王 鋒，衛(wèi)國(guó)羽，趙 微，王華磊，李 祝，邱紅波，胡安龍

（1.棗莊職業(yè)學(xué)院，山東 棗莊 277000 ；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

【研究意義】黃精（Polygonatum sibiricum）是一種重要的中藥材，為多年生百合科黃精屬植物，其根莖和幼苗可食用［1］。黃精包含黃精皂苷、煙酸、糖類、醌類、氨基酸和微量元素等多種成分［2］，可用于治療疾病，如抗菌［3］、抗腫瘤和抗病毒。除此之外，黃精含有多種維生素和礦物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有助于人體健康。隨著黃精的需求量越來越大，其人工栽培面積也不斷增大，但常年連作，再加上黃精的生產(chǎn)大多采用分根繁殖，使根腐病日趨加重，成為黃精生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】韓鳳等［4］對(duì)重慶地區(qū)多花黃精根腐病病原菌的分離與鑒定，明確了重慶地區(qū)多花黃精根腐病的病原菌主要為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮鐮刀菌（F.solani），粱忠厚等［5］研究表明，湖南多花黃精根腐病病原為Fusarium foetens和Fusarium hostae，但都未對(duì)該病害進(jìn)行防治研究。李靜納等［6］研究了多菌靈可濕性粉劑等5 種殺菌劑對(duì)多花黃精根腐病的防效，發(fā)現(xiàn)5 種藥劑施用14 d后防治效果大于75%。吉林省黃精根腐病病原主要是腐皮鐮刀菌（F.solani）和尖孢鐮孢菌（F.oxysporum），針對(duì)該地區(qū)多花黃精根腐病的防治主要為化學(xué)防治［7］。關(guān)于用生防菌對(duì)多花黃精根腐病進(jìn)行防治的研究較少。

【本研究切入點(diǎn)】多花黃精根腐病是一種毀滅性病害，嚴(yán)重影響多花黃精的品質(zhì)和產(chǎn)量［8］，該病發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，可造成多花黃精絕收，因此對(duì)多花黃精根腐病害的治理已成為保障中草藥質(zhì)量安全的關(guān)鍵?；瘜W(xué)防治是防治病害的重要手段，但因其帶來的“3R（Residue 殘留，Resistance 抗性，Resurgence 再猖獗）”等問題，制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展［9］。因此，尋找作用效果明顯、藥效好的生物農(nóng)藥已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對(duì)多花黃精根腐病進(jìn)行病原菌鑒定，篩選出對(duì)病原菌具有較好抑制作用的菌株，利用平板對(duì)峙法測(cè)定4 株生防菌株（WHD01～WHD04）對(duì)病原菌的抑制作用，然后對(duì)其進(jìn)行鑒定，并測(cè)定4 株生防菌株發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制效果。從而篩選出抑菌作用較好的生防菌株，以期為多花黃精根腐病的生物防治提供依據(jù)，開發(fā)出具有應(yīng)用價(jià)值的生防菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試病樣 2022 年夏季，在貴州省臺(tái)江縣采用隨機(jī)取樣法采集多花黃精感病樣品，帶回貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃冰箱保存，并在24 h 內(nèi)對(duì)病原菌進(jìn)行分離。

1.1.2 供試生防菌株 生防真菌（WHD01、WHD02）、生防細(xì)菌（WHD03、WHD04），分離自發(fā)病區(qū)土壤和植物組織。

1.1.3 主要培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、去離子水1 000 mL，置于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，待冷卻至室溫后取出備用。馬鈴薯葡萄糖水（PDB）培養(yǎng)基：在PDA 培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上去掉瓊脂，其他操作同PDA 培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:稱取牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蛋白胨10 g，加1 000 mL 去離子水煮沸，用無菌水定容至1 000 mL，放入壓力蒸汽滅菌鍋121 ℃高壓滅菌20 min，待冷卻至室溫后取出備用。

1.2 病原菌分離純化

使用組織分離法分離多花黃精感病樣品的潛在病原菌，在多花黃精根莖的病健交界處選取1 cm×1 cm 的方塊，依次將其放入75%乙醇溶液中浸泡1 min、2%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，無菌水沖洗5 次,用無菌濾紙吸干水分后，置于PDA 培養(yǎng)基中，28℃ 恒溫培養(yǎng)。待其長(zhǎng)出菌絲后，再挑取菌絲到新的PDA 培養(yǎng)基中繼續(xù)純化培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌致病性測(cè)定

