林 乾, 李文云, 羅 懌, 王小柯, 柏自琴, 李金強(qiáng)

(貴州省果樹科學(xué)研究所, 貴州 貴陽550006)

0 引言

【研究意義】果實(shí)品質(zhì)是評(píng)價(jià)果品等級(jí)及優(yōu)劣的重要依據(jù),對(duì)果實(shí)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力起決定性作用[1],其中,可溶性糖在果實(shí)品質(zhì)形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是評(píng)價(jià)果實(shí)營(yíng)養(yǎng)和感官特性的重要指標(biāo),其類型、含量及糖酸比共同決定果實(shí)甜度[2]。此外,可溶性糖是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要貢獻(xiàn)者,不僅為植物抵御逆境提供能量,還可作為反應(yīng)物與免疫信號(hào)物質(zhì)參與植物免疫[3],同時(shí)連接了蛋白質(zhì)代謝、脂類代謝及核酸代謝[4],其代謝產(chǎn)物可調(diào)控細(xì)胞代謝,控制成花與果實(shí)成熟關(guān)鍵基因的表達(dá)[5]。因此,研究果實(shí)可溶性糖組分及含量差異對(duì)評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)優(yōu)劣及生態(tài)適應(yīng)性具有重要參考意義。【前人研究進(jìn)展】果實(shí)可溶性糖組分及含量除受品種遺傳特性影響外,還受海拔、溫度、水分、土壤、光照強(qiáng)度和栽培管理技術(shù)等多因素影響[6],造成不同品種間可溶性糖組成及含量存在差異,如適當(dāng)高溫有利于糖分的積累[7]、較大晝夜溫差可促進(jìn)柑橘果實(shí)蔗糖的增加[8]。陳慧瓊等[9]利用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)64個(gè)黃皮種質(zhì)資源果實(shí)可溶性糖的組成及含量表明,蔗糖是黃皮的主要可溶性糖。鄭麗靜等[10]采用離子色譜法(IC)檢測(cè)132個(gè)蘋果品種的成熟果實(shí)可溶性糖組分及含量表明,蘋果的可溶性糖以果糖為主,其次是蔗糖和葡萄糖,山梨醇含量最低。此外,同一品種在不同產(chǎn)地可溶性糖也存在較大差異,如紅美人果實(shí)的葡萄糖含量在衢州、寧波、宜昌等6個(gè)產(chǎn)地存在顯著性差異,可溶性總糖含量最高的寧波比最低的宜昌高44.4%[11]。因此,受品種特性、自然條件和栽培技術(shù)等影響,不同產(chǎn)地果實(shí)可溶性糖組分和含量特征存在較大差異?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】貴州省德江縣是柑橘適生區(qū),但該區(qū)域柑橘發(fā)展起步晚,品種結(jié)構(gòu)有待優(yōu)化。柑橘新品種引進(jìn)是優(yōu)化品種結(jié)構(gòu)和培育優(yōu)勢(shì)區(qū)域的重要環(huán)節(jié),而果實(shí)品質(zhì)分析是新品種生態(tài)適應(yīng)性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以貴州德江2017年引進(jìn)的6個(gè)柑橘品種成熟果實(shí)為研究對(duì)象,通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)果肉可溶性糖,分析品種間可溶糖組分及含量特征,為柑橘品質(zhì)評(píng)價(jià)、布局和結(jié)構(gòu)調(diào)整提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為貴州德江引進(jìn)的沃柑、大雅柑、紐荷爾臍橙、春見、晚熟8號(hào)血橙和瀨戶見6個(gè)柑橘品種成熟果實(shí)。2017年春季從重慶引入,砧木為香橙,當(dāng)年定植于同一果園,栽培管理?xiàng)l件一致。果園海拔490 m,東經(jīng)108.02°,北緯28.28°,年降水量1 200 mm,年均溫16.8 ℃,無霜期310 d,土壤類型為黃壤。所采果實(shí)成熟度一致,除紐荷爾臍橙和晚熟8號(hào)血橙分別于2020年11月和2021年4月采集外,其余品種均采自2021年2月。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 醇、異丙醇、正己烷為分析純,其中,甲醇、異丙醇購(gòu)自德國(guó)Merck,正己烷購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。99% BSTFA購(gòu)自Aladdin,99%甲氧銨鹽、99%吡啶購(gòu)自Sigma-Aldrich。共13種標(biāo)準(zhǔn)品,其中,蔗糖、乳糖、葡萄糖、L-鼠李糖、木糖醇、D-阿拉伯糖購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司,麥芽糖、海藻糖、D-果糖、D-半乳糖、L-巖藻糖購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司,肌醇、D-山梨糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2.2 儀器 8890-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent)、5424R型離心機(jī)(Eppendorf)、CentriVap型冷凍干燥機(jī)(LABCONCO)、MM400型球磨儀(Retsch)、XD-DCY-24Y型氮吹儀(上海析達(dá))、KQ5200E型超聲清洗儀(昆山舒美)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理 每個(gè)品種隨機(jī)選取3株樹,在樹冠中部東、南、西、北4個(gè)方位各采集果面光滑、無明顯病蟲斑、著色均勻、大小接近的成熟果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。將各品種隨機(jī)分成3組作為生物學(xué)重復(fù),用蒸餾水洗凈果面,取其果肉迅速于液氮中速凍后送武漢邁特維爾生物科技有限公司檢測(cè)。供試樣品真空冷凍干燥并研磨成粉末,每個(gè)樣品稱取20 mg進(jìn)行萃取,萃取參照江海等[12-13]的方法,并稍有修改。稱樣后加入500 μL V甲醇∶V異丙醇∶V水(3∶3∶2)提取液,渦旋3 min并于冰水中超聲30 min;4 ℃,14 000 r/min離心3 min,取50 μL上清液加入20 μL內(nèi)標(biāo),氮吹并凍干;在所得凍干樣中加入100 μL含15 mg/mL甲氧銨鹽的吡啶,37 ℃孵育2 h,隨后加入100 μL 衍生化試劑,37 ℃孵育30 min得衍生化溶液,用正己烷稀釋待測(cè)。

