張寒娟 ，丁建強(qiáng) ，韓文超 ，陳永妍 ，王高彪 ，丁蕊 ，袁冬冬 （.鄭州市第七人民醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 45006；.武警河南總隊(duì)醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 45005）

嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）作為新型抗代謝免疫抑制劑在器官移植中被廣泛應(yīng)用，其口服吸收后，可迅速水解為次級(jí)代謝產(chǎn)物——霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）[1—2]。MPA的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（area under the plasma concentration-time curve of MPA，MPA-AUC）與其臨床療效和藥物不良反應(yīng)（adverse drug reaction，ADR）密切相關(guān)，但不同受者服用相同劑量的MMF，其MPA-AUC個(gè)體差異可達(dá)10倍[3]。MPA在代謝過(guò)程中存在肝腸循環(huán)現(xiàn)象，導(dǎo)致其谷濃度難以反映真實(shí)的治療效應(yīng)，目前臨床多推薦MPA-AUC0-12h作為MMF的治療藥物監(jiān)測(cè)指標(biāo)[4]。但是測(cè)定一個(gè)完整12 h給藥間隔的AUC，往往存在采樣點(diǎn)密集、受者依從性差等缺陷[5]，因此，MPA血藥濃度監(jiān)測(cè)通常采取有限采樣（limited sampling strategy，LSS）法，即利用1～4個(gè)采樣點(diǎn)預(yù)估MPA-AUC0-12h，操作方便、更具臨床可行性[6—7]。目前關(guān)于腎移植受者估算MPA-AUC0-12h模型的研究大多為腎移植術(shù)后穩(wěn)定期受者[8]，但由于早期受者合并用藥較多、生理指標(biāo)未完全恢復(fù)等，移植早期反而更易出現(xiàn)MPA暴露量不足（MPA-AUC0-12h＜30 mg·h/L）的情況，且患者的藥動(dòng)學(xué)特征可能與穩(wěn)定期受者存在差異，因此建立腎移植受者早期的MPA-AUC0-12h估算模型非常必要[9—10]。為此，本研究納入了腎移植術(shù)后15 d的受者，采用LSS法建立了腎移植受者早期MPA暴露量的估算模型，旨在為臨床監(jiān)測(cè)MPA的暴露量提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021-2022年在鄭州市第七人民醫(yī)院首次接受腎移植手術(shù)的患者。本研究方案通過(guò)鄭州市第七人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批件編號(hào)為2021-05-001），并且所有參與本試驗(yàn)的患者在試驗(yàn)前均被告知試驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容，并簽署知情同意書。

本研究的入選標(biāo)準(zhǔn)為：（1）術(shù)后接受MMF+他克莫司+甲潑尼龍三聯(lián)免疫抑制治療方案；（2）1周內(nèi)MMF給藥劑量無(wú)變化；（3）可以獲得完整的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

本研究的排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）有肝炎或肝功能異常受者；（2）同時(shí)服用含有氫氧化鎂或氫氧化鋁等抗酸劑或考來(lái)烯胺等可能影響MPA吸收及肝腸循環(huán)的藥物者；（3）有活動(dòng)性消化道潰瘍者，存在嚴(yán)重免疫抑制藥相關(guān)藥物不良反應(yīng)者，尤其是胃腸道反應(yīng)者；（4）近期發(fā)生臨床確診的急性排斥反應(yīng)或感染者。

1.2 免疫抑制治療方案

所有參與試驗(yàn)的腎移植受者均采用三聯(lián)免疫抑制方案：MMF+他克莫司+甲潑尼龍：術(shù)后首日開始口服嗎替麥考酚酯分散片（杭州中美華東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20052083，規(guī)格0.25 g）500 mg，q12 h，術(shù)后3 d調(diào)整劑量為750 mg，q12 h；術(shù)后2 d左右開始口服他克莫司膠囊（杭州中美華東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20084514，規(guī)格1 mg）1 mg，q12 h，并根據(jù)他克莫司血藥濃度調(diào)整劑量；術(shù)前、術(shù)后第1天、術(shù)后第2天給予兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白（Genzyme Polyclonals S.A.S.，國(guó)藥準(zhǔn)字J20150136，規(guī)格25 mg/瓶）25 mg，qd（親屬腎移植除外）；術(shù)后第1天靜脈滴注注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（Pfizer Manufacturing Belgium NV，國(guó)藥準(zhǔn)字HJ20170197，規(guī)格4 mg）500 mg qd，術(shù)后第2天調(diào)整劑量為250 mg，qd，術(shù)后第3天起改為口服甲潑尼龍片（Pfizer Italia Srl，國(guó)藥準(zhǔn)字H20150245，規(guī)格4 mg）8 mg，qd維持。