根據(jù)科赫氏法則，將分離菌置于PDA 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 d，然后用打孔器打取菌餅于50 mL PDB 培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d，用無菌水配制成1×106CFU/mL 的孢子懸浮液。將2 年生的多花黃精健康塊莖置于上述孢子懸液中浸泡30 min，移入有濕潤(rùn)濾紙和棉花保濕的塑料盒中，以接種無菌水的多花黃精健康塊莖為對(duì)照，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。接種14 d 后觀察記錄多花黃精發(fā)病情況，并在塊莖病斑處再次分離純化病原菌，與原接種的分離菌株進(jìn)行比較。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 用5 mm 打孔器在分離純化后的病原菌邊緣打孔取樣，用接種環(huán)挑取菌餅接種于直徑為9 cm 的 PDA 平板中心，設(shè)3 次重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d 后觀察其菌落形態(tài)、培養(yǎng)基顏色；利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲、孢子形態(tài)及有無隔膜等情況。

1.4.2 分子鑒定 用Fungal DNA Kit D3390試劑盒（OMEGA 生物試劑公司）提取菌株DNA，選用真菌通用引物ITS1 和ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列為ITS1 ：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′［10］，PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將序列結(jié)果在Conting Express 軟件上拼接，然后上傳至NCBI 中的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，下載同源性較高的參考序列，使用MEGA7.0.14 軟件，設(shè)置Bootstrap 值為1 000，以鄰接法構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 生防菌的篩選與鑒定

1.5.1 生防菌的篩選 將供試病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，用直徑8 mm的無菌打孔器在菌落上打出直徑一致的菌餅，備用。采用平板對(duì)峙法［11-12］對(duì)4 株生防菌株進(jìn)行抑菌活性評(píng)價(jià)。用直徑5 mm 的打孔器在已培養(yǎng)4 d 的病菌菌落邊緣打孔取菌餅，并接種在PDA 平板中央，再分別接種生防菌株。接種后28 ℃倒置培養(yǎng)5～6 d 后，觀察4 株生防菌的抑菌效果。

生防真菌接種法：將已分離純化的生防真菌十字對(duì)稱接種于距離病原菌中央25 mm 處，對(duì)照僅接種病原菌，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

生防細(xì)菌接種法：將已分離純化的生防細(xì)菌轉(zhuǎn)移到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，再將滅菌過的打孔濾紙圓片在菌懸液種浸泡15 min，用鑷子將濾紙圓片十字對(duì)稱接種于距離病原菌中央25 mm 處。

利用ImageJ 圖形處理軟件計(jì)算各處理和對(duì)照的病原菌菌落面積，操作步驟參照羅德義等［13］方法進(jìn)行，計(jì)算抑制率：

式中SCK為對(duì)照菌落面積，ST為處理菌落面積。

1.5.2 生防菌形態(tài)學(xué)鑒定 將兩株生防真菌在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后，先通過肉眼觀察培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)特征，再在顯微鏡下觀察其菌絲和孢子的形態(tài)。將兩株生防細(xì)菌在28℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后，通過肉眼觀察培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)特征。

1.5.3 生防菌分子生物學(xué)鑒定 生防真菌的分子生物學(xué)鑒定方法同1.2.4。生防細(xì)菌（WHD03、WHD04）采用北京索萊寶科技有限公司（Solarbio）細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，參照黃婉媛等［14］方法進(jìn)行，利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。之后將PCR 產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序成功后將所得測(cè)序獲得的16S rRNA 部分序列經(jīng)BLAST 同源比對(duì)后，從GenBank 中獲取同源性較高的種、屬的16S rRNA 序列，使用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 生防菌發(fā)酵液制備及抑菌能力測(cè)定

生防真菌發(fā)酵液參照賀字典等［15］和王立祥等［16］方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，用5 mm 打孔器打孔后，挑取3～5 個(gè)生防真菌的菌餅接種于裝有100 mL PDB 培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶（已滅菌）中，28 ℃、160 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)120 h。生防真菌的發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min 離心50 min，收集上清液，用0.22 μm 無菌過濾器過濾各生防菌的發(fā)酵液，得到無菌發(fā)酵液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

生防細(xì)菌發(fā)酵液參照安福濤等［17］方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，用接種環(huán)挑取菌體接種于裝有100 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯的250 mL 的錐形瓶（已滅菌）中，38 ℃、160 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)120 h，得到生防細(xì)菌發(fā)酵液，再經(jīng)4 000 r/min 離心60 min，收集上清液，用0.22 μm 無菌過濾器過濾各生防菌的發(fā)酵液，得到無菌發(fā)酵液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用菌絲生長(zhǎng)速率法［18］，分別取0.5、1、2 mL 無菌發(fā)酵液與9.5、9、8 mL PDA 培養(yǎng)基混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中制成帶發(fā)酵液的平板，發(fā)酵液的濃度分別為50、100、200 mL/L。在含發(fā)酵液的平板中央接種尖孢鐮刀菌菌餅1 個(gè)，28℃恒溫培養(yǎng)5～6 d 后，按照以下公式計(jì)算其菌絲生長(zhǎng)抑制率，各處理和對(duì)照均3 次重復(fù)。