1.3.2 氣質(zhì)聯(lián)用分析 使用安捷倫8890-5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀,參照SUN等[14]的方法,并稍作調(diào)整。色譜條件:色譜柱為 DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和同型號(hào)保護(hù)柱;進(jìn)樣量為1 μL,按5∶1分流進(jìn)樣;載氣為He,柱流速為1 mL/min。升溫程序:170 ℃保持2 min后以10 ℃/min升至240 ℃,隨即以5 ℃/min升至280 ℃,再以25 ℃/min升至310 ℃,保持4 min。質(zhì)譜條件:傳輸線溫度240 ℃,離子源溫度230 ℃,四級(jí)桿溫度150 ℃,電離電壓70 eV。以13種可溶性糖混標(biāo)梯度溶液作為質(zhì)控樣本,在檢測(cè)分析過程中,每隔10個(gè)檢測(cè)分析樣本插入1個(gè)質(zhì)控樣本。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)可溶性糖進(jìn)行定性和定量分析。以外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)濃度比為橫坐標(biāo),外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo),繪制不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供試樣品糖類的積分峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程按公式:計(jì)算得到樣本中可溶性糖絕對(duì)含量。

樣本中糖含量(mg/g)=c×V1×V2/V3/m/1 000 000

其中,c為樣本中帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度值,V1為定容所用溶液的體積,V2為樣本提取過程中加入樣本提取液的體積,V3為樣本提取過程中收集上清液的體積,m為稱取的樣本質(zhì)量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010處理,采用SPSS 22.0進(jìn)行顯著性分析、R軟件(https://www.r-project.org/)進(jìn)行相關(guān)性分析、Graphpad Prism 7.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性糖甲基化衍生物GC-MS分離

通過對(duì)同一質(zhì)控樣本質(zhì)譜檢測(cè)分析的總離子流色譜圖進(jìn)行重疊展示分析顯示,總離子流圖重疊性高,保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致,說明檢測(cè)期間儀器精密良好(圖1)。衍生后的D-阿拉伯糖、木糖醇、L-鼠李糖、L-巖藻糖、D-果糖、D-半乳糖、葡萄糖、D-山梨醇、肌醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其衍生物總離子流圖積分峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.996 1～0.999 6,均呈線性相關(guān)關(guān)系(表1)。

