余志會(huì)，方肆云，孫銘飛，戚南山，劉文俊，李 娟，胡俊菁，廖申權(quán)

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 云浮 527400）

寄生原蟲是一類單細(xì)胞真核生物，包括利什曼原蟲（Leishmaniaspp.）、錐蟲（Trypanosomaspp.）、瘧原蟲（Plasmodiumspp.）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）、隱孢子蟲（Cryptosporidiumspp.）和艾美耳球蟲（Eimeriaspp.）等，所引起的寄生原蟲病嚴(yán)重危害人類與動(dòng)物健康，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1-4］。嘌呤堿基是核苷酸合成的前體，在細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝和維生素合成等多種生理過程中都具有重要作用。寄生原蟲的入侵、發(fā)育和繁殖需要大量的嘌呤核苷酸，嘌呤核苷酸參與細(xì)胞和寄生原蟲的多個(gè)生化過程，在生物體和寄生原蟲中發(fā)揮重要作用，如核苷酸為核酸生物合成提供前體物質(zhì)，ATP 為通用能量載體，核苷酸衍生物為多個(gè)生物合成反應(yīng)提供重要前體物質(zhì)［5］。生物體內(nèi)，細(xì)胞可以通過從頭合成和補(bǔ)救途徑兩種不同方式合成嘌呤核苷酸，以從頭合成途徑為主；但寄生原蟲只能利用補(bǔ)救途徑合成嘌呤核苷酸，通過從宿主細(xì)胞攝取核酸分解產(chǎn)生的核苷和堿基在磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Phosphoribosyltransferase,PRT）作用下合成嘌呤核苷酸［6-8］。寄生原蟲參與嘌呤核苷酸合成的主要為腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Adenine phosphoribosyltransferase,APRT）和6-氧代嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶（6-oxopurine phosphoribosy ltransferase），后者在大多數(shù)寄生原蟲中以次黃嘌呤-鳥嘌呤-黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Hypoxanthine-guanine-xanthine phosphoribosy ltransferase,HGXPRT）形式存在。腺嘌呤在APRT 的催化作用下轉(zhuǎn)化為嘌呤核苷酸；次黃嘌呤、鳥嘌呤和黃嘌呤在HGXPRT 的催化作用下分別轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷酸、鳥嘌呤核苷酸和黃嘌呤核苷酸，其中5-磷酸核糖焦磷酸（Phosphoribosylpyrophosphate,PRPP）是嘌呤補(bǔ)救途徑的主要底物。寄生原蟲的生長(zhǎng)發(fā)育需要大量的嘌呤核苷酸，APRT 和HGXPRT 作為蟲體嘌呤補(bǔ)救途徑關(guān)鍵酶，在寄生原蟲嘌呤補(bǔ)救生物合成及生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要作用［9-12］。由于寄生原蟲的嘌呤補(bǔ)救途徑明顯區(qū)別于宿主的從頭合成途徑，因而原蟲嘌呤補(bǔ)救途徑關(guān)鍵酶成為抗原蟲藥物靶標(biāo)研究的熱點(diǎn)之一，為抗寄生原蟲藥物研發(fā)提供了新思路。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究關(guān)注寄生原蟲嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)特征與功能，并以其為藥物靶點(diǎn)進(jìn)行抑制劑篩選研究［8,13］。本文就寄生原蟲嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基本特征、生物學(xué)功能及其抑制劑研發(fā)等研究進(jìn)展作一綜述，以期為抗原蟲藥靶發(fā)現(xiàn)與抗原蟲藥物研制提供新的思路與理論依據(jù)。

