王立凱 范文紅 楊思思 鄧德文 諶紅彬 張文杰

1 天津市協(xié)和醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司，天津市臨床免疫分析技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300301；2 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院設(shè)備處，天津 300052；3 天津市醫(yī)療器械審評(píng)查驗(yàn)中心，天津 300191

人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（human vascular endothelial growth factor，hVEGF）是一種具有高度生物活性的二聚體陽(yáng)離子糖蛋白[1]，它特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其增殖、遷移，并能促進(jìn)血管形成和增加毛細(xì)血管通透性。腫瘤新生血管的生成是在hVEGF 的調(diào)控下進(jìn)行的。腫瘤新生血管的活躍程度是影響腫瘤細(xì)胞增殖的重要因素，而hVEGF 是促進(jìn)腫瘤新生血管生成最重要的生長(zhǎng)因子之一，故其可反映腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[2-4]。測(cè)定血清中hVEGF 的含量，對(duì)腫瘤的早期篩查、治療療效觀(guān)察、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)及相關(guān)抗腫瘤藥物療效評(píng)價(jià)等都具有一定的參考價(jià)值[5-6]。目前hVEGF 的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法和熒光免疫層析法等[7-8]。但酶聯(lián)免疫吸附法的靈敏度相對(duì)較低，熒光免疫層析法在定量檢測(cè)中的批間變異性較大，不適宜在臨床檢測(cè)中推廣?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（chemiluminescence immunoassay，CLIA）法是目前最先進(jìn)的免疫分析技術(shù)之一，其靈敏度高，批內(nèi)和批間變異性小，更適合在臨床檢測(cè)中使用[9-12]。本研究旨在研制以磁微粒為載體的hVEGF 放射免疫測(cè)定（radioimmunoassay，RIA）和CLIA 試劑盒，評(píng)價(jià)其分析靈敏度、回收率和精密度等技術(shù)指標(biāo)，并通過(guò)對(duì)臨床血清樣本的檢測(cè)探討2 種試劑盒對(duì)早期腫瘤的診斷價(jià)值 。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

hVEGF 抗原購(gòu)自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；hVEGF 抗體購(gòu)自天健生物制藥（天津）有限公司；液體生物防腐劑 Proclin300 購(gòu)自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；Na125I 由中國(guó)同位素公司代購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer 公司；吖啶酯購(gòu)自湖北新德晟材料科技有限公司；磁微粒購(gòu)自杭州博岳生物技術(shù)有限公司；RIA 儀[型號(hào)G（-911）] 購(gòu)自科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；全自動(dòng)CLIA 儀（型號(hào)SMART500s）購(gòu)自重慶科斯邁生物科技有限公司；4-嗎啉乙磺酸（4-morpholinoethanesulfonic acid，MES）緩沖液和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；葡聚糖G-25 凝膠柱購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；NaCO3、NaHCO3、NaCl、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸二鈉、HCl、NaOH、蔗糖均購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；海藻糖購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；Tween 20 購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；甘氨酸、碳二亞胺、Na2S2O3、氯胺T 和H2O2均購(gòu)自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；胎牛血清購(gòu)自上海羽哚生物科技有限公司；超聲波清洗機(jī)（型號(hào)JPS-20AL）購(gòu)自深圳市潔泰超聲洗凈設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)混合儀（型號(hào)Bit1000-S）購(gòu)自杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；脫鹽柱（型號(hào)PD-10）購(gòu)自武漢晶誠(chéng)生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)的正常人及肺癌和結(jié)直腸癌患者血清樣本均由山西省腫瘤醫(yī)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 配制hVEGF 抗原標(biāo)準(zhǔn)品

將0.02 mol/L、pH=7.3 的PBS 與胎牛血清按2∶1 比例配制成hVEGF 標(biāo)準(zhǔn)品基礎(chǔ)緩沖液（簡(jiǎn)稱(chēng)零標(biāo)準(zhǔn)品），用此緩沖液配制質(zhì)量濃度分別為0、100、400、1 000、3 000、10 000 pg/ml 的hVEGF抗原標(biāo)準(zhǔn)品。該hVEGF 抗原標(biāo)準(zhǔn)品可同時(shí)用于RIA 和CLIA。