表1 13種可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

圖 1 可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物TIC圖譜

2.2 不同品種可溶性糖組成及其相對(duì)含量

由圖2可見,6個(gè)柑橘品種樣品中均檢測(cè)出7種可溶性糖,分別為肌醇(Inositol)、葡萄糖(Glu)、L-巖藻糖(Fuc)、D-果糖(Fru)、D-阿拉伯糖(Ara)、海藻糖(Tre)和蔗糖(Suc),未檢測(cè)到木糖醇(Xylitol)、L-鼠李糖(Rha)、D-半乳糖(Gal)、D-山梨醇(Sorbitol)、乳糖(Lac)和麥芽糖(Mal)。品種間可溶性總糖為629.288 ～ 813.999 mg/g DW,大雅柑(DY)>春見(CJ)>瀨戶見(LHJ)>紐荷爾臍橙(NHE)>沃柑(WG)>晚熟8號(hào)血橙(XC)。6個(gè)品種均是蔗糖相對(duì)含量最高,變化范圍較大(228.333～411.333 mg/g DW),相對(duì)含量為34.63%～53.87%,平均含量為318.278 mg/g DW,變異系數(shù)為19.55%;其次是D-果糖和葡萄糖,兩者含量相近(169.667～219 mg/g DW,171～214.667 mg/g DW),變化范圍較小,相對(duì)含量分別為22.22%～31.90%和22.48%～31.80%,平均含量分別為194.389 mg/g DW和191.278 mg/g DW,變異系數(shù)分別為9.69%和9.24%;再次是肌醇,相對(duì)含量為1.38%～2.10%,平均含量為12.756 mg/g DW,變異系數(shù)為14.30%;其余3種可溶性糖含量極低,均在0.1 mg/g DW以下,相對(duì)含量均不足0.08%(圖2 B)。

圖 2 6個(gè)柑橘品種樣品中可溶性總糖(A)和各可溶性糖相對(duì)含量(B)

2.3 不同品種可溶性糖含量

對(duì)6個(gè)品種可溶性糖含量差異分析表明,不同品種可溶性糖含量存在較大差異,但均以蔗糖、D-果糖和葡萄糖為主要可溶性糖(圖3)。大雅柑可溶性總糖含量最高,是最低晚熟8號(hào)血橙的1.296倍,且顯著高于其他5個(gè)品種;品種間兩兩比較顯示,可溶性總糖含量有11對(duì)達(dá)差異顯著水平,有4對(duì)差異不顯著(圖3A)。蔗糖含量以春見最高,含量為411.333 mg/g DW,顯著高于其他品種;除紐荷爾臍橙與晚熟8號(hào)血橙蔗糖含量差異不顯著外,其余品種兩兩間蔗糖含量差異均達(dá)顯著水平(圖3B)。葡萄糖含量和D-果糖含量相近,均以大雅柑最高,分別為214.667 mg/g DW和219.000 mg/g DW,在6個(gè)品種間葡萄糖含量和D-果糖含量分別有12對(duì)、11對(duì)差異顯著和3對(duì)、4對(duì)差異不顯著(圖3C～D)。肌醇、D-阿拉伯糖、海藻糖、L-巖藻糖含量均較低,4種糖含量在6個(gè)品種兩兩間分別存在13對(duì)、13對(duì)、14對(duì)、10對(duì)差異顯著和2對(duì)、2對(duì)、1對(duì)、5對(duì)差異不顯著(圖3E～H)。

注：不同小寫字母表示差異達(dá)顯著(P<0.05)水平。

2.4 不同品種可溶性糖的相關(guān)性

對(duì)果實(shí)中各可溶性糖組分及可溶性糖總量進(jìn)行相關(guān)性分析(圖4)顯示,相關(guān)性系數(shù)在0.5及以上的正相關(guān)有5對(duì)、負(fù)相關(guān)有3對(duì),相關(guān)性系數(shù)在0.5以下的有20對(duì),其中,有10對(duì)相關(guān)性系數(shù)小于0.1。蔗糖與可溶性總糖呈顯著正相關(guān)關(guān)系,表明蔗糖是可溶性總糖的主要貢獻(xiàn)者;D-果糖與葡萄糖呈極顯著正相關(guān)關(guān)系,反映二者關(guān)系密切;海藻糖與可溶性總糖、蔗糖均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,說明海藻糖含量的升高不利于蔗糖含量的積累,二者存在一定的拮抗關(guān)系。其他可溶性糖間不存在顯著相關(guān)性。