1.3 檢測(cè)儀器與試劑

本研究所用主要儀器包括2D-LC-UV全自動(dòng)二維液相色譜-紫外檢測(cè)系統(tǒng)[由FLC2420全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司）以及液相色譜LC-20AT部件（日本島津公司）構(gòu)成]、XW-80A型渦旋混合儀（上海琪特分析儀器有限公司）、TDZ4-WS型低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、Mini-15K微型高速離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）。

Aston SC2T（3.5 mm×50 mm，5 μm）色譜柱、Aston SBR（3.0 mm×10 mm，5 μm）色譜柱、Aston SBX4（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱、MPA質(zhì)控品（批號(hào)20210922）、MPA校準(zhǔn)品（批號(hào)20191120）、ORG-2去蛋白劑（批號(hào)20210705）、MPA-1A移動(dòng)相、MPA-2A移動(dòng)相均購(gòu)于湖南德米特儀器有限公司；試驗(yàn)用水為怡寶純凈水。

1.4 血樣采集方法

待受者服用MMF達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，于術(shù)后第15天采集當(dāng)日服藥前以及服藥后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0 h的血樣，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，以3 000 r/min離心5 min，取上清液放于-20 ℃冰箱中，待測(cè)。

1.5 血藥濃度測(cè)定方法

本研究采用本課題組已建立的全自動(dòng)二維液相色譜法測(cè)定人血漿中MPA的濃度[11]。取血漿400 μL，加至含1 000 μL ORG-2去蛋白劑的1.5 mL聚丙烯管中，渦旋混勻后，置于高速離心機(jī)中，以14 500 r/min離心10 min，取上清液，置于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。色譜條件如下：一維色譜柱為Aston SC2T（3.5 mm×50 mm，5 μm），一維流動(dòng)相為MPA-1A移動(dòng)相，流速為0.8 mL/min；轉(zhuǎn)移柱為Aston SBR（3.0 mm×10 mm，5 μm），流動(dòng)相為純凈水；二維色譜柱為Aston SBX4（4.6 mm×150 mm，5 μm），二維流動(dòng)相為MPA-2A移動(dòng)相；各色譜柱柱溫均為40 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為304 nm，采用等度洗脫，進(jìn)樣量為200 μL。經(jīng)檢驗(yàn)，MPA在0.32～25.03 μg/mL線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；該方法的各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均符合生物樣品測(cè)定要求。

1.6 分析指標(biāo)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件錄入數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以±s表示；使用WINNOLIN軟件進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)分析，計(jì)算給藥前血藥濃度（c0）、藥峰濃度（cmax）、藥峰時(shí)間（tmax）、半衰期（t1/2）、AUC0-12h；使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用多元逐步回歸法，分析各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MPA濃度（任意一點(diǎn)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)）與AUC0-12h的相關(guān)性，根據(jù)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)系數(shù)（R2），逐步回歸分析得到R2較大的簡(jiǎn)化計(jì)算公式。再按下列公式計(jì)算相對(duì)預(yù)測(cè)誤差（relative prediction error，RPE）、相對(duì)預(yù)測(cè)誤差絕對(duì)值（absolute relative prediction error，ARPE）、平均相對(duì)預(yù)測(cè)誤差（mean relative prediction error，MRPE）：RPE（%）＝（AUC預(yù)測(cè)值-AUC實(shí)測(cè)值）/AUC實(shí)測(cè)值×100%，ARPE（%）＝|RPE|，MRPE（%）＝1/n∑ARPEi（i指患者編號(hào)）；使用擬合曲線評(píng)價(jià)MPA簡(jiǎn)化計(jì)算公式與MPA-AUC0-12h的擬合情況；使用GraphPad Prism 8.0軟件中的Bland-Altman方法評(píng)價(jià)簡(jiǎn)化計(jì)算公式預(yù)測(cè)值與經(jīng)典藥動(dòng)學(xué)方法之間的一致性，使用x±1.96SD（SD即標(biāo)準(zhǔn)差）來(lái)繪制上下限的線表示數(shù)據(jù)的離散程度，覆蓋95%的數(shù)據(jù)[12]。

2 結(jié)果

2.1 受者基本資料

本研究納入腎移植受者20名，其中男性17例（占85.0%），女性3例（占15.0%）；平均年齡（36.00±7.83）歲，平均體重（66.17±7.41）kg，體重指數(shù)（22.53±2.40）kg/m2。他克莫司的谷濃度為（7.93±1.71）ng/mL、峰濃度為（18.24±5.43）ng/mL，白蛋白水平為（40.94±2.62）g/L，血肌酐水平為（97.80±24.47）μmol/L。