1 寄生原蟲PRT 的基本特征

1.1 寄生原蟲HGXPRT 的基本特征

寄生原蟲普遍存在HGXPRT。研究顯示，杜氏利什曼原蟲（L.donovani）的嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶包括次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase,LdHGPRT）和黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Xanthine phosphoribosyltransferase,LdXPRT）兩個(gè)成員，其中LdHGPRT 由211 個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子量為23.6 kD；LdXPRT 由241 個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子量為26 kD，兩者氨基酸序列同源性達(dá)33%［14］。Zarella-boitz 等［15］發(fā) 現(xiàn)，LdHGPRT 和LdXPRT 的羧基端均存在由1 個(gè)三肽分子組成的過氧化物酶體轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，兩者均定位于利什曼原蟲的糖酵解酶體，其中糖酵解酶體為動(dòng)基體目寄生原蟲所特有的微體，含有糖酵解反應(yīng)的大多數(shù)酶。研究表明，LdHGPRT 中保守的Ser-Tyr 氨基酸殘基是該蛋白家族的特征，對(duì)于嘌呤核苷酸的磷酸核糖化至關(guān)重要［16］。

布氏錐蟲（T.brucei）嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶由TbHGPRT-Ⅰ、TbHGPRT-Ⅱ和TbHGXPRT 共3 個(gè)同工酶組成。Dolezelova 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，TbHGPRT-I 和TbHGPRT-II 均由210 個(gè)氨基酸組成，兩者同源性高達(dá)98%；TbHGXPRT 由234 個(gè)氨基酸組成，與TbHGPRT-I 和TbHGPRT-II 的同源性僅為56%。隨后研究發(fā)現(xiàn)TbHGPRT-I、TbHGPRT-II 和TbHGXPRT 均以同源二聚體形式發(fā)揮作用［18］。Vidhya 等［19］發(fā)現(xiàn)TbHGPRT-II 和TbHGXPRT 定位于糖酵解酶體，而TbHGPRT-I定位于細(xì)胞質(zhì)。對(duì)蟲體不同時(shí)期表達(dá)量差異分析發(fā)現(xiàn)，TbHGPRT-I 和TbHGXPRT 在前循環(huán)型和血流型蟲體中表達(dá)水平一致，而TbHGPRT-II 僅在前循環(huán)型蟲體中表達(dá)［18］。研究顯示，克氏錐蟲（T.cruzi）嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶存在TcA、TcB、TcC 和TcD 等4 種亞型，其中TcA 與TcC均由221 個(gè)氨基酸組成，屬于TcHGPRTs；TcB 與TcD 均由231 個(gè)氨基酸組成，屬于TcHGXPRTs；TcHGPRTs 和TcHGXPRTs 氨基酸序列同源性達(dá)35%［20］。研究發(fā)現(xiàn)，TcHGPRTs 主要在急性期的血流型蟲體中表達(dá)，而TcHGXPRTs 主要在急性期發(fā)展至腦炎期的蟲體中表達(dá)，以維持蟲體在腦組織中持續(xù)感染［21］。

惡性瘧原蟲（P.falciparum）次黃嘌呤-鳥嘌呤-黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（PfHGXPRT）由231 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為26.2 kD；間日瘧原蟲（P.vivax）次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（PvHGPRT）由233 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為27.8 kD；PfHGXPRT 與PvHGPRT 氨基酸序列的同源性達(dá)77%［22-23］，兩者在低離子濃度和高離子濃度下分別以同型四聚體和二聚體形式存在。研究發(fā)現(xiàn)瘧原蟲HGXPRT 蛋白極不穩(wěn)定，導(dǎo)致瘧原蟲HGXPRT 的重組、表達(dá)、純化和晶體培養(yǎng)均不易實(shí)現(xiàn)，目前已解析PfHGXPRT與底物次黃嘌呤的共結(jié)晶，以及PfHGXPRT 與抑制劑ImmucilllnHP 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)PfHGXPRT 每個(gè)亞基由6 個(gè)α 螺旋與11 個(gè)β 折疊組成，其中46～149 氨基酸處于蛋白質(zhì)核心區(qū)［24］。