注：*和***分別表示在P<0.05和P<0.001水平上顯著和極顯著相關(guān)。

3 討論

可溶性糖是影響果實(shí)風(fēng)味的重要物質(zhì)[15],水果中的可溶性糖主要以葡萄糖、果糖和蔗糖為主[16]。果樹類型不同,果實(shí)可溶性糖組成及含量存在差異[17],如草莓以果糖和葡萄糖為主,少含或不含蔗糖[18];甜櫻桃以葡萄糖為主[19];蘋果和梨以果糖為主,含葡萄糖、蔗糖和山梨醇[10,20];桃、李和杏則以蔗糖為主要可溶性糖[21-23]。水果甜味不僅受可溶性糖種類的影響,還與其味感閾值有關(guān)。不同可溶性糖,其甜度不同,其中,果糖甜度最高,分別是蔗糖和葡萄糖的1.73倍和2.34倍[3],當(dāng)可溶性糖含量/味感閾值>1時(shí),該糖才對(duì)果實(shí)甜味產(chǎn)生影響[24],故部分可溶性糖的風(fēng)味因其含量過低而無法被感知。此外,可溶性糖在口中停留的時(shí)間因種類不同而長(zhǎng)短不一,蔗糖含量越高,越有利于形成口感好、風(fēng)味濃的果實(shí)品質(zhì)[10]。因此,不同可溶性糖組分和含量差異形成了果實(shí)特有的口感和風(fēng)味。

對(duì)柑橘果實(shí)糖的研究主要集中在果糖、葡萄糖及蔗糖3種糖的組分差異及其代謝分析,對(duì)其他糖研究較少,利用GC-MS技術(shù)對(duì)6個(gè)柑橘品種果實(shí)進(jìn)行糖組分檢測(cè),所建標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性好、靈敏度高,檢測(cè)數(shù)據(jù)可靠。對(duì)6個(gè)柑橘品種成熟果實(shí)可溶性糖組分分析表明,品種間可溶性糖含量存在較大差異,但6個(gè)品種均以蔗糖含量最高,平均含量為318.278 mg/g DW,屬于蔗糖積累型,即蔗糖是甜度品質(zhì)的重要貢獻(xiàn)者,該結(jié)果與鄧秀新等[25-26]研究報(bào)道一致;葡萄糖和果糖的平均含量分別為194.389 mg/g DW和191.278 mg/g DW,其比值約為1∶1,表現(xiàn)為顯著正相關(guān)關(guān)系,該結(jié)論與孫達(dá)[27]研究報(bào)道一致。除上述3種主要可溶性糖外,其余4種平均含量均較低,其中,以肌醇平均含量最高,為12.756 mg/g DW,而D-阿拉伯糖、海藻糖、L-巖藻糖含量極低,平均含量均不足0.1 mg/g DW。但值得注意的是海藻糖與可溶性總糖、蔗糖均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明海藻糖的增多不利于果實(shí)可溶性糖的積累。

果實(shí)糖積累主要源自光合作用,以山梨醇和蔗糖的形式經(jīng)韌皮部運(yùn)輸至果實(shí),期間經(jīng)復(fù)雜的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn),最終主要以葡萄糖、果糖和蔗糖的形式貯存在果實(shí)細(xì)胞[28]。在糖積累過程中,受品種遺傳特性、果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境因子、栽培技術(shù)等諸多因素的影響,其中,糖代謝是調(diào)控果實(shí)糖積累的根本因素。糖代謝主要包括蔗糖代謝、山梨醇代謝和己糖代謝[28],不同代謝途徑受一種至多種酶或信號(hào)分子調(diào)控,引起果實(shí)可溶性糖含量和組分存在較大差異,進(jìn)而影響果實(shí)風(fēng)味。不同品種間可溶性糖組分及含量差異可能是以上一種或多種因素共同作用的結(jié)果。

4 結(jié)論

貴州引種沃柑、大雅柑、紐荷爾臍橙、春見、晚熟8號(hào)血橙和瀨戶見6個(gè)柑橘品種共檢測(cè)出蔗糖、葡萄糖、D-果糖、D-阿拉伯糖、海藻糖、肌醇和L-巖藻糖7種可溶性糖,均以蔗糖含量最高(228.333～411.333 mg/g DW),其次是葡萄糖和D-果糖(169.667～214.667 mg/g DW),3種糖約占可溶性總糖的98%,品種間可溶性糖含量特征差異較大;D-果糖與葡萄糖、蔗糖與可溶性總糖呈顯著正相關(guān)關(guān)系,海藻糖與蔗糖、可溶性總糖呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。