邵冰梅 ，李小鋒 ，閆蓓蓓 ，劉啟峰 ，秦?zé)ㄔ?，趙祥君 ，侯林 #（.山東中醫(yī)藥大學(xué)青島中醫(yī)藥科學(xué)院，山東青島 66000；.江西普正制藥股份有限公司國家企業(yè)技術(shù)中心，江西 吉安 00；.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 5000；.泰安市立醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 泰安 7000）

裸花紫珠為馬鞭草科植物裸花紫珠Callicarpa nudifloraHook.et Arn.的干燥葉[1]，主要分布于我國海南、江西、廣西等地，以海南五指山產(chǎn)者為上品[2]。該藥具有收斂止血、消炎解毒的功效，可用于治療細(xì)菌感染引起的急性傳染性肺炎、消化道和呼吸道出血[3]。目前，研究者已從裸花紫珠中分離出300多種成分，主要為苯丙素類、揮發(fā)油類、黃酮類、倍半萜類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、二萜類等成分[4]。

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬單股負(fù)鏈病毒目肺病毒科，其基因組可編碼11種蛋白[5]。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，可作用于多條通路，且不易產(chǎn)生耐藥性，在治療呼吸道病毒感染性疾病中具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，裸花紫珠乙酸乙酯部位是其抗單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）的主要活性部位，可直接滅殺病毒，也可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫來發(fā)揮抗HSV的作用[7]；裸花紫珠顆粒及裸花紫珠乙酸乙酯部位均具有較好的體外抗腸道病毒71型（human enterovirus 71，EV71）的作用，治療指數(shù)（therapeutic index，TI）分別為35.26、8.1[8—9]。

譜效關(guān)系研究可從中藥指紋圖譜和藥效學(xué)研究出發(fā)，闡釋中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。本課題組前期研究證實(shí)，裸花紫珠醇提物對(duì)RSV有較好的抑制作用。雖已有研究建立了裸花紫珠的指紋圖譜并報(bào)道了其抗病毒作用[7—9，11]，但其抗RSV作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確?；诖?，本研究擬首先建立20批裸花紫珠醇提物的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，對(duì)其抗RSV的譜效關(guān)系進(jìn)行研究，并建立數(shù)學(xué)模型表征裸花紫珠醇提物抗RSV的藥效成分，以期為裸花紫珠的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用儀器包括Waters Acquity H-Class型UPLC系統(tǒng)（美國Waters公司）、Spectra Max M5型酶標(biāo)儀（美國Molecular Device公司）、CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

4批裸花紫珠藥材由江西普正藥業(yè)股份有限公司提供，分別產(chǎn)自海南五指山（C1）、廣西南寧（C2）、江西吉安錦源（C3）、江西吉安井岡山（C4），經(jīng)江西普正藥業(yè)股份有限公司吳永忠研究員鑒定均為馬鞭草科植物裸花紫珠C.nudifloraHook.et Arn.的干燥葉。

胎牛血清（批號(hào)10270-106）購自美國Clark公司；DMEM培養(yǎng)液（批號(hào)812207）、乙二胺四乙酸（EDTA）-0.25%胰酶（批號(hào)2323363）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)BYHC1713）、青-鏈霉素雙抗（批號(hào)HYT11280746）均購自美國Gibco公司；MTT試劑（批號(hào)1636C097）購自美國VWR公司；乙腈、乙酸均為色譜純，二甲基亞砜（DMSO）等其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞與病毒

人喉鱗癌細(xì)胞Hep-2和RSV均由山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥抗病毒平臺(tái)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 裸花紫珠醇提物指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

以Acquity UPLC BEH-C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱，以乙腈（B）-0.1%乙酸溶液（C）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～3 min，11%B；3～10 min，11%B→14.5%B；10～20 min，14.5%B→18%B；20～22 min，18%B→21%B；22～32 min，21%B→30%B；32～43 min，30%B→95%B）；柱溫為35 ℃；流速為0.20 mL/min；檢測波長為350 nm；進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2 裸花紫珠醇提物的制備

取4批裸花紫珠藥材，粉碎；稱取上述粉末各5份，每份40 g，分別加入10%、30%、50%、70%、90%乙醇400 mL，超聲提取45 min×2次，迅速抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑后冷凍干燥，即得裸花紫珠醇提物樣品S1～S20（C1～C4批藥材的上述5種醇提物分別對(duì)應(yīng)S1～S5、S6～S10、S11～S15、S16～S20，得率為10.52%～26.95%）。

2.1.3 供試品溶液的制備

取上述20批裸花紫珠醇提物樣品各0.1 g，精密稱定，分別置于25 mL具塞容量瓶中，加50%甲醇溶解，超聲至完全溶解，放冷后以50%甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