式中，DCK為對(duì)照菌落直徑，DT為處理菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病性測(cè)定

通過組織分離法共分離得到28 株分離株，通過科赫氏法則驗(yàn)證，其中12 株分離株回接后可導(dǎo)致明顯的多花黃精根腐病，表明其為多花黃精根腐病的病原菌，分別命名為2GF1、2GF52、2GF15-1、2GF28-1、2GF11-3、2GF8、2GF24、3GF1、3GF1-2、3GF5-2、3GF5-3、3GF8，對(duì)照發(fā)生明顯病變（圖1）。菌株2GF1 導(dǎo)致的根腐病最為嚴(yán)重，從發(fā)病組織分離得到相同菌株。

圖1 多花黃精根腐病田間癥狀及分離株致病性驗(yàn)證Fig. 1 Field symptoms of Polygonatum cyrtonema Hua root rot and pathogenicity verification of isolates

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 12 株病原菌在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后的形態(tài)基本一致（圖2），病原菌整個(gè)群落呈圓形，邊緣為乳白色，中間稍凸起，底部呈淡紫色；菌絲體生長(zhǎng)旺盛且不透明。顯微觀察結(jié)果表明，其分生孢子為橢圓型或鐮刀形，分生小孢子較多且無分隔，兩端鈍圓；大孢子具有3～4 個(gè)分隔，兩端梭形，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將12 株病原菌初步鑒定為鐮刀菌。

圖2 病原菌形態(tài)學(xué)特征Fig. 2 Morphological traits of the pathogens

2.2.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 以通用引物ITS對(duì)12 株病原菌的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，在NCBI BLAST 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)12 株病原菌的ITS 序列與菌株MNFo15（登錄號(hào)：OP456684）、菌株FOFB62（登錄號(hào)：HQ651161）、菌株B2（登錄號(hào)：MZ060273）在序列上相似性為100%。系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）顯示，12株病原菌與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（HQ905450、KX463005）等菌聚為一支，同源性為94%。因此，根據(jù)12 株菌株的形態(tài)學(xué)特征以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將貴州多花黃精根腐病病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌。

圖3 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed based on ITS sequences

2.3 生防菌對(duì)尖孢鐮刀菌的生防效果

為獲得對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑制活性的生防菌株，采用平板對(duì)峙法進(jìn)行初步篩選。結(jié)果（圖4）表明，4 株生防菌株對(duì)尖孢鐮刀菌均有較好抑制作用，生防效果良好。其中，菌株WHD01 的抑菌效果最好、抑菌率為95.21%；菌株WHD04 次之、抑菌率為78.99%；菌株WHD3 的抑菌率為77.96%；菌株WHD2 的抑菌效果最差，但抑菌率也達(dá)67.95%。

圖4 4 株生防菌與尖孢鐮刀菌的平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果Fig. 4 Results of dual-culture tests between 4 biocontrol bacterias and Fusarium oxysporum

2.4 生防菌的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 純化的生防真菌WHD01 在PDA 培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，培養(yǎng)5 d 后，菌落長(zhǎng)滿平板，前期有少量的白色氣生菌絲，后期氣生菌絲逐漸長(zhǎng)滿平板，質(zhì)地絮狀，產(chǎn)生大量淡綠色分生孢子，形成分生孢子堆，分生孢子堆圍繞中心菌餅成空心圓狀，菌落逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色。顯微鏡下觀察，菌絲光滑有分枝、具隔膜、無色纖維狀、側(cè)枝末端產(chǎn)生分生孢子梗、具2～3 輪生分枝、單生或?qū)ι?、簇生狀排列。分生孢子外壁光滑，為亞球形或卵圓形（圖5）。

圖5 菌株WHD01菌落（A）、菌絲和分生孢子（B）的形態(tài)特征Fig. 5 Morphological traits of colony (A),mycelium and conidial spores (B) of strain WHD01

