許俊申,盛天露,劉文琴,陳鐘文,劉 峰,劉 華*
(1.江西中醫(yī)藥大學藥學院,江西 南昌 330004; 2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006)
蒼耳XanthiummongolicumKitag.為菊科蒼耳屬一年生草本植物,臨床常被用于治療類風濕性關節(jié)炎、鼻炎、皰疹、癌癥等[1],其味苦、性寒,有小毒,具有散風寒、祛風濕、解毒殺蟲的功效?,F(xiàn)代研究表明,蒼耳草具有抗菌、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化等藥理活性[2]。課題組前期在美國得州大學西南醫(yī)學中心發(fā)現(xiàn),江西地產(chǎn)蒼耳草乙醇提物經(jīng)大孔樹脂乙醇洗脫部位具有抑制程序性細胞壞死的生理活性[3],并對其有效部位進行系統(tǒng)的化學成分分離,經(jīng)NMR、MS 等波譜技術鑒定其結(jié)構(gòu)。在課題組此前已報道分離了14 個化合物的基礎上,本實驗分離得到了12 個脂肪族類化合物。
Waters 2695 Alliance Separations Module 型高效液相色譜儀、Waters 1525 型制備高效液相色譜儀、Lichrospher C18制備色譜柱(30 mm× 250 mm,10 μm) (美國Waters 公司); Inova-600 型超導核磁共振波譜儀 (美國Varian 公司); Triple QUAD 4500 型質(zhì)譜儀(美國AB Sciex 公司); WFH-203(ZF-1) 型三用紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司); AE100 型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
LH-20 羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20,美國GE Healthcare 公司); 200 目薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠)。甲醇為色譜純(西隴化工股份有限公司); 其他試劑均為分析純; 水為純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。
蒼耳于2017 年7 月采于江西南昌,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學劉賢旺教授鑒定為菊科蒼耳屬植物蒼耳XanthiummongolicumKitag.的地上部分。憑證標本保存于江西中醫(yī)藥大學標本室(編號ZY-20170701)。
自然陰干的10 kg 蒼耳粉碎后過篩,95%乙醇冷浸提取,每次7 d,提取3 次,合并提取液,減壓回收溶劑后得到提取物總浸膏800 g,以適量乙醇溶解,拌樣,裝入已處理好的大孔樹脂柱中,依次以不同體積分數(shù)乙醇梯度洗脫,得到水洗脫部位(Fr.A,200 g)、30% 乙醇洗脫部位 (Fr.B,80 g)、50%乙醇洗脫部位(Fr.C,120 g)、70%乙醇洗脫部位 (Fr.D,60 g)、90% 乙醇洗脫部位(Fr.E,150 g)。Fr.E 經(jīng)硅膠柱分離,以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇洗脫,減壓回收溶劑,得到石油醚部分(Fr.E1,0.67 g)、二氯甲烷部分(Fr.E2,47.28 g)、乙酸乙酯部分 ( Fr.E3,59.67 g)、甲醇部分(Fr.E4,20.92 g)。Fr.E2 經(jīng)硅膠柱分離,以石油醚-乙酸乙酯(100 ∶1 ~0 ∶1)梯度洗脫,得到Fr.E2-1~Fr.E2-12。Fr.E2-1 經(jīng)硅膠柱分離,以石油醚-丙酮(15 ∶1 ~0 ∶1) 梯度洗脫,再經(jīng)硅膠柱分離,以石油醚-乙酸乙酯(100 ∶1 ~0 ∶1) 梯度洗脫,得到化合物8 (1.25 g)。Fr.E2-2 經(jīng)硅膠柱分離,以石油醚-丙酮(10 ∶1 ~0 ∶1) 梯度洗脫,得到化合物12 (8.9 mg)。Fr.E2-5 經(jīng)制備HPLC 純化,以甲醇-水(90 ∶10)洗脫(體積流量2.5 mL/min,檢測波長254 nm),得到化合物6 (6.3 mg,tR=14.8 min)、7 (6.8 mg,tR=18.4 min)。Fr.E2-6 經(jīng)制備HPLC 純化,以甲醇-水(92 ∶2) 洗脫(體積流量2.5 mL/min,檢測波長254 nm),得到化合物2 (4.5 mg,tR=12.5 min)、4 (5.3 mg,tR=19.3 min)、5 (6.0 mg,tR=26.8 min)。