洛生物科技有限公司）； 金絲桃苷對照品（批號(hào)111521-1909，純度95.4%，中國食品藥品檢定研究院）； 山崳酸甘油酯對照品（批號(hào)20190225，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 乙酰苯胺對照品（批號(hào)202004-1，純度98.2%，南京森貝伽生物科技有限公司）。Miglyol ?812 （批號(hào)20180708，北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司）； 泊洛沙姆188 （批號(hào)181118，武漢興起點(diǎn)生物科技有限公司）； 超濾離心管（截留分子量8 000～14 000 Da，美國Pall 公司）。

1.3 動(dòng)物 SD 大鼠，體質(zhì)量240～270 g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （豫） 2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備 取金絲桃苷原料藥50 mg 及處方量山崳酸甘油酯、液體脂質(zhì)Miglyol ?812，置于燒瓶中，加入10 mL 甲醇，70 ℃水浴加熱溶解，作為有機(jī)相；蒸餾水配制50 mL 泊洛沙姆188 溶液，70 ℃水浴加熱溶解，作為水相，在900 r/min 攪拌速度下將有機(jī)相滴加至水相中，持續(xù)攪拌2 h 以除盡有機(jī)溶劑，設(shè)置超聲功率為1 138 W的30%，超聲時(shí)間為20 min，置于-18 ℃冰箱中固化8 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液加蒸餾水至50 mL，即得。

2.2 金絲桃苷含量測定 采用HPLC 法。

2.2.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）； 流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸（20 ∶80）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長360 nm。

2.2.2 線性關(guān)系考察 取金絲桃苷對照品10 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得200 μg/mL 貯備液，流動(dòng)相依次稀釋至40.0、20.0、5.0、1.0、0.1、0.05 μg/mL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積 （Y） 對質(zhì)量濃度 （X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝16.341 8X＋0.627 5 （r＝0.999 6），在0.05～40.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品溶液制備 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加8 mL 甲醇超聲處理以破壞其結(jié)構(gòu)，流動(dòng)相定容至刻度，取1 mL 至10 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液1 mL，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得金絲桃苷含量RSD為1.41%，表明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液適量，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得金絲桃苷含量RSD 為0.45%，表明儀器精密度良好。取供試品溶液適量，于0、4、8、12、16、24 h 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得金絲桃苷含量RSD 為1.07%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液1 mL，共9 份，置于9 個(gè)10 mL 量瓶中，分成低、中、高3 組，分別加入200 μg/mL 貯備液0.8、1.2、1.6 mL，加8 mL 甲醇超聲處理以破壞其結(jié)構(gòu)，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得金絲桃苷平均加樣回收率分別為100.67%、98.96%、100.09%，RSD 分別為1.82%、1.53%、1.46%。

2.3 包封率、載藥量測定 先計(jì)算金絲桃苷總含量（m總）。再取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液1 mL，置于超濾管（截留分子量8 000 ～14 000 Da） 中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，溫度為4 ℃，時(shí)間為30 min，取續(xù)濾液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算游離藥量（m游離）。包封率、載藥量計(jì)算公式分別為載藥量＝ ［（m總-m游離） /（m總＋m納米粒）］ ×100%、包封率＝ ［（m總-m游離） /m總］ ×100%，其中m納米粒為納米?？傎|(zhì)量。

2.4 粒徑、Zeta 電位測定 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液0.5 mL，蒸餾水稀釋20 倍，取適量在粒度分析儀上測定粒徑、多分散系數(shù)（PDI）、Zeta 電位。

2.5 處方優(yōu)化 采用Box-Behnken 響應(yīng)面法。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定投藥量50 mg，以固態(tài)脂質(zhì)用量（X1）、液態(tài)脂質(zhì)用量（X2）、表面活性劑（泊洛沙姆188） 濃度 （X3） 為影響因素，包封率 （Y1）、載藥量（Y2）、粒徑（Y3） 為評價(jià)指標(biāo)，Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化處方，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