純化的生防真菌WHD02 在PDA 培養(yǎng)基上的菌落呈圓形。該真菌生長(zhǎng)較慢，在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d 后，菌落長(zhǎng)滿平板，菌絲較薄，在平板上平伏貼生，圍繞中心菌餅呈同心圓輪紋、疏松棉絮網(wǎng)狀，后期產(chǎn)生大量白色孢子，靠近中心菌餅的圓紋的菌落產(chǎn)淡黃色素。顯微鏡下觀察，菌絲多分枝、光滑、較厚、有隔膜。具有擔(dān)子和擔(dān)孢子，擔(dān)子呈棍棒狀，擔(dān)孢子則呈橢圓狀，壁薄光滑（圖6）。

圖6 菌株WHD02 菌落（A）、菌絲（B）和擔(dān)孢子（C）的形態(tài)特征Fig. 6 Morphological traits of colony (A),mycelium (B)and sporidium (C) of strain WHD02

菌株WHD03 在PDA 培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)結(jié)果如圖7A 所示，其菌落呈淺黃色或者乳白色，菌落邊緣不規(guī)則，表面不濕潤(rùn)、無光澤且不透明。菌株WHD04 在PDA 培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)結(jié)果如圖7B所示，其菌落呈乳白色，菌落邊緣不整齊，呈橢圓形，且表面干燥、不光滑呈褶皺狀。

圖7 菌株WHD03（A）和WHD04（B）的菌落Fig. 7 Colonies of strain WHD03 (A) and WHD04 (B)

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定 以菌株WHD01 的基因組DNA 為模板，用ITS 引物擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約為594 bp 的序列，將所得DNA 序列在NCBI 進(jìn)行BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與綠木霉菌Trichoderma virensX2-70 的同源性高達(dá)100%。對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，菌株WHD01 與T.virens聚于同一分支，同源性為73%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株WHD01 為綠木霉菌。

圖8 生防菌株WHD01 的ITS 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 Phylogenetic tree of biocontrol bacteria WHD01 based on ITS sequences

以菌株WHD02 的基因組DNA 為模板,用ITS 引物擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約為612 bp 的序列，將所得DNA 序列在NCBI 官網(wǎng)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，該序列與大伏革菌Phlebiopsis giganteaVA-APP_VA 的同源性高達(dá)100%。對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，菌株WHD02 與P.gigantea聚于同一分支，同源性為99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株WHD02 為大伏革菌。

圖9 生防菌株WHD02 的ITS 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 9 Phylogenetic tree of biocontrol bacteria WHD02 based on ITS sequences

以菌株WHD03 的基因組DNA 為模板，用16S rRNA 引物擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約為1 457 bp 的序列，將所得DNA 序列在NCBI 官網(wǎng)進(jìn)行BLAST比對(duì)，該序列與Bacillus amyloliquefaciensPP19的同源性高達(dá)99%。對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹（圖10）進(jìn)行分析，菌株WHD03 與B.amyloliquefaciens聚于同一分支，同源性為90%，將菌株WHD03 鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。

圖10 生防菌株WHD03 的16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 10 Phylogenetic tree of biocontrol bacteria WHD03 based on 16S rRNA sequences

以菌株WHD04 的基因組DNA 為模板,用16S rRNA 引物擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度約為1 460 bp 的序列，將所得DNA 序列在NCBI 官網(wǎng)上進(jìn)行BLAST比對(duì)，該序列與Bacillus velezensisA28 的同源性高達(dá)99%。對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹（圖11）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，菌株WHD04 與B.velezensis聚于同一分支，同源性為72%，初步將菌株WHD04 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖11 生防菌株WHD04 的16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 11 Phylogenetic tree of biocontrol bacteria WHD04 based on 16S rRNA sequences

2.5 生防菌株發(fā)酵液的抑菌效果

通過平板對(duì)峙法篩選出對(duì)尖孢鐮刀菌具有生防作用的菌株共4 株，采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)4 株生防菌的發(fā)酵液的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。如圖12 所示，4 株生防菌株不同濃度的無菌發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌均有不同程度的抑制作用，尖孢鐮刀菌在4 種含無菌發(fā)酵液的平板上均被不同程度地抑制，但發(fā)酵液的抑菌效果卻與平板對(duì)峙的結(jié)果差異顯著，其抑菌效果與生防菌發(fā)酵液的濃度呈正相關(guān)。如表1 所示，當(dāng)生防菌株WHD01（T.virens）、WHD02（P.gigantea）、WHD03（B.amyloliquefaciens）、WHD04（B.velezensis）無菌發(fā)酵液制成的平板發(fā)酵液濃度為50 mL/L 時(shí)，對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率分別為30.81%、14.60%、22.77%、15.22%；當(dāng)平板發(fā)酵液濃度為100 mL/L時(shí)，抑制率分別為31.35%、20.38%、27.77%、20.21%；當(dāng)平板發(fā)酵液濃度為200 mL/L 時(shí)，抑制率分別為32.70%、26.72%、33.05%、33.52%。其中，解淀粉芽孢桿菌無菌發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌的最高抑制率為33.05%?？偟膩碚f，T.virens菌株3 個(gè)濃度發(fā)酵液的抑菌能力高于其他生防菌株，（均高于30%），但差異不顯著，可能與濃度梯度有關(guān)，平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明綠木霉菌具有一定的生防潛力。P.gigantea菌株3 個(gè)濃度發(fā)酵液的抑菌能力最差，均低于30%。