Fr.E2-7 經(jīng)制備HPLC 純化,以乙腈-水(85 ∶5 ~100 ∶0) 洗脫(體積流量2.5 mL/min,檢測波長232 nm),得到化合物9 (4.8 mg,tR=9.8 min)、10 (6.2 mg,tR=13.9 min)。Fr.E2-11 經(jīng)制備HPLC 純化,以乙腈-水(85 ∶5 ~95 ∶5) 洗脫(體積流量2.5 mL/min,檢測波長220 nm),得到化合物1 (5.0 mg,tR=6.8 min)、3 (5.6 mg,tR=10.9 min)、11 (4.3 mg,tR=15.7 min)。
化合物1: 白色粉末(氯仿),HR-ESI-MSm/z:279.232 7 [M-H]-,不飽和度2,推斷其分子式C19H36O。1H-NMR 譜中顯示2 個端甲基信號δ:0.88 (6H,t,J=6.9 Hz,H-1,19); 14 個亞甲基信號δ: 1.23 ~1.34 (24H,m,H-2 ~7,H-13 ~18),2.20 (2H,dd,J=7.3 Hz,H-12),2.52(2H,t,J=7.4 Hz,H-8); 2 個烯鍵質(zhì)子信號δ:6.08 (1H,dt,J=15.8,1.5 Hz,H-10),6.82(1H,dt,J=15.8,6.9 Hz,H-11)。13C-NMR 譜中顯示19 個信號,其中1 個酮羰基信號[δ: 201.0(C-9)],結(jié)合DEPT 譜顯示2 個甲基[δ: 14.3(C-1),14.2 (C-19)]、2 個次甲基[δ: 130.4(C-10),147.7 (C-11)]、14 個亞甲基 [δ:24.2 (C-2),29.9 (C-3),29.0 (C-4),29.0(C-5),29.3 (C-6),24.7 (C-7),40.1 (C-8),32.6 (C-12),29.9 (C-13),29.5 (C-14),29.4(C-15),28.3 (C-16),32.0 (C-17),22.8 (C-18)],推測為烯酮類。HMQC 顯示δH6.82 (C-11)、δH6.08 (C-10)、δH2.52 (C-8)、δH2.20(C-12)、δH0.88 (C-1)、δH0.88 (C-19) 等信息;HMBC 顯示H-10 與C-9、C-12 相關,H-11 與C-9、C-12、C-13 相關,H-8 與C-7、C-9 相關,H-12 與C-10、C-11、C-13 相關,提示有碳碳雙鍵與酮羰基相連的情況,其他信息均顯示長鏈上的飽和碳的相關性,見圖1,推測為 (E) -十九烷-10-烯-9-酮,是新天然產(chǎn)物,1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1。
表1 化合物1 的1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data on compound 1
圖1 化合物1 的關鍵HMBC 和1H-1H COSY 相關性Fig.1 Key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1
化合物2: 無色油狀(氯仿),HR-ESI-MSm/z:281.248 6 [M-H]-,分子式C18H34O2。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ: 0.88 (6H,d,J=6.6 Hz,H-17~18),1.25 ~1.31 (16H,m,H-4 ~9,14 ~15),1.62 (2H,m,H-3),2.10 (4H,m,H-10,13),2.21 (2H,t,J=7.4 Hz,H-2),5.35(2H,m,H-11~12);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 180.8 ( C-1),32.9 ( C-2),24.7 ( C-3),29.1 (C-4),29.2 (C-5),29.3 (C-6),29.5(C-7),29.7 (C-8),29.9 (C-9),27.4 (C-10),129.8 (C-11),130.1 (C-12),27.6 (C-13),27.3 (C-14),37.4 (C-15),27.9 (C-16),22.5(C-17),22.7 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[4] 報道基本一致,故鑒定為(Z) -16-甲基-11-十七碳烯酸。