響應(yīng)面分析見圖1。由此可知，在一定范圍內(nèi)固態(tài)脂質(zhì)用量、液態(tài)脂質(zhì)用量增加可使包封率升高，但隨著前者用量增加載藥量呈先升后降的趨勢，而后者對其影響較復(fù)雜； 表面活性劑用量對包封率、載藥量的影響均為先升后降； 隨著固態(tài)脂質(zhì)用量增加粒徑呈現(xiàn)先降后升的趨勢，而液態(tài)脂質(zhì)用量對其影響不大； 隨著表面活性劑增加粒徑先降后升，并且液態(tài)脂質(zhì)用量對其影響較??； 隨著表面活性劑、固態(tài)脂質(zhì)用量增加粒徑先降后升。

圖1 各因素響應(yīng)面圖

最終確定，最優(yōu)處方為固態(tài)脂質(zhì)用量1 015.59 mg，液態(tài)脂質(zhì)用量269.41 mg，表面活性劑濃度1.12%，包封率為91.74%，載藥量為3.48%，粒徑為158.14 nm，為便于實(shí)際操作，將其修正為固態(tài)脂質(zhì)用量1 015 mg，液態(tài)脂質(zhì)用量270 mg，表面活性劑濃度1.1%。按優(yōu)化處方平行制備3批樣品（圖2），測得平均包封率為89.92%，載藥量為3.37%，粒徑為162.56 nm （圖3），后兩者與預(yù)測值3.48%、158.14 nm 較接近，同時(shí)平均Zeta 電位為-34.28 mV （圖4）。

圖2 金絲桃苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體外觀

圖3 金絲桃苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑分布

圖4 金絲桃苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體Zeta 電位

2.6 凍干粉制備 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液適量，加入5%凍干保護(hù)劑甘露醇，振蕩混勻，在-30 ℃下預(yù)凍3 d，置于冷凍干燥儀（冷阱值-50 ℃） 中，抽真空（0.1 MPa）1 d，即得 （圖5）。經(jīng)測定，其復(fù)溶后平均包封率為81.14%，平均粒徑為217.43 nm，Zeta 電位為-31.48 mV。

圖5 金絲桃苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凍干粉外觀

2.7 體外釋藥研究 取金絲桃苷及其納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凍干粉適量（金絲桃苷含量均為40 mg），空白介質(zhì)制成混懸液，轉(zhuǎn)移至活化透析袋中，手術(shù)線將兩端封口。以脫氣后的蒸餾水為釋藥介質(zhì)，于設(shè)定取樣點(diǎn)各取樣5 mL 后立即補(bǔ)加同體積空白介質(zhì)，8 000 r/min 離心15 min，取上清液，測定累積釋放度，結(jié)果見圖6。由此可知，原料藥在前6 h釋藥較快，累積釋放度為21.96%，之后程度趨緩，48 h 內(nèi)累積釋放度僅為33.71%； 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在前8 h 釋放較快，累積釋放度為44.90%，之后緩慢升高，48 h 內(nèi)累積釋放度為71.77%。

圖6 金絲桃苷體外釋藥曲線（±s，n＝6）

2.8 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.8.1 血漿樣品處理 參考文獻(xiàn)［14］ 報(bào)道，取200 μL解凍后血漿樣品，加入20 μL 內(nèi)標(biāo) （乙酰苯胺） 溶液（1 000 ng/mL）、500 μL 乙腈［15］，渦旋60 s，4 ℃、8 500 r/min 離心10 min，取上層溶液，45 ℃氮?dú)饩徛蹈傻脷堅(jiān)?00 μL 乙腈復(fù)溶，4 ℃、8 500 r/min 離心5 min。

2.8.2 線性關(guān)系考察 取適量對照品溶液，45 ℃氮?dú)饩徛蹈?，空白血漿依次稀釋至3 000、1 500、1 000、500、100、50 ng/mL，即得血漿對照品溶液，按“2.8.1” 項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積（Y） 對質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝0.137 2X-10.11 （r＝0.992 6），在50～3 000 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.3 方法學(xué)考察 取50、1 000、3 000 ng/mL 血漿對照品溶液適量，同一天內(nèi)在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得金絲桃苷含量RSD 分別為9.61%、5.27%、6.14%，表明該方法日內(nèi)精密度良好； 于0、1、2、3、4、6 d 同法各測定6 次，測得金絲桃苷含量RSD 分別為9.66、4.10%、6.43%，表明該方法日間精密度良好。取灌胃給藥1 h 后血漿樣品適量，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得金絲桃苷含量RSD 為9.06%，表明樣品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取50、1 000、3 000 ng/mL血漿對照品溶液適量，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得金絲桃苷平均加樣回收率分別為89.21%、93.69%、91.74%，RSD 分別為5.37%、8.04%、7.69%。