2.2 MPA的藥動(dòng)學(xué)特征

20例腎移植受者的MPA-AUC曲線（圖1）顯示，部分受者曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，MPA的c0、cmax、tmax變異度相差較大。MPA的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（表1）如下：c0為（1.53±0.84）μg/mL，cmax為（12.07±5.97）μg/mL，t1/2為（5.41±3.67）h，tmax為（1.58±0.75）h，fAUC0-12h（按經(jīng)典藥動(dòng)學(xué)方法計(jì)算出的AUC0-12h）為（33.95±13.40）μg·h/mL。

表1 20例腎移植受者體內(nèi)MPA藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖1 20例腎移植受者體內(nèi)MPA-AUC曲線圖

2.3 多元回歸模型的分析結(jié)果

將單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MPA血藥濃度與fAUC0-12h進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表2）顯示，單一時(shí)間點(diǎn)的MPA血藥濃度與fAUC0-12h相關(guān)性均較低（R2＝0.008～0.826），其中，c0與fAUC0-12h的相關(guān)系數(shù)R2僅為0.186，6.0、8.0 h時(shí)的MPA血藥濃度與fAUC0-12h的相關(guān)性最高，R2分別為0.792、0.826。

表2 MPA-AUC0-12 h簡(jiǎn)化計(jì)算公式及相關(guān)參數(shù)

進(jìn)一步將MPA多個(gè)時(shí)間點(diǎn)血藥濃度與fAUC0-12h通過(guò)多元線性逐步回歸分析擬合簡(jiǎn)化計(jì)算公式，結(jié)果（表2）顯示，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MPA血藥濃度所擬合出的簡(jiǎn)化計(jì)算公式的R2明顯高于單個(gè)時(shí)間點(diǎn)，且公式納入的采樣點(diǎn)越多，擬合出的簡(jiǎn)化計(jì)算公式的R2就越高?？紤]到檢測(cè)成本和受者的依從性，以2～4個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為采樣點(diǎn)較為合適。經(jīng)分析，“4.0、8.0、12.0 h”三點(diǎn)采樣和“1.0、4.0、8.0、12.0 h”四點(diǎn)采樣這兩種采樣時(shí)間點(diǎn)組合的R2分別為0.934、0.961，MRPE分別為9.96%、8.65%，ARPE＞15%的比例均為10%，R2均高于“4.0、8.0 h”兩點(diǎn)采樣（R2為0.890），MRPE和ARPE＞15%的比例均低于“4.0、8.0 h”兩點(diǎn)采樣（MRPE為12.30%，ARPE＞15%的比例為20%）?？梢?，三點(diǎn)采樣和四點(diǎn)采樣的預(yù)測(cè)精度相當(dāng)，均優(yōu)于兩點(diǎn)采樣。考慮到采樣時(shí)間點(diǎn)越少操作越方便，受者越易接受，故本研究最終選擇“4.0、8.0、12.0 h”三點(diǎn)采樣的MPA血藥濃度用于預(yù)測(cè)AUC0-12h，其擬合出的計(jì)算公式為AUC0-12h＝12.058+2.819c4.0+7.045c8.0+3.879c12.0，預(yù)測(cè)的AUC0-12h與fAUC0-12h相關(guān)性較好，R2為0.934。Bland-Altman分析結(jié)果（圖2）顯示，上述計(jì)算公式預(yù)測(cè)的AUC0-12h與fAUC0-12h一致性較好，有19例（占95.0%）在x±1.96SD范圍內(nèi)。

圖2 MPA的預(yù)測(cè)AUC0-12 h與fAUC0-12 h的一致性考察結(jié)果

3 討論

MMF是器官移植術(shù)后三聯(lián)免疫抑制方案中常用的免疫抑制劑，其代謝產(chǎn)物MPA的體內(nèi)代謝過(guò)程易受年齡、體重、基因以及合用藥物等多重因素的影響，導(dǎo)致受者的個(gè)體差異大。應(yīng)用治療藥物監(jiān)測(cè)評(píng)估MPA體內(nèi)暴露量，以提高藥物療效，減少不良反應(yīng)，是十分必要的。目前，LSS法因其采樣點(diǎn)少、監(jiān)測(cè)成本低、受者痛苦少以及預(yù)測(cè)精度良好等優(yōu)勢(shì)，已成為臨床MPA-AUC0-12h監(jiān)測(cè)的常用策略。