化合物3: 無色油狀(氯仿),HR-ESI-MSm/z:181.122 0 [M-H]-,分子式C13H26。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 0.83 ~0.93 (6H,m,H-1,13),1.22 ~1.42 (14H,m,H-2 ~4,9 ~12),1.95~2.10 (4H,m,H-5,8),5.25~5.42 (2H,m,H-6 ~7);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ:14.3 (C-1),22.8 (C-2),29.9 (C-3),29.5(C-4),32.1 (C-5),129.9 (C-6),130.2 (C-7),32.0 (C-8),29.2 (C-9),29.3 (C-10),29.8 (C-11),22.6 (C-12),14.3 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5] 報道基本一致,故鑒定為(E) -6-十三碳烯。
化合物4: 淡黃色粉末(氯仿),HR-ESI-MSm/z: 229.120 0 [M +H]+,分子式C14H28O2。1HNMR (600 MHz,CDCl3)δ: 0.81 (3H,t,H-12),1.11~1.26 (19H,m,H-4 ~11,14),1.52(2H,q,J=7.3 Hz,H-3),2.17 (2H,t,J=7.5 Hz,H-2),4.01 (2H,q,J=7.1 Hz,H-13);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 173.5 (C-1),34.2 (C-2),24.9 (C-3),29.1 (C-4),29.3 (C-5),29.4 (C-6),29.5 (C-7),29.6(C-8),29.6 (C-9),29.7 (C-10),22.6 (C-11),14.1 (C-12),59.9 (13-OCH2),14.0 (C-14)。以上數(shù)據(jù)以上數(shù)據(jù)與文獻[6] 報道基本一致,故鑒定為月桂酸乙酯。
化合物5: 無色油狀(氯仿),HR-ESI-MSm/z:241.106 8 [M-H]-,分子式C15H30O2。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ: 0.87 (3H,t,J=7.1 Hz,H-14),1.20 ~1.30 (20H,m,H-4 ~13),1.60(2H,m,H-3),2.28 (2H,t,J=7.6 Hz,H-2),3.65 (3H,s,-OCH3);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 173.9 (C-1),34.2 (C-2),25.1 (C-3),28.8 (C-4),28.8 (C-5),28.8 (C-6),28.6 (C-7),28.6 (C-8),28.5 (C-9),28.4(C-10),28.3 (C-11),32.1 (C-12),22.6 (C-13),14.2 (C-14),51.4 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7] 報道基本一致,故鑒定為肉豆蔻酸甲酯。
化合物6: 白色粉末(氯仿),HR-ESI-MSm/z:255.256 5 [M-H]-,分子式C16H32O2。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ: 0.82 (3H,m,H-14),0.88 (3H,td,J=7.0,1.6 Hz,H-16),1.18 ~1.35 (20H,m,H-4 ~13),1.64 (2H,m,H-3),2.28 (2H,td,J=7.6,1.5 Hz,H-2),4.12(2H,m,H-15);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ:174.1 (C-1),34.6 (C-2),25.2 (C-3),29.8(C-4),29.8 (C-5),29.8 (C-6),29.8 (C-7),29.6 (C-8),29.5 (C-9),29.4 (C-10),29.3(C-11),32.1 (C-12),22.8 (C-13),14.3 (C-14),60.3 (-OCH2-),14.1 (C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8] 報道基本一致,故鑒定為肉豆蔻酸乙酯。