2.8.4 分組、造模與給藥 取金絲桃苷及其納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凍干粉適量，加入0.5%CMC-Na 溶液（金絲桃苷質(zhì)量濃度均為5 mg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配） 制成灌胃液。12 只大鼠隨機(jī)分為2 組，每組6 只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，以40 mg/kg 劑量給藥，于0.5、1、2、3、4、4.5、5、6、8、10、12 h 眼眶后靜脈叢取血，置于肝素化離心管中，振蕩混勻，3 000 r/min 離心3 min，取上層血漿，密封后冷凍保存。

2.8.5 結(jié)果分析 血藥濃度-時(shí)間曲線見圖7，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4。由此可知，與原料藥比較，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體tmax、t1/2延長 （P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對生物利用度增加至3.19 倍。

圖7 金絲桃苷血藥濃度-時(shí)間曲線（±s，n＝6）

表4 金絲桃苷主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）

表4 金絲桃苷主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）

注： 與金絲桃苷比較，**P＜0.01。

參數(shù)單位金絲桃苷金絲桃苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體tmaxh1.89±0.333.08±0.52**t1/2h4.90±0.616.74±0.93**Cmaxμg·L-1 1 191.07±155.832 446.35±306.43**AUC0～t μg·L-1·h 4 354.19±628.67 13 897.32±1 688.71**AUC0～∞ μg·L-1·h 5 038.22±689.71 14 906.46±1 846.64**

3 討論

對于納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體而言，包封率、載藥量、粒徑是最主要的指標(biāo)，包封率較高時(shí)載藥量可能較低，后者較高時(shí)前者亦然，故僅選擇1 ～2 個(gè)指標(biāo)來優(yōu)化處方并不全面［11］。另外，制劑粒徑也會(huì)影響口服吸收生物利用度［16］，由于本實(shí)驗(yàn)希望得到200 nm 粒徑以下納米制劑，故需同時(shí)考慮包封率、載藥量、粒徑這3 個(gè)指標(biāo)。另外，正交試驗(yàn)優(yōu)化處方時(shí)精確度較差，重復(fù)性可能存在問題［17］； Box-Behnken 響應(yīng)面法精確度較高，可全面研究幾種因素的交互作用，重復(fù)性較高，故本實(shí)驗(yàn)采用該方法進(jìn)行處方優(yōu)化。

前期報(bào)道，金絲桃苷臨床用量為90 mg［18］，故成人用藥劑量為1.5 mg/kg （平均體質(zhì)量以60 kg 計(jì)），折換成大鼠等效劑量為9.45 mg/kg （大鼠與人等效劑量比為6.3［19］），但受到檢測條件的限制，目前藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)中所用劑量高于人體實(shí)際劑量［19］。另外，大鼠給藥劑量為175 mg/kg時(shí)無明顯毒副作用［20］，結(jié)合實(shí)際條件，本實(shí)驗(yàn)選擇40 mg/kg劑量來考察金絲桃苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)。

結(jié)果顯示，金絲桃苷納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體tmax延長，Cmax、口服生物利用度升高，可能是由于胃腸道對納米粒黏附性的影響，以及藥物從納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體釋放出來需要克服的屏障較多，并且納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體使原料藥比表面積激增，從而促進(jìn)其溶出；t1/2延長，表明體內(nèi)循環(huán)時(shí)間增加；原料藥與胃腸道接觸面積增加，有助于其經(jīng)胞間、淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)等進(jìn)入血液循環(huán)［21-22］； 相對生物利用度增加至3.19 倍，高于Shen 等［8］報(bào)道（增加210.63%）。但藥物口服吸收是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，制劑在胃腸道中的穩(wěn)定性（粒徑增大、藥物泄露等）、胃腸道黏膜上黏蛋白的排斥作用等因素均會(huì)影響生物利用度提高程度，尚需進(jìn)一步研究。