林占軍, 湯江武, 陳小龍, 李達(dá), 李清聲*

(1.葳龍生物科技 (浙江) 有限公司, 浙江 杭州 310021; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 浙江 杭州 310021;3.浙江農(nóng)藝師學(xué)院, 浙江 杭州 310021)

除草劑是指可使雜草徹底地或選擇性地發(fā)生枯死的藥劑, 可分為選擇性除草劑與非選擇性除草劑。目前, 除草劑已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中至關(guān)重要的物料。據(jù)統(tǒng)計(jì), 2020 年全球除草劑市場份額占農(nóng)藥總市場的44.2%, 超過殺菌劑 (27.1%) 和殺蟲劑 (25.3%)。但隨著農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)要求和公眾健康意識的提高, 長期使用化學(xué)除草劑既有污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn), 也存在食品安全隱患[1-2]。研制廣譜、高效、低毒的生物除草劑既有重要性與必要性, 且迫在眉睫。

生物除草劑是指自然界中可用于除草的生物(包括微生物、植物和動物) 或其組織、代謝物的生物制劑[3-4]。自然界中的植物致病微生物 (真菌、細(xì)菌、病毒) 是開發(fā)生物除草劑的重要來源[5]。微生物發(fā)酵所得的活性產(chǎn)物包括病毒毒素、細(xì)菌毒素和真菌毒素等, 相關(guān)毒素具有特定或廣譜的抑草能力[6]。本研究前期發(fā)現(xiàn), 枯草芽孢桿菌、膠凍樣類芽孢桿菌等系列微生物菌劑與發(fā)酵所得的代謝產(chǎn)物具有抑草能力, 現(xiàn)將發(fā)酵所得微生物菌劑施用于茶園以評價(jià)除草效果與對茶樹生理形態(tài)、生化指標(biāo)、感官品質(zhì)的影響。通過該研究希望能夠?yàn)樯锍輨┭邪l(fā)提供思路, 并為茶葉領(lǐng)域應(yīng)用做好基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用微生物菌劑為枯草芽孢桿菌、膠凍樣類芽孢桿菌等系列微生物發(fā)酵所得。試劑包括沒食子酸、咖啡堿、兒茶素單體 (8 種)、氨基酸 (20種) 等, 均購于Sigma 公司; 乙腈、甲醇、乙酸為色譜純, 購于Aladdin 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)條件與周期

本研究抑草效果試驗(yàn)布置于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地 (120.21°E, 30.31°N), 茶葉生理生化與品質(zhì)評價(jià)試驗(yàn)布置于杭州茗竹生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司茶葉基地 (119.87°E, 30.40°N)。將微生物菌劑稀釋為3 個組別, 分別是75 倍 (75 組)、150 倍(150 組)、300 倍 (300 組)。

抑草效果試驗(yàn): 菌劑稀釋液噴施于幼齡茶行間雜草植株上或土層表面, 每667 m2稀釋液施用量為40 L, 菌劑施用時間為2022 年6 月25 日, 試驗(yàn)周期為7 d; 抑草效果與草銨膦對比, 草銨膦根據(jù)使用說明噴施相當(dāng)?shù)氖┯昧俊?/p>

茶葉生理指標(biāo)與感官審評: 菌劑稀釋液噴施于成齡茶行間雜草植株或土層表面, 每667 m2稀釋液施用量為40 L, 菌劑施用時間為2022 年6 月25日, 茶樣取樣時間為2022 年9 月25 日; 對照組(CK) 為同區(qū)域未施用微生物菌劑的茶樹。

1.2.2 茶樹抑草效果鑒定

草銨膦與微生物菌劑噴施后, 分別于0、3、7 d 拍照取證, 觀察茶園雜草的枯萎和死亡狀況,并作對比。

1.2.3 茶樹生理指標(biāo)

在茶樹鮮葉采摘前, 每個處理小區(qū)隨機(jī)取3 個點(diǎn), 調(diào)查每個點(diǎn) (33.3 cm×33.3 cm) 10 cm 葉層范圍內(nèi)萌動芽以上的芽梢數(shù)。在茶園隨機(jī)取100 個一芽一葉, 稱重, 重復(fù)3 次, 取平均數(shù)記為百芽重。