化合物7: 白色粉末(氯仿),HR-ESI-MSm/z:241.217 1 [M-H]-,分子式C15H30O2。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ: 0.88 (3H,m,H-15),1.22~1.42 (22H,m,H-4 ~14),1.65 (2H,m,H-3),2.35 (2H,t,J=7.5 Hz,H-2);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ: 177.9 (C-1),33.8 (C-2),24.9 (C-3),29.2 (C-4),29.5 (C-5),29.6 (C-6),29.7 (C-7),29.8 (C-8),29.8(C-9),29.8 (C-10),29.9 (C-11),29.4 (C-12),32.3 (C-13),22.9 (C-14),14.3 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9] 報道基本一致,故鑒定為十五烷酸。
化合物8: 白色粉末(氯仿),HR-ESI-MSm/z:269.139 3 [M-H]-,分子式C17H34O2。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ: 0.77 (3H,td,J=7.0,3.3 Hz,H-15),1.12 (3H,m,H-17),1.13 ~1.32 (22H,m,H-4 ~14),1.5 (2H,m,H-3),2.15 (2H,m,H-2),3.99 (2H,m,H-16);13CNMR (150 MHz,CDCl3)δ: 173.3 (C-1),34.2(C-2),24.9 (C-3),29.1 (C-4),29.4 (C-5),29.7 (C-6),29.7 (C-7),29.7 (C-8),29.6(C-9),29.6 (C-10),29.5 (C-11),29.3 (C-12),31.9 (C-13),22.6 (C-14),14.1 (C-15),59.8 (-OCH2-),14.0 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10] 報道基本一致,故鑒定為十五烷酸乙酯。
化合物9: 白色粉末(氯仿),HR-ESI-MSm/z:255.822 5 [M-H]-,分子式C16H32O2。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ: 0.89 (3H,t,J=5.9 Hz,H-2),1.60 (24H,brs,H-4 ~15),2.08 (2H,m,H-3),2.29 (2H,t,J=5.9 Hz,H-2);13CNMR (150 MHz,CDCl3)δ: 173.7 (C-1),33.2(C-2),31.7 (C-14),29.6 (C-7 ~12),29.5(C-6),29.4 (C-13),29.3 (C-4),24.7 (C-3),22.4 (C-15),13.5 (C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11] 報道基本一致,故鑒定為棕櫚酸。
化合物10: 白色粉末 (氯仿),HR-ESI-MSm/z: 281.248 1 [M-H]-,分子式C18H34O2。1HNMR (600 MHz,CDCl3)δ: 0.87 (3H,t,H-18),1.21 ~1.35 (22H,m,H-3 ~7,12 ~17),1.58~1.66 (2H,m,H-11),2.01 (2H,s,H-8),2.34 (2H,t,H-2),5.35 (2H,s,H-9 ~10);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 180.6 (C-1),34.3 (C-2),23.1 (C-3),27.8 (C-4),29.5 (C-5),29.7 (C-6),29.9 (C-7),29.9(C-8),130.2 (C-9),129.9 (C-10),27.4 (C-11),29.8 (C-12),24.8 (C-13),32.1 (C-14),29.8 (C-15),29.9 (C-16),32.1 (C-17),14.3(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12] 報道基本一致,故鑒定為(E) -十八烷-9-烯酸。