1.2.2 hVEGF 抗體包被磁微粒

配制0.01 mol/L、pH=7.0 的MES 緩沖液作為磁微粒連接液；在1 L 磁微粒連接液中加入10 g甘氨酸作為磁微粒封閉液；在1 L 0.02 mol/L、pH=7.3 的 PBS 中加入10 g BSA、10 g 蔗糖、1 ml液體生物防腐劑 Proclin300 作為磁微粒保存液。取1 ml 磁微粒加入離心管中，用磁微粒連接液洗滌2 次，加入5 ml 磁微粒連接液并經(jīng)超聲分散后，再加入1 mg hVEGF 抗體，在旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)反應(yīng)0.5 h；加入10 mg/ml 的碳二五胺溶液500 μl，經(jīng)超聲分散后在旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)反應(yīng)3 h；加入5 ml磁微粒封閉液旋轉(zhuǎn)過(guò)夜進(jìn)行磁分離；磁分離后，用MES 緩沖液洗滌2 次，加入10 ml 磁微粒保存液并經(jīng)超聲分散，制備成磁微粒懸浮液。使用時(shí)將包被抗體后的磁微粒懸浮液稀釋40 倍作為磁微粒工作液，此磁微粒工作液可同時(shí)用于RIA 和CLIA。

1.2.3 制備hVEGF 標(biāo)記抗體

放射免疫標(biāo)記：取0.1 mg hVEGF 抗體，加入55.5 MBq Na125I，用磁力轉(zhuǎn)子邊攪拌邊加入4.0 mg/ml的氯胺T 30 μl 反應(yīng)45 s 后，立即加入4.0 mg/ml的Na2S2O350 μl 反應(yīng)30 s。用葡聚糖G-25 凝膠柱純化分離。在1 L 0.02 mol/L、pH=7.3 的 PBS 中，加入10 g BSA 和1 ml 液體生物防腐劑 Proclin300，配制成PBS-BSA 緩沖液，用PBS-BSA 緩沖液配制hVEGF 標(biāo)記抗體工作液，使100 μl hVEGF 標(biāo)記抗體的每分鐘放射性計(jì)數(shù)（CPM）約為20 萬(wàn)，4℃保存?zhèn)溆?，此即為RIA 標(biāo)記物工作液。

化學(xué)發(fā)光免疫標(biāo)記：取0.2 mg hVEGF 抗體，加入4 ml 標(biāo)記反應(yīng)液（0.05 mol/L、pH=9.0 的由NaCO3和NaHCO3配制的碳酸鹽緩沖液），用超濾管離心使得體積為200 μl，在玻璃試管中，邊用磁力轉(zhuǎn)子攪拌邊加入6.3 μl 4 mg/ml的吖啶酯溶液，避光攪拌反應(yīng)3 h，加入標(biāo)記終止液（1 mol/L 的甘氨酸溶液）100 μl 反應(yīng)0.5 h。用脫鹽柱純化，用PBS-BSA 緩沖液洗脫收峰（吖啶酯標(biāo)記完抗體后，用脫鹽柱進(jìn)行層析純化，收集蛋白峰），使其總體積為20 ml。向1 L 0.05 mol/L、pH=6.8 的檸檬酸鹽緩沖液中加入BSA 8 g、海藻糖5 g、乙二胺四乙酸二鈉2 g、NaCl 8.5 g 配制成hVEGF 標(biāo)記物緩沖液，用此緩沖液將hVEGF 標(biāo)記抗體再稀釋50 倍，于棕色不透明瓶中4℃避光保存，此即為CLIA 標(biāo)記物工作液。

1.2.4 激發(fā)液及免疫測(cè)定洗滌液配制

激發(fā)液Ⅰ：1 L 雙蒸水中加入2.5 ml 濃HCl和2 ml 30% H2O2，充分混勻后4℃避光保存。激發(fā)液Ⅱ：1 L 雙蒸水中加入10 g NaOH，充分混勻后4℃保存。免疫測(cè)定洗滌液：0.01 mol/L、pH=7.3 的 PBS，含0.1% Tween 20，常溫保存。

1.2.5 hVEGF 免疫分析方法的建立

上述組份制備完成以后，進(jìn)行RIA 和CLIA對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確定RIA 和CLIA 試劑盒的操作方法和溫育條件。

RIA 試劑盒操作方法：分別取50 μl hVEGF抗原標(biāo)準(zhǔn)品和人血清樣本、50 μl 磁微粒工作液、100 μl RIA 標(biāo)記物工作液至反應(yīng)管，室溫振蕩1 h（300 次/min），磁分離后用免疫測(cè)定洗滌液洗滌2 次，用RIA 儀進(jìn)行測(cè)定。