剛地弓形蟲（T.gondii）6-氧代嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶存在TgHGXPRT-Ⅰ和TgHGXPRT-Ⅱ兩種亞型。研究發(fā)現(xiàn)，編碼這兩種同工酶的為同一個(gè)基因Tghgxprt，其完整的編碼閱讀框?yàn)?40 bp。Tghgxprt基因轉(zhuǎn)錄、翻譯后，通過不同的剪接方式形成兩種不同的cDNA，從而形成TgHGXPRT-Ⅰ和TgHGXPRT-Ⅱ兩種亞型。其中TgHGXPRT-Ⅰ由230 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為26.7 kD；TgHGXPRT-Ⅱ由279 個(gè)氨基酸組成，與前者相比，僅在羧基端多49 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為31.8 kD［25］。Chaudhary等［26］發(fā)現(xiàn)TgHGXPRT-Ⅰ定位于蟲體細(xì)胞質(zhì)，TgHGXPRT-Ⅱ定位于內(nèi)膜復(fù)合物，該復(fù)合物為頂復(fù)門寄生原蟲細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)獨(dú)特的膜細(xì)胞器。

1.2 寄生原蟲APRT 的基本特征

杜氏利什曼原蟲腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（LdAPRT）由237 個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子量為26.2 kD［27］，定位于蟲體細(xì)胞質(zhì)［15］。Phillips 等［28］解析了LdAPRT 與底物腺嘌呤、產(chǎn)物AMP，以及硫酸鹽和檸檬酸鹽離子等結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)LdAPRT 屬于Ⅰ型磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，與該家族其他PRT 的晶核結(jié)構(gòu)相似，包含由13個(gè)氨基酸殘基組成的PRPP核糖環(huán)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，但在底物腺嘌呤結(jié)合的結(jié)構(gòu)域存在差異；利什曼原蟲APRT 羧基端均存在延伸結(jié)構(gòu)，以組成二聚體的接合面，且APRT 活性位點(diǎn)由二聚體的兩個(gè)亞基共同組成，推測(cè)利什曼原蟲APRT 二聚體結(jié)構(gòu)對(duì)其催化活性至關(guān)重要。

布氏錐蟲腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶由TbAPRT1和TbAPRT2 兩個(gè)成員組成，在布氏錐蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中可注釋到Tbaprt1和Tbaprt2兩個(gè)基因，TbAPRT1 和TbAPRT2 氨基酸序列的同源性僅為22%，TbAPRT1 和TbAPRT2 與LdAPRT 氨基酸序列的相似性分別為52%和27%；序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，TbAPRT1 屬于Ⅰ型磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，而TbAPRT2 與乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Orotate phosphoribosyl-transferase,OPRT）具有結(jié)構(gòu)相似的活性中心［29-30］。研究發(fā)現(xiàn)，TbAPRT1 定位于細(xì)胞質(zhì)，在血流型和前循環(huán)型錐蟲中均有表達(dá)；TbAPRT2 定位于糖酵解酶體，僅在前循環(huán)型錐蟲中表達(dá)［29］。目前仍未發(fā)現(xiàn)瘧原蟲與弓形蟲存在APRT，推測(cè)可能存在同工酶或代償路徑。

2 寄生原蟲PRT 的生物學(xué)功能

2.1 寄生原蟲HGXPRT 的生物學(xué)功能

杜氏利什曼原蟲利用LdHGPRT 和LdXPRT兩種酶催化不同的6-氧代嘌呤底物，其中LdHGPRT 催化底物次黃嘌呤和鳥嘌呤，而LdXPRT 具有特殊的底物特異性，可催化黃嘌呤、次黃嘌呤和鳥嘌呤3 種底物，黃嘌呤是LdXPRT的最適底物表1）［14］。Patel 等［31］進(jìn)一步分析LdXPRT 底物特異性機(jī)制，發(fā)現(xiàn)LdXPRT（I209V）突變體對(duì)黃嘌呤的親和力降低，突變后的催化功能類似HGXPRT，提示I209 為L(zhǎng)dXPRT底物特異性的關(guān)鍵位點(diǎn)。早期研究嘗試構(gòu)建杜氏利什曼原蟲Δhgprt/Δxprt雙缺失突變株，但均未成功，提示LdHGPRT 和LdXPRT 可能在利什曼原蟲嘌呤核苷酸合成中起重要作用［14,32］。隨后Boitz 等［33］構(gòu)建了條件性杜氏利什曼原蟲Δhgprt/Δxprt雙缺失突變株，證實(shí)LdHGPRT 和LdXPRT在蟲體嘌呤核苷酸合成中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Xanthine phosphoribosyltransferase,XPRT）只存在利什曼原蟲以及一些特定真菌和細(xì)菌中，哺乳動(dòng)物缺乏XPRT［34］，因而LdXPRT 作為抗利什曼原蟲藥物靶點(diǎn)研究備受關(guān)注。