化合物11: 無色油狀 (氯仿),HR-ESI-MSm/z: 267.157 6 [M-H]-,分子式C18H36O。1HNMR (600 MHz,CDCl3)δ: 0.84 (6H,d,J=6.6 Hz,H-6a,10a),0.87 (6H,d,J=6.70 Hz,H-15,14a),1.05 ~1.53 (19H,m,H-4 ~14),2.13 (3H,s,H-1),2.40 (2H,t,J=6.6 Hz,H-3);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 30.0 (C-1),209.6 (C-2),44.3 (C-3),21.6 (C-4),36.6 (C-5),32.9 (C-6),19.9 (C-6a),37.4(C-7),24.9 (C-8),37.4 (C-9),32.8 (C-10),19.7 ( C-10a),37.5 ( C-11),24.6 ( C-12),39.5 ( C-13),28.1 ( C-14),22.8 ( C-14a),22.9 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13] 報道基本一致,故鑒定為6,10,14-三甲基-2-十五酮。
化合物12: 無色油狀(氯仿),ESI-MSm/z:329.245 1 [M +Na]+,分子式C20H34O2。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ: 0.94 (3H,t,J=7.4 Hz,H-18),1.22 (3H,t,J=7.3 Hz,H-20),1.23 ~1.28 (12H,m,6×CH2),1.58 (2H,m,H-3),2.25 (2H,t,J=7.5 Hz,H-2),2.77 (4H,m,H-11,14),4.07 (2H,q,J=7.3 Hz,H-19),5.20 ~5.40 (6H,m,H-9 ~10,12 ~13,15 ~16);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 174.0 (C-1),34.3 (C-2),20.7 (C-3),25.1 (C-4),25.7 (C-5),25.8 (C-6),27.3 (C-7),29.3(C-8),130.4 (C-9),127.9 (C-10),29.7 (C-11),128.4 (C-12),128.4 (C-13),29.3 (C-14),127.3 (C-15),132.1 (C-16),25.0 (C-17),14.4 (C-18),60.3 (-OCH2-),14.4 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14] 報道基本一致,故鑒定為亞麻酸乙酯。
課題組從蒼耳草中分離得到了12 個短鏈脂肪族化合物,包括2 個脂肪烯(酮) 類、10 個脂肪酸(酯) 類。通過查閱美國化學文摘、SCIE、中國知網(wǎng)、維普網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),化合物1 僅有一篇文獻報道過通過合成反應得到過[15],但未提供具體的核磁數(shù)據(jù)。本研究中將其作為新天然產(chǎn)物,首次從植物體中分離得到,并提供了完整的數(shù)據(jù)歸屬(表1)。另外,化合物2 僅在海洋生物海綿中被發(fā)現(xiàn),為首次從植物體中分離得到,化合物3、6、8、10 為首次從蒼耳屬植物中分離得到。
蒼耳屬中植物富含脂肪族類化合物,且藥理作用豐富?,F(xiàn)代藥理研究表明,短鏈脂肪酸有調(diào)節(jié)脂肪代謝、調(diào)節(jié)能量平衡、減輕炎癥反應的作用[16],中長鏈脂肪酸有抗菌、抗病毒作用[17-18]。研究顯示,蒼耳子中的亞油酸具有降低人體膽固醇,降血壓,軟化血管,增加人體肌肉和心臟、心血管系統(tǒng)的機能等作用[19]。Hamid 等[12]研究發(fā)現(xiàn),化合物10 對白血病癌K562、肝癌細胞WRL、結(jié)直腸癌均表現(xiàn)出抗增殖活性。Carballeira 等[4]研究發(fā)現(xiàn),化合物2 對黑熱病原蟲具有抑制作用,IC50值為(165.5±23.4) μmol/L?;衔? ~6 常在食品領域和日用化學品領域用于制作香料香精,但Manosroi 等[20]發(fā)現(xiàn)化合物5 對黑色素瘤細胞有較強的細胞毒性。Narasimhan 等[21]發(fā)現(xiàn)化合物5 ~6對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的抗菌活性良好。化合物7 可以抑制THP-1 細胞的促炎細胞因子從而發(fā)揮抗炎作用[22]?;衔? 通過促進IL-8 釋放導致肝細胞的炎癥反應[23]。Ferezou 等[24]發(fā)現(xiàn)化合物11 對甲殼類動物的生殖系統(tǒng)具有抑制作用?;衔?2 可抑制細胞產(chǎn)生黑色素,IC50值為70 μmol/L[25]。
綜上所述,本研究豐富了蒼耳屬的化學成分庫,同時隨著課題組對該屬植物脂肪族類化合物研究的深入,后期將對其展開一系列藥理活性篩選,為拓寬蒼耳的藥用價值奠定物質(zhì)基礎。