杜偉鋒，趙明方，湯璐璐，洪 浩，葛衛(wèi)紅，李昌煜，張葉峰

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311402； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心，浙江 杭州 311401； 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片有限公司，浙江 杭州 311401； 4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，浙江 杭州 310053； 5.寧波市中藥飲片有限公司，浙江 寧波 315336）

延胡索為罌粟殼紫堇堿植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖，具有活血、行氣、止痛功效［1］。臨床常用于治療脘腹疼痛、胸痹心痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后淤阻等癥［2］。延胡索始載于《本草拾遺》［3］，主產(chǎn)于浙江東陽、磐安、永康等地，陜西、安徽等地也有栽培［4］。其有效成分為季胺類、叔胺類生物堿，另外還含有糖類、淀粉、氨基酸等［5-9］。生延胡索生物堿成分難溶于水，溶出率較低，臨床藥效不顯著，經(jīng)醋炙后，醋酸與生物堿形成可溶性醋酸鹽，有利于煎煮時溶出，療效增強［10-12］。

外觀顏色的差異常常反映著藥材質(zhì)量的不同，而且與藥材內(nèi)在物質(zhì)成分含量也有密不可分的關(guān)系［13-15］。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，色差儀、電子鼻等表征識別設(shè)備被越來越多的應(yīng)用到中藥材鑒別中［16-17］。色差計是通過模擬人眼視覺系統(tǒng)，結(jié)合儀器內(nèi)部的模擬積分光學(xué)系統(tǒng)，得到L*、a*、b*［18-19］，L*為亮度值，L*值越大，飲片色澤越白； a*表示紅綠色度，a*值越大，飲片顏色越紅，反之越綠； b*表示黃藍(lán)色度，b*值越大，飲片顏色越黃，反之越藍(lán)［20］。

本實驗對醋延胡索炮制不同時間點的色度值L*、a*、b*及原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素含量進(jìn)行檢測，分析醋延胡索外觀顏色與其化學(xué)成分的相關(guān)性，建立以量化顏色快速評價醋延胡索炮制程度的方法，以期為醋延胡索炮制過程的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 U3000 型高效液相色譜儀 （美國Thermo Fisher 公司）； NT-xs105 型、ME-204E 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； DFD-700型電熱恒溫水浴鍋 （天津市泰斯特儀器有限公司）； CGY-750H 型自控溫鼓式炒藥機（杭州海善制藥設(shè)備股份有限公司）； CM-5 型分光測色儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）； EOS-50D 型數(shù)碼單反相機（日本佳能公司）； MIL-SYN 型超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑 原阿片堿 （純度99.6%，批號110853-201805）、鹽酸小檗堿（純度86.7%，批號110713-201814）、鹽酸巴馬汀（純度85.7%，批號110732-201913）、延胡索乙素（純度99.9%，批號110726-201819） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 四氫小檗堿對照品 （純度98%，批號190144-201907） 購自上海鴻永生物科技有限公司；去氫紫堇堿（純度95%，批號30045-16-0）、延胡索甲素（純度95%，批號518-69-4） 對照品均購自上海朗昭科技有限公司。

1.3 藥材 3 批生延胡索飲片分別購自安徽省、山東省、陜西省中藥飲片有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心葛衛(wèi)紅教授鑒定為正品。3 批醋延胡索飲片由對應(yīng)生品按浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片有限公司生產(chǎn)工藝炮制而成。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋制品制備 取生品適量，淋入米醋（每100 kg 生品用20 kg 米醋） 攪拌均勻，按醋炙法炒制（溫度為170～180 ℃，以30 kg 為一鍋，炒制時間為10～15 min），取出放涼。因本實驗需包含炮制不及、炮制太過樣品，故將炮制時間延長至30 min，每1 min 取樣1 次，每次500 g 左右，打粉，過5 號篩，結(jié)果見圖1。由此可知，生品呈明黃色，炮制不及樣品呈棕褐色，醋制品呈黑色，炮制太過樣品呈紅棕色。

圖1 延胡索飲片圖Fig.1 Images of Corydalis Rhizoma decoction pieces

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取延胡索甲素、原阿片堿、鹽酸小檗堿、四氫小檗堿、延胡索乙素、鹽酸巴馬汀、去氫紫堇堿對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為117.2、104.9、117.9、124.0、107.6、115.8、109.1 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 取延胡索粉末（過3 號篩）約0.5 g，精密稱定，置于平底燒瓶中，精密加入濃氨試液-甲醇（1 ∶20） 混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，冷浸1 h 后加熱回流提取1 h，放冷，混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取25 mL續(xù)濾液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 Agilent ZORBAX-Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相0.6%乙酸（三乙胺調(diào)pH 至5.0）（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0～22 min，17% ～22%B； 22～30 min，22% ～30%B； 30～50 min，30% ～50%B； 50 ～75 min，50% ～80%B）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測波長280 nm。色譜圖見圖2。

圖2 生延胡索（S1）、醋延胡索（S2）、對照品（S3）HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of raw Corydalis Rhizoma（S1），vinegar-processed Corydalis Rhizoma （S2）and reference substance （S3）

2.4 線性關(guān)系考察 分別取對照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL，置于1 mL 量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，得到系列質(zhì)量濃度，在“2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各生物堿在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各生物堿線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various alkaloids