表1 寄生原蟲6-氧代嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 1 Kinetic constants of the 6-oxopurine phosphoribosyltransferases of protozoan parasites

研究發(fā)現(xiàn)布氏錐蟲嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶存在TbHGPRT-Ⅰ、TbHGPRT-Ⅱ和TbHGXPRT 亞型，每種亞型對(duì)6-氧代嘌呤的親和力存在差異，TbHGPRT-Ⅰ和TbHGPRT-Ⅱ可以利用次黃嘌呤和鳥嘌呤，對(duì)黃嘌呤無(wú)催化活性；TbHGXPRT 可以催化次黃嘌呤、鳥嘌呤和黃嘌呤3 種底物，且對(duì)3 種底物的催化效率相近（表1）［18］。Dolezelova 等［17］利用RNAi 技術(shù)將Tbhgprt-Ⅰ、Tbhgprt-Ⅱ和Tbhgxprt基因同時(shí)表達(dá)沉默，發(fā)現(xiàn)TbHGPRT-Ⅰ、TbHGPRT-Ⅱ和TbHGXPRT 對(duì)感染期布氏錐蟲的生存至關(guān)重要?？耸襄F蟲TcHGPRT 包括TcA 和TcC 兩個(gè)亞型，可以催化底物次黃嘌呤和鳥嘌呤，幾乎不能利用黃嘌呤；TcHGXPRT 包括TcB 和TcD 兩個(gè)亞型，可以利用次黃嘌呤、鳥嘌呤和黃嘌呤3 種底物，對(duì)黃嘌呤的親和力高［35］。由于克氏錐蟲嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶存在4 種亞型，因此以該酶為潛在藥物靶標(biāo)篩選出的抑制劑需同時(shí)抑制TcHGPRT 和TcHGXPRT 活性，這些結(jié)果可為后續(xù)抑制劑篩選研究提供基礎(chǔ)。

惡性瘧原蟲PfHGXPRT 可以利用次黃嘌呤、鳥嘌呤和黃嘌呤3 種底物，其中鳥嘌呤為最適底物；而間日瘧原蟲PvHGPRT 只能利用次黃嘌呤和鳥嘌呤，不能催化黃嘌呤合成嘌呤核苷酸［36］，推測(cè)PfHGXPRT 與PvHGPRT 對(duì)黃嘌呤催化活性的差異可能與惡性瘧原蟲更易于從按蚊體內(nèi)攝取高濃度黃嘌呤相關(guān)。研究表明，PfHGXPRT 的酶活性需要低濃度PRPP 與次黃嘌呤進(jìn)行活化，其最佳活化條件為：PfHGXPRT 濃度為37 μmol/L，PfHGXPRT 與底物PRPP 和次黃嘌呤的比值為1∶7.4∶2.2，活化后的PfHGXPRT 最大反應(yīng)速率可達(dá)8.37 μmol/min·mg，是未活化酶的10.8 倍，推測(cè)活化過程與PfHGXPRT 聚合為具有更高活性的四聚體相關(guān)；然而高濃度的底物可以抑制PfHGXPRT 酶活性，推測(cè)可能是高濃度底物PRPP或次黃嘌呤與PfHGXPRT 緊密結(jié)合從而抑制產(chǎn)物的生成［37］，這些結(jié)果提示最佳的PfHGXPRT 酶活性反應(yīng)體系是體外評(píng)價(jià)抑制劑效果時(shí)需考慮的重要因素。