1.2.4 茶樣制備

以綠茶固定樣制備法處理茶樣。所取茶樹新梢攤放4 h, 微波殺青1.5 min, 80 ℃烘干4 h (回潮2 次)。4 ℃冰箱儲存用于后續(xù)研究。

1.2.5 茶湯提取

稱0.150 0 g 干茶 (研磨至粉末), 加入25 mL的50%乙醇, 70 ℃浸提20 min, 隔5 min 搖一次。搖勻溶液轉(zhuǎn)入10 mL 離心管內(nèi), 5 000 r·min-1室溫離心10 min, 取上清液至新的10 mL 離心管,4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 茶多酚總量測定

酒石酸亞鐵溶液配制: 稱取1 g (準(zhǔn)確至0.000 1 g) 硫酸亞鐵, 5 g 酒石酸鉀鈉 (準(zhǔn)確至0.000 1 g), 用水溶解并定容至1 L (低溫保存,有效期10 d)。

pH 值7.5 磷酸緩沖溶液配制: 稱取23.9 g 十二水磷酸氫二鈉, 加水溶解后定容至1 L 為1/15 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液。稱取經(jīng)110 ℃烘干2 h的磷酸二氫鉀9.08 g, 加水溶解后定容至1 L 為1/15 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液。取上述磷酸氫二鈉溶液85 mL 和磷酸二氫鉀15 mL 混合均勻。

準(zhǔn)確取茶湯1 mL, 注入25 mL 的容量瓶中,加4 mL 水和5 mL 酒石酸亞鐵溶液, 充分混合, 再加pH 值7.5 的磷酸鹽緩沖液至刻度, 在波長540 nm 處, 以空白溶液作對照, 測定吸光度, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 游離氨基酸總量測定

取1/15 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液95 mL 和1/15 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液5 mL, 混勻?yàn)閜H值8.0 的磷酸鹽緩沖液。

稱取水合茚三酮 (純度不低于99%) 2 g, 加50 mL 水和80 mg 二水氯化亞錫攪拌均勻。分次加少量水溶解, 放在暗處, 靜置24 h, 過濾后加水定容至100 mL 為2%茚三酮溶液。

稱取100 mg 茶氨酸或谷氨酸 (純度不低于99%) 溶于100 mL 水中, 作為母液, 準(zhǔn)確吸取5 mL 母液, 加水定容至50 mL 作為工作液 (1 mL含茶氨酸或谷氨酸0.1 mg)。

分別吸取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 氨基酸工作液于一組25 mL 容量瓶中, 各加水4 mL、pH 值8.0 磷酸鹽緩沖液0.5 mL 和2% 茚三酮0.5 mL, 在沸水浴中加熱15 min, 冷卻后加水定容至25 mL。放置10 min 后, 在570 nm 處, 以試劑空白溶液作對照, 測定吸光度, 制作氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確吸取茶湯1 mL, 注入25 mL 的容量瓶中,加0.5 mL pH 值8.0 的磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%茚三酮溶液, 按上述步驟測定氨基酸含量。

1.2.8 兒茶素類及咖啡堿測定

使用HPLC (日本島津LC-20AD) 檢測兒茶素與生物堿組分。分析條件如下: 10 μL 進(jìn)樣量, 流速1 mL·min-1, 安捷倫TC 4.6 mm×250 mm C18色譜柱, 35 ℃柱溫, 紫外檢測波長為280 nm; 流動相A 配比為乙腈∶乙酸∶水=3.0 ∶0.5 ∶96.5,流動相B 配比為乙腈∶乙酸∶水= 30.0 ∶0.5 ∶69.5; 梯度洗脫條件為35 min 內(nèi)流動相B 從20%線性增加至65%。參照兒茶素及咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品的色譜行為, 對樣品中目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定性定量。

1.2.9 感官審評

采集各組別茶樣, 邀請國家評茶員參照GB/T 23776—2018 進(jìn)行感官審評。取3.0 g 茶樣, 用150 mL 沸水沖泡5 min 后, 按外形 (25%)、湯色(10%)、香 氣 (25%)、滋 味 (30%) 及 葉 底(10%) 統(tǒng)計(jì)打分。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

各處理設(shè)置3 個重復(fù), 使用SPSS 18 進(jìn)行方差分析, 差異性用最小顯著差異法 (LSD) 分析,P<0.05 為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹生理指標(biāo)