表1 不同濃度的生防菌株發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibition effects of different concentrations of fermentation broth from four biocontrol bacterias on mycelial growth of Fusarium oxysporum

3 討論

粱忠厚等［5］對(duì)湖南多花黃精根腐病病原進(jìn)行分離鑒定，確定F.foetens和F.hostae是引起湖南多花黃精根腐病的致病菌。韓鳳等［4］為明確重慶地區(qū)多花黃精根腐病的病原菌，對(duì)渝產(chǎn)多花黃精根腐病病原菌進(jìn)行分離與鑒定，確定尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌是引起多花黃精根腐病的病原菌。本研究發(fā)現(xiàn)，從貴州省臺(tái)江縣采集的多花黃精根腐病上分離得到的12 株病原菌均為尖孢鐮刀菌，表明尖孢鐮刀菌為貴州臺(tái)江多花黃精根腐病的主要病原，不同地區(qū)多花黃精根腐病的病原有所差異，可能是由于地理差異造成的。

本研究篩選出4 株能顯著抑制多花黃精根腐病的生防菌，即綠木霉（Trichoderma virens）、大伏革菌（Phlebiopsis gigantea）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。這4 種菌株分離于多花黃精及多花黃精種植的根際土壤，無致病性，同時(shí)還能抑制多花黃精根腐病病原菌的生長(zhǎng)。木霉菌、木霉菌發(fā)酵液和揮發(fā)性物質(zhì)均可有效抑制病原菌的生長(zhǎng)，如棘孢木霉代謝液對(duì)16 種真菌病原菌的生長(zhǎng)抑制率達(dá)56.65%～87.62%，對(duì)小麥全蝕病菌病原菌抑制明顯［19］。李春霞等［20］研究表明，哈茨木霉菌對(duì)甜瓜枯萎病病原菌具有明顯的抑制作用，對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率最高可達(dá)77.18%，其揮發(fā)性物質(zhì)抑制率最高為18.73%，發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制率最高為22.79%。短密木霉發(fā)酵液能在24 h 內(nèi)完全抑制香蕉枯萎病病原菌孢子的萌發(fā)［21］。芽孢桿菌屬對(duì)多種造成植物病害的病原真菌具有較好的生防作用，因此常被作為生防制劑進(jìn)行研究。陳爽［22］發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）對(duì)大豆根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的抑菌率可達(dá)64.6%，可以提高大豆株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、莖粗及葉綠素含量，具有較明顯的促生作用?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵液對(duì)紫花苜蓿根腐病病原菌的抑制率為44.9%～77.4%［23］。李超楠等［24］研究表明，枯草芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌對(duì)北蒼術(shù)根腐病具有防治作用。本研究篩選出的4 株多花黃精根腐病的生防菌具有較好的抑制作用，可為多花黃精根腐病的生物防治提供理論基礎(chǔ)。多花黃精作為臺(tái)江縣的中藥材，本研究明確了該地區(qū)多花黃精根腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），并篩選出對(duì)該病原菌有效的生防菌，可為構(gòu)建安全有效的生物防治技術(shù)體系、規(guī)范中藥材種植技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從多花黃精根腐病病株上分離得到12株多花黃精根腐病病原菌，并鑒定其均為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。通過平板對(duì)峙試驗(yàn)對(duì)4 株生防菌株（WHD01～WHD04）的抑菌能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析鑒定其分別為綠木霉、大伏革菌、解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。4 株生防菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果分別為95.21%、67.95%、77.96%和78.99%，其中WHD01 的抑菌作用最強(qiáng)。當(dāng)菌株發(fā)酵液濃度為200 mL/L 時(shí)，4 株生防菌株對(duì)尖孢鐮刀菌抑制率分別為32.70%、26.72%、33.05%、33.52%。4株生防菌株對(duì)尖孢鐮刀菌有良好的抑制作用，具有一定的生防潛力，可為下一步開發(fā)生防菌劑奠定基礎(chǔ)。