剛地弓形蟲6-氧代嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶的TgHGXPRT-Ⅰ和TgHGXPRT-Ⅱ兩種亞型均以四聚體存在且均具有催化活性，TgHGXPRT-Ⅱ與底物親和力較TgHGXPRT-Ⅰ弱，其中Ⅱ型對(duì)鳥嘌呤的Km 值較Ⅰ型高6 倍［25］。根據(jù)已有研究結(jié)果，僅在弓形蟲中發(fā)現(xiàn)同一基因編碼的兩個(gè)亞型磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，且兩個(gè)亞型均能維持蟲體的繁殖與發(fā)育，具體機(jī)制仍不清晰，但推測(cè)兩種功能性亞型磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶與弓形蟲廣泛的寄生宿主特性相關(guān)，可以有助于弓形蟲在不同宿主中利用攝取或轉(zhuǎn)運(yùn)的嘌呤進(jìn)行嘌呤核苷酸合成［26］。

2.2 寄生原蟲APRT 的生物學(xué)功能

杜氏利什曼原蟲腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（LdAPRT）可利用腺嘌呤和PRPP，其對(duì)腺嘌呤和PRPP 的Km 值分別為2.3、25.1 μmol/L［27］。Boitz 等［38］構(gòu)建杜氏利什曼原蟲Δaprt缺失突變株，發(fā)現(xiàn)杜氏利什曼原蟲前鞭毛體Δaprt缺失株在腺嘌呤底物環(huán)境中不能存活，在腺苷環(huán)境中存活率降低50%；杜氏利什曼原蟲無(wú)鞭毛體Δaprt缺失株可以在腺嘌呤環(huán)境中存活；Δaprt缺失株也可以感染巨噬細(xì)胞，提示蟲體可以從宿主細(xì)胞攝取多種腺苷來(lái)源，利用其他補(bǔ)救途徑進(jìn)行嘌呤核苷酸合成。此外，利什曼原蟲不僅利用APRT 合成嘌呤核苷酸，還可以利用腺苷激酶（Adenosine kinase,AK）合成AMP，以及利用腺嘌呤氨基水解酶（Adenine aminohydrolase,AAH）生成次黃嘌呤，再經(jīng)HGPRT 催化生成IMP，進(jìn)而通過腺苷琥珀酸合成酶、腺苷琥珀酸裂解酶生成AMP［39］。利用代謝流分析發(fā)現(xiàn)，利什曼原蟲主要運(yùn)用腺嘌呤轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤，再生成IMP，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為AMP進(jìn)行嘌呤核苷酸合成，因此推測(cè)利什曼原蟲腺嘌呤氨基水解酶在嘌呤核苷酸合成中起重要作用［40］。

布氏錐蟲APRT 存在TbAPRT1 和TbAPRT2兩種同工酶：TbAPRT1 具有催化活性，對(duì)腺嘌呤的Km 值為3.7 μmol/L；而TbAPRT2 對(duì)腺嘌呤的Km值為253 μmol/L，與TbAPRT1相比，被認(rèn)為幾乎無(wú)催化活性［30］。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，TbAPRT1 屬于Ⅰ型磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，而TbAPRT2與乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Orotate phosphoribosyltransferase,OPRT）具有結(jié)構(gòu)相似的活性中心，推測(cè)TbAPRT2 作用的底物可能是乳清酸。研究提示TbAPRT1 為布氏錐蟲功能性的磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶。

弓形蟲、瘧原蟲和隱孢子蟲等不存在APRT酶催化活性，并且在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中也未能注釋到aprt基因［41］。研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲和隱孢子蟲利用腺苷激酶催化腺苷ATP 磷酸化生成AMP［42］。瘧原蟲缺失AK 和APRT，利用腺苷脫氨酶（Ademosine deaminase,ADA）水解腺苷脫氨產(chǎn)生次黃苷，再通過嘌呤核苷磷酸化酶（Purine nucleoside phosphorylase,PNP）作用生成次黃嘌呤［43］。寄生原蟲因其寄生的宿主環(huán)境各有不同，可能導(dǎo)致各原蟲的嘌呤補(bǔ)救途徑有所不同。

