崔家榕，董豐收，徐 軍，吳小虎，潘興魯，鄭永權(quán)

(1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.植物病蟲害綜合治理全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

花椰菜（Brassica oleracea var.botrytis Linnaeus）是十字花科、蕓薹屬植物野甘藍(lán)的變種，在我國廣泛種植[1]。在花椰菜種植期間，斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾等害蟲的發(fā)生頻率高，為害損失大[2-6]。氯蟲苯甲酰胺（Chlorantraniliprole，CAP）屬雙酰胺類殺蟲劑，通過激活昆蟲靶標(biāo)中的魚尼丁受體，使細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子失衡，影響肌肉收縮[7]，該產(chǎn)品對鱗翅目害蟲的控制效果好、持效期長[8-9]，對花椰菜田小菜蛾幼蟲具有良好的防治效果[10]。多殺霉素（Spinosad）又稱多殺菌素，活性成分為多殺霉素A和多殺霉素D組成的混合物，是刺糖多孢菌在培養(yǎng)介質(zhì)下經(jīng)有氧發(fā)酵后產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種大環(huán)內(nèi)酯類無公害的高效生物殺蟲劑，作用于昆蟲的乙酰膽堿受體，可以使靶標(biāo)昆蟲如鱗翅目幼蟲、薊馬和食葉性甲蟲迅速死亡[11-12]。將氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素進(jìn)行混配，可有效防治花椰菜生產(chǎn)中的常見蟲害，保證花椰菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[13-14]。但是，由于農(nóng)藥濫用或不規(guī)范施用，可能導(dǎo)致兩種農(nóng)藥在花椰菜中殘留超標(biāo)，對人類健康產(chǎn)生潛在威脅。所以，開發(fā)花椰菜中氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素的殘留分析方法對監(jiān)督和規(guī)范這兩種殺蟲劑在花椰菜上的使用和保障農(nóng)產(chǎn)品安全具有重要意義。

根據(jù)GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[15]規(guī)定，氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素在花椰菜中沒有制定具體限量規(guī)定，僅制定了其組限量，氯蟲苯甲酰胺即在蕓薹屬類蔬菜（芥藍(lán)、菜薹除外）的最大殘留限量為2 mg/kg，多殺霉素在蕓薹屬類蔬菜的最大殘留限量為2 mg/kg。關(guān)于多殺霉素和氯蟲苯甲酰胺的殘留檢測方法有高效液相色譜法[16-17]、免疫法[18]以及超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[19-20]。其中有有關(guān)對花椰菜中氯蟲苯甲酰胺、多殺霉素殘留的單一農(nóng)藥殘留的檢測分析的研究報(bào)道[21-24]，但對多殺霉素和氯蟲苯甲酰胺在花椰菜上的同時(shí)檢測方法還未見報(bào)道。檢測方法的更新迭代，制約著花椰菜中農(nóng)藥殘留監(jiān)測的效率。其中，QuEChERS前處理方法具有迅速、簡單、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全的優(yōu)點(diǎn)[25]。本研究采用QuEChERS前處理方法，結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)，建立了同時(shí)測定花椰菜中氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素殘留量的分析方法，并對北京和湖南2地田間花椰菜樣品進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測為花椰菜中氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素殘留監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

SCIEX TRIPLE QUAD 4500超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；CK-2000 高通量組織研磨儀，Thmorgan 公司；SI-0246漩渦混合器，美國Scientific Industries；TDZ5-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；BSA224S-CW電子分析天平（精確到0.01 mg），賽多利斯公司；PL601-L梅特勒電子天平（精確到0.1 g），梅特勒-托利多公司。

氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度97.28%），Dr.Ehrenstorfer；多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.6%，多殺霉素A與多殺霉素D的比例為77.1∶22.9），國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心；10%多殺·氯蟲苯甲酰胺懸浮劑，開封一田生物科技有限公司；乙腈（色譜純），默克股份有限公司；乙腈、甲醇（分析純），北京市通廣精細(xì)化工公司；純凈水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、石墨化碳黑（GCB）和Filter Unit濾膜（0.22 μm），天津博納艾杰爾科技有限公司；乙腈、無水硫酸鎂和氯化鈉（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分別在北京市和湖南省長沙市進(jìn)行，設(shè)置空白對照區(qū)及試驗(yàn)區(qū)，每小區(qū)面積不少于50 m2。設(shè)置10%多殺·氯蟲苯甲酰胺懸浮劑有效成分施藥劑量為45 g/hm2，采用葉面噴霧施藥1次。于施藥后5、7 d，采用隨機(jī)法采樣。每個(gè)小區(qū)選取不少于12株無明顯病蟲害的花椰菜，隨機(jī)采集兩份至少2 kg的獨(dú)立樣品?；ㄒ藰悠非谐? cm小塊，縮分混勻后于-18℃保存?zhèn)溆?，每份留?50 g。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品的前處理

稱取10.0 g（精確到0.01 g）花椰菜基質(zhì)于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈（分析純），1 300 r/min振蕩10 min，加入3.0 g氯化鈉，1 300 r/min振蕩10 min，4 000 r/min離心5 min。取離心后上清液1.5 mL，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管（預(yù)裝10 mg GCB＋50 mg PSA＋150 mg無水硫酸鎂），渦旋勻漿3 min，5 000 r/min離心5 min，將上清用0.22 μm有機(jī)膜過濾后入瓶待測。

1.3.2 檢測條件

色譜條件：AB Sciex 4500高效液相色譜質(zhì)譜儀，Triple Quad 45 00 型色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司）。流動(dòng)相A為水溶液，B為乙腈，梯度洗脫（表1）。

表1 色譜梯度洗脫流動(dòng)相組成表

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI＋）；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；離子化電壓5 500 V；離子源溫度550℃；噴霧氣（GS1）0.41 MPa；輔助加熱氣（GS2）0.41 MPa。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 氯蟲苯甲酰胺、多殺霉素A 和多殺霉素D 的質(zhì)譜檢測參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別稱取適量的氯蟲苯甲酰胺、多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈溶解，配制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，并等比例混合稀釋得到100 mg/L混標(biāo)溶液。取不含待測物的花椰菜樣品，按1.3.1節(jié)的前處理方法制得空白基質(zhì)溶液。將100 mg/L混標(biāo)溶液用乙腈和花椰菜基質(zhì)空白提取液稀釋成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/kg和5 mg/kg濃度的溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別按1.3.2節(jié)的質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 方法的正確度和精密度測定

根據(jù)NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留準(zhǔn)則》規(guī)定，添加水平應(yīng)包括農(nóng)藥最大殘留限量MRL值和檢測方法的定量限LOQ[26]。分別在花椰菜空白樣品中添加氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和多殺霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加質(zhì)量濃度分別為0.05、2、5 mg/kg，每個(gè)添加水平5次重復(fù)，按照1.3.1節(jié)中的方法進(jìn)行處理，并在1.3.2節(jié)中的色譜條件下測定。計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)分析

基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）的存在會(huì)影響殘留農(nóng)藥的定量分析，按式（1）計(jì)算ME[27]。

當(dāng)ME＞1.1時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME＜0.9時(shí)，為基質(zhì)減弱效應(yīng)，而當(dāng)0.9＜ME＜1.1時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)不明顯[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件優(yōu)化

選用水-乙腈分別配成不同體積比的流動(dòng)相，反復(fù)進(jìn)樣篩選，得到不同的分離效果。經(jīng)對比，當(dāng)流動(dòng)相為V水∶V乙腈＝10∶90時(shí)，樣品中氯蟲苯甲酰胺、多殺霉素A和多殺霉素D 3種目標(biāo)物與雜質(zhì)有較好的分離效果，且目標(biāo)化合物均在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效分離，保留時(shí)間分別為2.47、2.40 min和2.41 min（圖1）。

圖1 氯蟲苯甲酰胺（a）、多殺霉素A（b）和多殺霉素D（c）的典型色譜圖

為得到氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素的最佳儀器響應(yīng)和分離效果，采用1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為工作溶液，在電噴霧離子源（ESI＋）下進(jìn)行全掃描（m/z 300～900）。結(jié)果表明：正離子掃描模式下氯蟲苯甲酰胺、多殺霉素A和多殺霉素D的母離子峰明顯且穩(wěn)定，3種化合物均具有較好的電離效果。