由以往關(guān)于LSS法估算實(shí)測(cè)AUC的研究可見，LSS法估算模型常因不同給藥劑量、劑型、給藥方案、藥物監(jiān)測(cè)方式以及不同受者人群的影響，導(dǎo)致擬合出的簡(jiǎn)化計(jì)算公式差別較大[8—10，13]。若要擬合出更為精準(zhǔn)的簡(jiǎn)化計(jì)算公式，需對(duì)研究過(guò)程的條件和檢測(cè)結(jié)果作出更準(zhǔn)確的限定。在合并用藥方面，本研究選擇了合用他克莫司的受者人群，他克莫司對(duì)MPA的體內(nèi)暴露量影響較環(huán)孢素更小，有利于提高擬合結(jié)果的預(yù)測(cè)精度。相比于以往研究通常采用的留置針采血的方式，本研究采用小針多次采血的方式，能保證各時(shí)間點(diǎn)MPA血藥濃度的真實(shí)可靠——因?yàn)榱糁冕樦袝?huì)有部分沖管液，如果直接從留置針取血，沖管液會(huì)混到血樣中，稀釋藥物濃度，致使檢測(cè)值偏低。此外，目前報(bào)道的MPA濃度檢測(cè)方法有高效液相色譜法、均相酶免疫分析法等，本研究采用的是本課題先前建立的全自動(dòng)二維液相色譜法，該方法操作簡(jiǎn)便、成本低、準(zhǔn)確度高。

本研究針對(duì)采用MMF（750 mg，q12 h）+他克莫司+甲潑尼龍三聯(lián)免疫抑制方案的受者，監(jiān)測(cè)其不同時(shí)間點(diǎn)MPA的血藥濃度，基于LSS法擬合估算了MPAAUC0-12h的預(yù)測(cè)模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MPA的tmax為（1.58±0.75）h，部分受者出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象，說(shuō)明MPA存在肝腸循環(huán)；fAUC0-12h為（33.95±13.40）μg·h/mL，個(gè)體間差異較大。通過(guò)分析單一時(shí)間點(diǎn)MPA的血藥濃度與fAUC0-12h的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，相關(guān)性均較差，其中，c0與fAUC0-12h的相關(guān)性R2僅為0.186，c8.0與fAUC0-12h的相關(guān)性最高，R2為0.826，ARPE＞15%的占比僅為30.0%，預(yù)測(cè)精度仍較低。這一結(jié)果證實(shí)，僅通過(guò)測(cè)定c0或任一單一時(shí)間點(diǎn)的MPA濃度無(wú)法準(zhǔn)確反映MPA的體內(nèi)暴露量。本研究又采用多元線性逐步回歸分析擬合出了基于LSS法估算MPA-AUC0-12h的簡(jiǎn)化計(jì)算公式，經(jīng)驗(yàn)證，使用“4.0、8.0、12.0 h”三點(diǎn)采樣的血藥濃度估算MPAAUC0-12h的效果較好，預(yù)測(cè)值與fAUC0-12h有很好的相關(guān)性及一致性，ARPE在臨床可接受范圍內(nèi)，簡(jiǎn)化計(jì)算公式為：AUC0-12h＝12.058+2.819c4.0+7.045c8.0+3.879c12.0。若采用兩點(diǎn)采樣法，盡管減少了采血次數(shù)，但預(yù)測(cè)精度明顯降低；若增加采樣點(diǎn)，擬合出的簡(jiǎn)化計(jì)算公式預(yù)測(cè)精度雖然更高，但是這樣勢(shì)必會(huì)造成采樣次數(shù)太多、時(shí)間較長(zhǎng)，不利于臨床應(yīng)用。

本研究建立了腎移植受者早期服用MMF合并他克莫司時(shí)體內(nèi)MPA-AUC0-12h的估算模型，通過(guò)控制入組受者類型（均為移植術(shù)后早期受者）、MMF劑型和用量以及使用更準(zhǔn)確的檢測(cè)方法等，使擬合出的MPAAUC0-12h簡(jiǎn)化計(jì)算公式更具有針對(duì)性，能夠?yàn)榕R床提供更加精準(zhǔn)的MPA-AUC0-12h估算結(jié)果。但本試驗(yàn)也存在一定不足，如本研究納入的樣本量較少，擬合出的簡(jiǎn)化計(jì)算公式仍需經(jīng)大樣本數(shù)據(jù)的優(yōu)化和驗(yàn)證。今后，本課題組將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行相關(guān)研究。