3 寄生原蟲PRT 的應(yīng)用研究

目前，以寄生原蟲嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶為潛在靶點(diǎn)的抑制劑研究較為廣泛。研究結(jié)果顯示，嘌呤基雜環(huán)化合物和核苷類似物等與嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的底物結(jié)構(gòu)相似，因此在抗利什曼原蟲、錐蟲、瘧原蟲和弓形蟲等的先導(dǎo)化合物研究中取得重要進(jìn)展。

3.1 嘌呤基雜環(huán)化合物

嘌呤基雜環(huán)化合物可抑制6-氧代PRT活性，并且在體外能有效抑制寄生原蟲繁殖。6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、6-氯嘌呤和8-氮鳥嘌呤等能抑制PfHGXPRT 酶活性，半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.3～67 μmol/L；這些抑制劑也可以體外抑制惡性瘧原蟲的繁殖，IC50值為2～18 μmol/L［44-45］。研究發(fā)現(xiàn)，別嘌醇和硫唑嘌呤可以抑制體外利什曼原蟲繁殖，對(duì)杜氏利什曼原蟲的IC50值為1.9～17 μmol/L，對(duì)嬰兒利什曼原蟲的IC50值為0.6～2.8 μmol/L（表2）［46］。已有研究發(fā)現(xiàn)嘌呤基雜環(huán)化合物中別嘌醇的抗原蟲活性較好。

表2 寄生原蟲嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的活性抑制劑Table 2 Inhibitors against purine phosphoribosyltransferases of protozoan parasites

3.2 核苷類似物

核苷及核苷類似物是嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的天然底物，核苷類似物等抑制劑的設(shè)計(jì)成為抑制劑開發(fā)的有效策略之一。硝基芐硫肌苷是TgHGXPRT 的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其對(duì)TgHGXPRT的IC50值為10 μmol/L，對(duì)宿主細(xì)胞沒有明顯毒性，高劑量（100 μmol/L）對(duì)未感染的宿主細(xì)胞沒有顯著的毒性作用［47］。Keough 等［48］發(fā)現(xiàn)，四酰胺苯丙氨酸對(duì)PfHGXPRT 的IC50值為7 nmol/L，其抑制活性較嘌呤基雜環(huán)類似物強(qiáng)。Immucillin 也是一類核苷類似物，Immucillin-H 和Immucillin-G 能抑制PfHGXPRT 和TcHGPRT 活性，其中對(duì)PfHGXPRT 的抑制活性比TcHGPRT強(qiáng)［20,49］，但未見Immucillin 對(duì)惡性瘧原蟲和克氏錐蟲體外繁殖抑制效果的報(bào)道。Hazleton 等［50］發(fā)現(xiàn)，非環(huán)化Immucillin 類似物（Acyclic immucillin phosphonate,AIP）可以有效抑制6-氧代PRT活性，其中衍生物AIP-2 和AIP-3 對(duì)PfHGXPRT 的抑制活性Ki 值分別為10、0.65 nmol/L，具有很強(qiáng)的抑制活性；對(duì)體外惡性瘧原蟲繁殖的IC50值分別為2.5、1.9 μmol/L。此外，非環(huán)化核苷類似物（acyclic nucleoside phosphonates,ANP）也具有抑制活性，利用分子對(duì)接等分析發(fā)現(xiàn)，ANP 衍生物不僅對(duì)6-氧代嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶具有抑制活性，而且能抑制APRT 活性，其中衍生物ANP-2h 和ANP-2i 對(duì)TbrAPRT1 的抑制活性Ki 值分別為0.57、0.39 μmol/L［51-53］；2（磷酸乙氧基）乙鳥嘌呤、2（磷酸乙氧基）乙次黃嘌呤、Guanine cyclic-(R)-HPMP 和Guanine-PME 對(duì)PfHGXPRT 的抑制活性Ki 值分別為0.1、0.3、1.0、1.6 μmol/L（表2）［54-57］。