（1）精密度考察：精密稱取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S3），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。以13號(hào)峰（保留時(shí)間適中、分離度良好且峰面積相對(duì)較大，下同）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不高于0.95%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD均不高于2.86%（n＝6），說明方法精密度良好。

（2）重復(fù)性考察：精密稱取裸花紫珠醇提物樣品（編號(hào)S3），共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以13號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不高于1.20%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD均不高于3.42%（n＝6），說明方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性考察：精密稱取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S3），分別于室溫靜置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以13號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不高于0.68%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD均不高于3.12%（n＝6），說明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取20批裸花紫珠醇提物樣品各適量，采用“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；將圖譜信息導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以編號(hào)S3樣品的圖譜為參照，將時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 s，經(jīng)多點(diǎn)校正自動(dòng)匹配，生成疊加指紋圖譜；經(jīng)Mark峰匹配，最終確定了25個(gè)共有峰，并以中位數(shù)法生成了對(duì)照?qǐng)D譜（R），具體見圖1。

圖1 20批裸花紫珠醇提物樣品的疊加指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》計(jì)算各樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜（R）的相似度，結(jié)果顯示，S1～S20樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度依次為0.989、0.994、0.998、0.998、0.997、0.912、0.981、0.984、0.986、0.985、0.992、0.996、0.980、0.973、0.968、0.994、0.995、0.980、0.979、0.981，說明各批裸花紫珠醇提物樣品所含化學(xué)成分相似，一致性較高。

2.1.6 共有峰峰面積差異性分析

通過計(jì)算20批裸花紫珠醇提物樣品指紋圖譜各共有峰峰面積的RSD來進(jìn)行差異性分析。結(jié)果顯示，25個(gè)共有峰峰面積的RSD為33.54%～162.28%，其中峰2、6、9、14、24峰面積的RSD均超過90%，提示20批樣品的成分含量有所差異，以峰2、6、9、14、24較為明顯。

2.2 裸花紫珠醇提物體外抗RSV的藥效研究

2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

將裝有Hep-2細(xì)胞的凍存管置于37 ℃水浴中，使其迅速復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至含DMEM培養(yǎng)液6 mL的無菌離心管中，以1 000 r/min離心3 min，棄去上清液；加入新鮮DMEM培養(yǎng)液10 mL，吹打后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2、75%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)；6 h后，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，待單層細(xì)胞融合至80%后傳代培養(yǎng)。

2.2.2 病毒毒力測定

將Hep-2細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)12 h。RSV病毒液按10倍比用細(xì)胞維持液（即含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，下同）稀釋8個(gè)梯度（即1×10-8～1×10-1），加至長成單層的細(xì)胞中培養(yǎng)36 h（每個(gè)病毒稀釋度設(shè)置6孔），采用致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）法觀察病毒感染情況，按照Reed-Muench公式[12]計(jì)算得RSV的病毒滴度為3.4×107TCID50/mL（TCID50為半數(shù)組織培養(yǎng)物感染量）。

2.2.3 裸花紫珠醇提物細(xì)胞毒性及抗RSV活性測定

將20批裸花紫珠醇提物樣品研細(xì)后分別溶于細(xì)胞維持液中，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的供試藥液。將Hep-2細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)12 h。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、藥物組（裸花紫珠醇提物質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5 mg/mL，質(zhì)量濃度按前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。除空白對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞均接種100個(gè)TCID50的病毒液（病毒加入量根據(jù)“2.2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置），藥物組細(xì)胞同時(shí)加入相應(yīng)藥液。培養(yǎng)36 h后，采用CPE法觀察病毒感染情況，采用MTT法，以酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值來評(píng)估細(xì)胞活力，通過GraphPad Prism 5軟件擬合裸花紫珠醇提物對(duì)Hep-2細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度（CC50）和對(duì)RSV病毒的半數(shù)抑制濃度（IC50），并計(jì)算TI值（TI＝CC50/IC50）[13—14]。上述實(shí)驗(yàn)平行2批進(jìn)行，1批用于擬合CC50，1批用于擬合IC50。

結(jié)果（表1）顯示，隨著提取溶劑極性的減小，裸花紫珠醇提物的細(xì)胞毒性有逐漸增強(qiáng)的趨勢，其中S10樣品的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，CC50為（87.03±6.85）μg/mL。20批裸花紫珠醇提物對(duì)RSV有不同程度的抑制作用，其中S10樣品的抗RSV活性最強(qiáng)，其IC50為（9.55±1.35）μg/mL；S15樣品的抗RSV活性次之，其IC50為（11.07±1.16）μg/mL；S2樣品的TI值最大，為27.53；S11樣品的TI值最小，為3.63。