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，在“2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素峰面積 RSD 分別為 1.64%、0.55%、0.36%、0.43%、0.46%、0.95%、0.56%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取延胡索（產(chǎn)地陜西） 粉末適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、5、10、15、20、25 h 在“2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素峰面積 RSD 分別為 1.00%、0.61%、1.50%、0.72%、1.65%、1.73%、0.68%，表明溶液在25 h 穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取延胡索（產(chǎn)地陜西） 粉末適量，按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素峰面積RSD分別為0.39%、0.43%、1.12%、0.67%、0.69%、0.84%、0.87%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 稱取各成分含量已知的延胡索粉末6 份，每份0.5 g，按1 ∶1 比例精密加入各對照品，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、去氫紫堇堿、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素平均加樣回收率分別為99.77%、101.24%、100.73%、99.83%、100.13%、98.35%、100.71%，RSD 均小于2%。

2.9 樣品含量測定 取各批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表2、圖3。由此可知，各生物堿含量在0 ～15 min 逐漸升高，15 min 后逐漸降低。

表2 各生物堿含量測定結(jié)果（%）Tab.2 Results of content determination of various alkaloids （%）

圖3 各生物堿含量變化Fig.3 Changes in contents of various alkaloids

2.10 色度值測定 取各批樣品，粉碎后過5 號篩，置于色差儀中測定L*、a*、b*，平行3 次，取平均值，計算總色度值E*ab，公式為，結(jié)果見表3、圖4。由此可知，生延胡索L*、a*、b*、E*ab 范圍分別為67.91 ～64.05、5.21 ～ 3.07、41.03 ～ 37.17、78.87～75.19，炮制不及延胡索四者分別為63.83 ～60.09、5.36 ～3.25、39.81 ～34.08、74.32 ～70.39，醋延胡索四者分別為59.61 ～56.82、6.66～4.00、36.51～33.03、29.09 ～66.27，炮制太過延胡索四者分別為60.90 ～54.00、10.72 ～7.84、34.94 ～31.22、70.04 ～63.98； L*（明光度）、b*（黃藍(lán)色度）、E*ab （總色差） 降低，a*（紅綠色度）升高，這與炮制過程中飲片由明黃色逐漸轉(zhuǎn)換成黑棕色，而炮制太過后變成棕紅色的顏色性狀變化相符。

表3 色度值測定結(jié)果Tab.3 Results of colorimetric value determination

圖4 色度值熱圖Fig.4 Heatmaps of chromatic values

2.11 相關(guān)性分析 將生延胡索-醋延胡索、醋延胡索-炮制太過這2 個階段中的生物堿含量與色度值導(dǎo)入SPSS 22.0 軟件，分析兩者相關(guān)性，結(jié)果見表4。由此可知，在生延胡索-醋延胡索過程中，L*、b*、E*ab 降低時生物堿含量升高，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)，而a*升高時生物堿含量降低，兩者呈顯著正相關(guān)； 在醋延胡索-炮制太過過程中，L*、b*、E*ab 降低時生物堿含量降低，兩者呈顯著正相關(guān)，而a*升高時生物堿含量降低，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)，即在生品-醋品炮制過程中，延胡索從黃色逐漸變紅褐色，生物堿含量升高； 在醋品-炮制太過品炮制過程中，延胡索紅褐色逐漸加深，生物堿含量降低。

表4 生物堿含量與色度值的相關(guān)性（n＝3）Tab.4 Correlations between alkaloid contents and chromatic values （n＝3）

3 討論

延胡索炮制過程是一個實時的、動態(tài)的變化過程，要實現(xiàn)質(zhì)量快速識別，則要求檢測手段具有及時、快速、無損，易于操作的優(yōu)勢。色差計內(nèi)置模擬積分光學(xué)系統(tǒng)，通過模擬人眼的視覺系統(tǒng)，可以將光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)量化，分析速度快，可實現(xiàn)在線分析，具有監(jiān)測飲片炮制過程質(zhì)量變化的理論基礎(chǔ)。

本實驗采用HPLC 法測定生物堿含量，比較其含量隨時間變化趨勢，發(fā)現(xiàn)生物堿含量隨炮制時間均呈先升高后降低的趨勢，在炮制時間為15 min時最高。采用SPSS 軟件進(jìn)行炮制過程生物堿含量與色度值相關(guān)性比較，結(jié)果顯示兩者具有顯著相關(guān)性，在炮制時間為0 ～15 min 時，色度值L*、b*、E*ab 與生物堿含量呈顯著負(fù)相關(guān)，色度值L*、b*、E*ab 值降低，生物堿含量升高； 色度值a*與生物堿含量呈顯著正相關(guān)，色度值a*升高，生物堿成分含量升高； 在炮制時間為15 ～30 min 時，色度值L*、b*、E*ab 與生物堿含量呈顯著正相關(guān)，色度值L*、b*、E*ab 降低，生物堿含量降低； 色度值a*與生物堿含量呈顯著負(fù)相關(guān)，色度值a*升高，生物堿含量降低。提示醋延胡索在炮制過程中，顏色由黃轉(zhuǎn)黑，生物堿含量升高，由黑轉(zhuǎn)紅時，生物堿含量降低。

本實驗在“辨狀論質(zhì)” 的思想指導(dǎo)下，將外觀顏色表征量化，并與醋延胡索飲片內(nèi)在成分含量相結(jié)合，使得基于顏色性狀的飲片鑒別更加客觀，醋延胡索炮制過程更加標(biāo)準(zhǔn)化，為醋延胡索炮制過程的質(zhì)量控制提供參考。