3.3 其他抑制劑

異乙酸酯和醋酸熊果酸可以抑制PfHGXPT 活性，且抑制作用呈量效關(guān)系，兩者均對(duì)PfHGXPT表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力，解離常數(shù)分別為0.0833、2.8396 μmol/L，被認(rèn)為是具有潛力的抗瘧藥物［55］。研究發(fā)現(xiàn)楝科植物提取物對(duì)利什曼原蟲APRT 具有抑制作用，其中青花菜根、葉甲醇提取物分別使APRT 的比活性降低84.5%和80.1%；紅果菜果、枝、葉甲醇提取物分別使APRT 的比活性降低78.7%、90.8%和90.3%。在蕓香科植物提取物中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)呋喃喹諾酮類生物堿，可使APRT 的比活性降低90.7%［58］。楝科植物提取物和呋喃喹諾酮類生物堿均具有酶抑制作用，這些化合物的抗利什曼原蟲效果仍有待進(jìn)一步開展體內(nèi)外試驗(yàn)驗(yàn)證［59］。

4 展望

寄生原蟲感染引起利什曼原蟲病、錐蟲病、瘧原蟲病、弓形蟲病和雞球蟲病等，不僅對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅人類健康［60-62］。目前，寄生原蟲病的防治仍主要依賴抗原蟲藥物，隨著抗原蟲藥物的長(zhǎng)期、廣泛應(yīng)用，寄生原蟲對(duì)藥物的抗藥性日益嚴(yán)重，已有抗原蟲藥物的毒副作用等嚴(yán)重限制了藥物的臨床應(yīng)用，因而篩選新的抗原蟲藥物靶標(biāo)并研制新型抗原蟲藥物成為當(dāng)務(wù)之急。嘌呤核苷酸具有重要的生物學(xué)功能，在寄生原蟲的入侵、發(fā)育和繁殖等多個(gè)階段需要大量的嘌呤核苷酸。宿主主要采用從頭途徑合成嘌呤核苷酸，然而，原蟲缺乏嘌呤從頭合成途徑，完全依賴補(bǔ)救途徑進(jìn)行嘌呤核苷酸的生物合成，寄生原蟲與宿主的嘌呤代謝機(jī)制存在的明顯差異使得寄生原蟲嘌呤補(bǔ)救途徑關(guān)鍵酶次黃嘌呤-鳥嘌呤-黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶成為備受關(guān)注的抗原蟲藥物靶標(biāo)。近年來(lái)，應(yīng)用生物化學(xué)、藥物化學(xué)、基因編輯技術(shù)等，揭示了利什曼原蟲、錐蟲、瘧原蟲和弓形蟲等寄生原蟲嘌呤代謝機(jī)制、嘌呤代謝關(guān)鍵酶特征與生物學(xué)功能，并在此基礎(chǔ)上針對(duì)嘌呤代謝關(guān)鍵酶次黃嘌呤-鳥嘌呤-黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶篩選特異性抑制劑，通過體內(nèi)外驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一系列具有良好抗原蟲活性的先導(dǎo)化合物。目前，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)在抗病毒、抗腫瘤藥物的研發(fā)中取得重要進(jìn)展，極大推進(jìn)了扎那米韋、伊馬替尼等藥物的研發(fā)效率并成功上市［63］。隨著計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法逐步成熟，在藥物研發(fā)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，日益成為新藥研究的核心技術(shù)之一。因而，在前期基于寄生原蟲嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（APRT 和HGXPRT）篩選出系列先導(dǎo)化合物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步解析寄生原蟲嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的分子結(jié)構(gòu)，明晰藥靶與配體的作用機(jī)制，利用計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)進(jìn)行高通量篩選特異、高效、安全的活性抑制劑，并開展體內(nèi)外試驗(yàn)驗(yàn)證抑制劑的抗原蟲活性，從而篩選出更高效安全的抗寄生原蟲先導(dǎo)化合物，這將為基于嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶為藥物靶標(biāo)的抗原蟲新藥研發(fā)提供新思路。