表1 20批裸花紫珠醇提物樣品的CC50及抗RSV的IC50、TI值（±s，n＝3）

表1 20批裸花紫珠醇提物樣品的CC50及抗RSV的IC50、TI值（±s，n＝3）

樣品編號(hào)S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 CC50/（μg/mL）755.97±24.11 873.23±38.56 405.63±15.61 144.64±7.05 325.77±11.19 1 016.33±16.74 1 217.33±47.44 279.95±10.67 152.37±11.05 87.03±6.85 680.24±24.12 637.53±22.53 264.57±9.50 202.93±4.99 124.97±5.49 1 320.33±67.53 829.67±43.21 555.13±16.79 251.83±7.60 172.07±9.81 IC50/（μg/mL）110.21±6.25 31.72±0.52 24.43±1.21 23.80±1.82 17.22±1.21 122.93±6.31 52.18±2.24 30.46±0.87 18.52±2.16 9.55±1.35 187.24±7.21 42.48±0.59 31.78±1.49 12.68±1.95 11.07±1.16 272.23±11.28 83.02±4.23 36.63±0.63 23.39±2.76 18.31±0.60 TI 6.86 27.53 16.62 6.07 18.92 8.33 23.33 9.19 8.23 9.12 3.63 15.01 8.33 16.00 11.29 4.85 9.99 15.15 10.97 9.39

2.3 裸花紫珠醇提物抗RSV活性的譜效關(guān)系評(píng)價(jià)

2.3.1 Pearson相關(guān)性分析

采用SPSS 22.0軟件，對(duì)裸花紫珠醇提物指紋圖譜的共有峰峰面積與IC50進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Pearson相關(guān)性分析對(duì)二者的關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果（表2）顯示，峰8、10、12、16、18～19、22～24的峰面積與IC50呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.573、-0.731、-0.523、-0.531、-0.497、-0.452、-0.497、-0.595、-0.619（P＜0.05或P＜0.01）?？梢酝茰y，這9個(gè)共有峰對(duì)應(yīng)成分可能與裸花紫珠醇提物的抗RSV活性有關(guān)，且其峰面積越大，裸花紫珠提取物的IC50越小，抗RSV活性可能越強(qiáng)。

表2 各共有峰峰面積與IC50的Pearson相關(guān)系數(shù)

2.3.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析

灰色關(guān)聯(lián)度分析能進(jìn)一步反映各化學(xué)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)[15]，故本研究以20批裸花紫珠醇提物的IC50作為母序列[記為X0（i）（i＝1，2，……，20）]，以各批裸花紫珠醇提物指紋圖譜的25個(gè)共有峰峰面積作為子序列[分別記為X1（k）～X25（k）（k＝1，2，……，20）]，采用歸一化法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理后，再根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)度分析方法計(jì)算峰面積與IC50的關(guān)聯(lián)度。結(jié)果（表3）顯示，裸花紫珠醇提物指紋圖譜各共有峰對(duì)抗RSV活性貢獻(xiàn)最大的為峰1，最小的為峰 24；25個(gè)共有峰的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，提示25個(gè)共有峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分與藥效學(xué)指標(biāo)均具有關(guān)聯(lián)性[16]。

表3 各共有峰峰面積與IC50的關(guān)聯(lián)度

2.3.3 OPLS分析

采用SIMCA 14.0軟件，以裸花紫珠醇提物指紋圖譜的25個(gè)共有峰峰面積為自變量（X1～X25），以其抗RSV的IC50為因變量（Y），進(jìn)行正交偏最小二乘（orthogonalpartial least squares，OPLS）分析，得標(biāo)準(zhǔn)化回歸方程和變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值。

其中，方程的回歸系數(shù)可反映各自變量對(duì)抗RSV活性（即IC50）的貢獻(xiàn)大小[17]。本研究得標(biāo)準(zhǔn)化回歸方程為Y＝0.087 4X1+0.029 9X2-0.002 6X3+0.000 8X4+0.036 4X5+0.022 5X6-0.014 5X7-0.116 4X8-0.056 2X9-0.119 0X10-0.055 3X11-0.119 8X12-0.025 0X13-0.061 0X14-0.019 3X15-0.082 5X16-0.082 1X17-0.064 8X18-0.055 4X19-0.076 0X20-0.044 2X21-0.051 3X22-0.084 4X23-0.097 3X24+0.000 3X25。由此方程可知，峰3、7～24對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)均為負(fù)值，提示其對(duì)應(yīng)成分與IC50呈負(fù)相關(guān)[17]。