2.2 方法的線性范圍、基質(zhì)效應(yīng)和定量限

用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液及基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線來評估方法的線性范圍及其相關(guān)性（表3）。在0.05～5 mg/kg范圍內(nèi)，氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素的線性關(guān)系良好（R2＞0.99）。與溶劑中的標(biāo)準(zhǔn)品相比，基質(zhì)可能影響目標(biāo)化合物的電離，并降低或增強(qiáng)農(nóng)藥響應(yīng)值，導(dǎo)致精密度和正確度降低?；|(zhì)效應(yīng)來源于基質(zhì)中不易揮發(fā)的共洗脫成分與目標(biāo)分析物在噴霧液滴轉(zhuǎn)移到氣態(tài)離子過程發(fā)生競爭，不同類型的農(nóng)藥、基質(zhì)和樣品前處理方式都可能對基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生影響[29]。花椰菜中多殺霉素的兩種組分多殺霉素A和多殺霉素D的ME值分別為1.99和1.77，具有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。氯蟲苯甲酰胺在花椰菜中的ME值為0.36，具有基質(zhì)減弱效應(yīng)（表3）。基質(zhì)效應(yīng)的差異可能與兩種化合物的極性差異有關(guān)，極性較高的氯蟲苯甲酰胺會(huì)集中在液滴的水相內(nèi)部而不會(huì)留在表面，因此化合物的表面張力較低，傾向于產(chǎn)生更多的離子抑制[30]。本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正法對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了補(bǔ)償，以提高定量準(zhǔn)確性。以最低添加水平確定定量限（LOQ），氯蟲苯甲酰胺、多殺霉素A、多殺霉素D的LOQ分別為0.05、0.039 mg/kg和0.011 mg/kg。

表3 多殺霉素和氯蟲苯甲酰胺的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

2.3 方法的正確度與精密度

通過回收率試驗(yàn)評估方法的正確度和精確度。正確度用回收率來體現(xiàn)，精確度用不同重復(fù)之間回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來評估。在0.05、2 mg/kg和5 mg/kg 3個(gè)添加水平下，氯蟲苯甲酰胺在花椰菜樣品中的回收率為101.6%～106.9%，RSD為1.9%～4.3%；多殺霉素A的回收率為96.1%～105.7%，RSD為1.5%～7.9%；多殺霉素D的平均回收率為97.2%～106.8%，RSD為1.4%～8.4%（表4），根據(jù)我國農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則，當(dāng)添加濃度在0.01～0.1 mg/kg，回收率要求為70%～120%，RSD≤20%[26]。均符合農(nóng)藥殘留測定的要求。結(jié)果表明檢測方法正確度和精密度良好。

表4 花椰菜中氯蟲苯甲酰胺、多殺霉素A 和多殺霉素D 的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 實(shí)際樣品檢測

利用1.3節(jié)中建立的方法，通過乙腈提取，UPLCMS/MS檢測采集自北京市和湖南省長沙市2地的16份花椰菜樣品中的氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素殘留。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%多殺·氯蟲苯甲酰胺懸浮劑按推薦劑量（675 g/hm2），在花椰菜上施藥5 d后，氯蟲苯甲酰胺在花椰菜上的殘留量為＜0.05～0.70 mg/kg、多殺霉素A和多殺霉素D在花椰菜上的殘留量＜LOQ；距最后一次施藥后7 d，氯蟲苯甲酰胺、多殺霉素A和多殺霉素D在花椰菜上的殘留量均＜LOQ。

3 結(jié)論

建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測花椰菜中氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素殘留的分析方法。該檢測方法在0.05～5 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2＞0.99）。在3個(gè)添加水平下，該方法正確性和精密度好，靈敏度高，能滿足花椰菜中氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素殘留的檢測要求，對花椰菜中氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素殘留量的同時(shí)檢測具有一定的借鑒意義。與目前相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)及其他文獻(xiàn)報(bào)道的氯蟲苯甲酰胺或多殺霉素的檢測方法相比，本試驗(yàn)將QuEChERS快速前處理技術(shù)應(yīng)用于花椰菜中氯蟲苯甲酰胺和多殺霉素的殘留分析，確保了正確性和精密度，與Abhijit Kar等[31]所建立的方法相比，該方法簡化了前處理過程，具有操作簡便、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于大批量的日常分析檢測。