2.1.1 抑草效果

試驗(yàn)雜草對象為狼尾草, 稀釋75 倍 (75 組)與稀釋150 倍 (150 組) 的微生物菌劑均具有抑草效果, 且抑草效果與草銨膦相當(dāng); 稀釋300 倍(300 組) 的微生物菌劑的抑草效果弱于草銨膦。微生物菌劑噴施之后, 莖與葉片自3 d 起, 逐步發(fā)黃、枯萎; 7 d 時狼尾草地上部分死亡。幼齡茶苗未出現(xiàn)生理衰退現(xiàn)象, 莖干和葉片均正常生長, 且與對照組無差異 (圖1)。

圖1 微生物菌劑 (150 倍稀釋) 的抑草效果

2.1.2 發(fā)芽密度

成齡茶園以每個點(diǎn) (33.3 cm × 33.3 cm)10 cm 葉層范圍內(nèi)萌動芽以上的芽梢數(shù)為統(tǒng)計(jì)對象, 每組3 個點(diǎn)位。對照組茶樹發(fā)芽22.9 個, 75組茶樹發(fā)芽15.6 個, 150 組茶樹發(fā)芽24.6 個,300 組茶樹發(fā)芽25.5 個。75 組的發(fā)芽數(shù)為對照組的68.1%, 150 組和300 組的發(fā)芽數(shù)與對照組差異不顯著 (圖2)。

圖2 微生物菌劑對茶樹發(fā)芽的影響

2.1.3 百芽重 (一芽一葉)在茶園隨機(jī)取100 個一芽一葉, 稱重, 重復(fù)3次。對照組百芽重為22.33 g, 75 組百芽重為18.33 g, 150 組百芽重為20.67 g, 300 組百芽重為23.33 g。75 組的百芽重為對照組的82.1%, 150 組和300組的百芽重與對照組無顯著差異(圖3)。

圖3 微生物菌劑對茶樹百芽重的影響

2.2 茶葉生化檢測結(jié)果

2.2.1 茶多酚和氨基酸含量

對照組、75 組、150 組、300 組茶多酚含量分別為24.07%、21.91%、23.75%、24.44%; 對照組、75 組、150 組、300 組 氨 基 酸 含 量 分 別 為2.82%、3.16%、2.92%、2.78%。75 組的酚氨比最低 (表1)。

表1 茶多酚和氨基酸含量檢測結(jié)果

2.2.2 兒茶素類和咖啡堿含量

各組別兒茶素類和咖啡堿含量如表2, 其中75組表沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯含量最低, 300 組咖啡堿含量最低。300組的兒茶素類與咖啡堿含量與對照組最接近, 75組的兒茶素類與對照組差異最明顯。

表2 兒茶素類和咖啡堿HPLC 含量 單位:%

2.3 茶葉審評

對各組別所制茶樣進(jìn)行感官品質(zhì)評價(jià)。其中,75 組的各項(xiàng)指標(biāo)與總分均最高, 300 組的總分最低; 但對照組、150 組、300 組的總分差異不明顯(表3)。

表3 茶葉感官評價(jià)結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以微生物菌劑為試驗(yàn)對象, 研究其對茶園雜草的抑草效果、茶樹生理狀態(tài)、生化指標(biāo)和感官品質(zhì)的影響。結(jié)果表明, 稀釋75 倍的微生物菌劑處理茶園, 使茶樹發(fā)芽密度降低31.9%、百芽重降低17.9%, 但具有降低茶多酚、提高氨基酸的作用, 且感官品質(zhì)有所提高; 稀釋150 倍與稀釋300 倍的微生物菌劑處理茶園對茶樹發(fā)芽密度與百芽重影響總體不顯著, 且對茶葉茶多酚、氨基酸、感官品質(zhì)影響總體不顯著。本研究初步探明以枯草芽孢桿菌、膠凍樣類芽孢桿菌等系列微生物發(fā)酵所得制劑, 具有茶園抑草效果, 且在150 倍或者更低原液濃度的稀釋條件下, 對茶樹生理生化與感官品質(zhì)無影響。本研究涉及的技術(shù)有望推動微生物菌劑在茶園抑草中的應(yīng)用。