VIP可解釋自變量對(duì)因變量的貢獻(xiàn)程度，其值越大，說明該自變量對(duì)因變量的貢獻(xiàn)越大，若其值大于1則表示對(duì)該因變量有顯著貢獻(xiàn)[17]。結(jié)果（圖2）顯示，25個(gè)共有峰中，峰10、24、23、22、8、12、18、1、19、20、16的VIP值均大于1，表明其對(duì)應(yīng)成分對(duì)裸花紫珠抗RSV活性具有顯著影響。

圖2 各共有峰的VIP值

3 討論

3.1 裸花紫珠醇提物的UPLC指紋圖譜

本研究首先建立了裸花紫珠不同醇提物的指紋圖譜。結(jié)果顯示，20批裸花紫珠醇提物指紋圖譜的相似度為0.912～0.998，共有峰峰面積的RSD為33.54%～162.28%，提示各醇提物的化學(xué)成分相似，但含量有所差異。

3.2 裸花紫珠醇提物的體外抗RSV活性

本研究以Hep-2細(xì)胞為對(duì)象，對(duì)裸花紫珠不同醇提物的體外抗RSV活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，隨著提取溶劑極性的減小，裸花紫珠醇提物的細(xì)胞毒性有增強(qiáng)的趨勢，其中S10樣品的細(xì)胞毒性最強(qiáng)；20批裸花紫珠醇提物中，S10樣品的IC50值最小，S15樣品次之；S2樣品的TI值最大，S11樣品最小。這提示，各批醇提物對(duì)RSV有不同程度的體外抑制作用。

3.3 裸花紫珠醇提物抗RSV活性的譜效關(guān)系

數(shù)學(xué)模型為中藥藥效成分篩選提供了分析手段，但每種模型都有自身的局限性；同時(shí)，相同的數(shù)據(jù)使用不同的處理方法也可能會(huì)得到完全不同的結(jié)果[18]，故本研究采用了Pearson相關(guān)性分析、灰色關(guān)聯(lián)度、OPLS分析，以綜合評(píng)價(jià)裸花紫珠醇提物抗RSV活性的譜效關(guān)系。其中，Pearson相關(guān)性分析可評(píng)價(jià)2個(gè)變量相關(guān)聯(lián)的程度，并能反映關(guān)聯(lián)度的方向（正相關(guān)、負(fù)相關(guān)），但無法體現(xiàn)其他變量的影響，故不能評(píng)估多種成分的整體作用[15]?；疑P(guān)聯(lián)度分析方法能評(píng)估成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)，但無法描述各成分對(duì)藥效的綜合貢獻(xiàn)度和關(guān)聯(lián)度方向[19]，因此在該法基礎(chǔ)上聯(lián)合OPLS分析可進(jìn)一步明確呈正、負(fù)相關(guān)的藥效成分[20—21]。

綜合上述3種分析方法，本研究以Pearson相關(guān)系數(shù)為負(fù)值（P＜0.05）、關(guān)聯(lián)度大于0.6、OPLS模型回歸系數(shù)為負(fù)值且VIP值大于1的共有峰作為特征峰[16—17，22]，其相對(duì)應(yīng)的化合物即為對(duì)藥效有較大貢獻(xiàn)的特征成分。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，峰8、10、12、16、18～19、22～24的峰面積與抗RSV藥效指標(biāo)IC50的Pearson相關(guān)系數(shù)均為負(fù)值（P＜0.05）；灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果顯示，25個(gè)共有峰峰面積與抗RSV藥效指標(biāo)IC50的關(guān)聯(lián)度均大于0.6；OPLS分析結(jié)果顯示，峰8、10、12、16、18～20、22～24的回歸系數(shù)為負(fù)值且VIP大于1。綜合上述結(jié)果可知，峰8、10、12、16、18～19、22～24的峰面積與抗RSV藥效指標(biāo)IC50呈負(fù)相關(guān)，其對(duì)應(yīng)成分可能是裸花紫珠醇提物抗RSV的特征成分。

綜上所述，本研究成功建立了裸花紫珠不同醇提物的UPLC指紋圖譜，各醇提物成分一致性較好，但含量有所差異；各醇提物具有不同程度的抗RSV活性，其中峰8、10、12、16、18～19、22～24對(duì)應(yīng)成分可能是其抗RSV的特征成分。本研究基于中藥譜效學(xué)研究，將成分的“量”與“效”相結(jié)合，挖掘出了能反映中藥發(fā)揮藥效的活性成分，可為裸花紫珠的質(zhì)量標(biāo)志物篩選及質(zhì)量控制提供參考。