CLIA 試劑盒操作方法：分別取50 μl hVEGF抗原標(biāo)準(zhǔn)品和人血清樣本、50 μl 磁微粒工作液、50 μl CLIA 標(biāo)記物工作液至反應(yīng)管，37℃溫育20 min，用免疫測(cè)定洗滌液洗滌4 次，加入100 μl 激發(fā)液Ⅰ和100 μl 激發(fā)液Ⅱ，用CLIA 儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 分析靈敏度測(cè)定

分別用RIA 和CLIA 試劑盒連續(xù)測(cè)定20 管零標(biāo)準(zhǔn)品，統(tǒng)計(jì)其每分鐘放射性計(jì)數(shù)值和發(fā)光值，計(jì)算和SD，取+2SD在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上所對(duì)應(yīng)的濃度值即為RIA 和CLIA 試劑盒的分析靈敏度。

1.2.7 精密度測(cè)定

批內(nèi)變異性：將hVEGF 抗原溶解于人血清中，配制成質(zhì)量濃度分別為100、1 000 pg/ml的低、高2 個(gè)血清樣本，用2 種試劑盒分別進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣本測(cè)20 次，計(jì)算hVEGF 濃度的和SD，然后計(jì)算變異系數(shù)（CV）=×100%。批間變異性：將hVEGF 抗原溶解于人血清中，配置成質(zhì)量濃度分別為100、1 000 pg/ml 的低、高2 個(gè)血清樣本各10管，用2 種試劑盒分別進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)3 次，計(jì)算3 次測(cè)定的hVEGF 濃度、SD和CV。

1.2.8 回收率測(cè)定

將hVEGF 抗原溶解于人血清中，配制成質(zhì)量濃度分別為100、500、3 000 pg/ml 的低、中、高3 個(gè)血清樣本，用RIA 和CLIA 試劑盒分別測(cè)定其濃度，然后計(jì)算實(shí)際測(cè)定值與理論值之間的比值，即為回收率?；厥章试浇咏?00%，準(zhǔn)確率越高。

1.2.9 正常參考值范圍確定

收集106 名正常人血清樣本，用RIA 和CLIA試劑盒分別測(cè)定hVEGF 濃度，計(jì)算xˉ和SD，然后計(jì)算+2SD即為正常參考值范圍的上限，小于該值為正常。

1.2.10 臨床血清樣本檢測(cè)

用2 種試劑盒分別測(cè)定處于Ⅰ期或Ⅱ期的52 例肺癌、56 例結(jié)直腸癌患者的血清樣本中hVEGF 濃度，計(jì)算其靈敏度；測(cè)定106 名正常人血清樣本，計(jì)算其特異度。對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件對(duì)正常人與肺癌、結(jié)直腸癌患者h(yuǎn)VEGF 測(cè)定值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（方差齊）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hVEGF 抗原標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果

由RIA 和CLIA 試劑盒測(cè)定hVEGF 抗原標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果可知，hVEGF抗原抗體結(jié)合較好，非特異性結(jié)合低，各標(biāo)準(zhǔn)品濃度的發(fā)光值梯度明顯，2 種試劑盒測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性良好（圖1、圖2）。因此，磁微粒與包被抗體的最佳比例為1 ml 磁微?！? mg 抗體；125I 與標(biāo)記抗體的最佳比例為55.5 MBq125I∶0.1 mg 抗體，吖啶酯與標(biāo)記抗體的最佳比例為25 μg 吖啶酯∶0.2 mg 抗體。

圖2 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒測(cè)定人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗原標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure 2 Standard curve of human vascular endothelial growth factor antigen detected by chemiluminescence immunoassay kit

2.2 分析靈敏度測(cè)定結(jié)果

RIA 試劑盒檢測(cè)20 管零標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算得到的每分鐘放射性計(jì)數(shù)xˉ =844.35、SD=147.63、xˉ+2SD=1 139.61；CLIA 試劑盒檢測(cè)20 管零標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算得到的發(fā)光值xˉ = 8 109.20、SD=1 142.87、xˉ+2SD=10 394.95。將xˉ+2SD結(jié)果取整后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到RIA 和CLIA 試劑盒的分析靈敏度分別為17.6和9.2 pg/ml。

2.3 精密度測(cè)定結(jié)果

RIA 試劑盒的批內(nèi)變異性分別為5.95%和4.19%，批間變異性分別為7.85%和7.06%；CLIA試劑盒的批內(nèi)變異性分別為6.12%和4.35%，批間變異性分別為7.96%和6.37%。

2.4 回收率測(cè)定結(jié)果

RIA 和CLIA 2 種試劑盒對(duì)低、中、高3 個(gè)血清樣本進(jìn)行測(cè)定的平均回收率分別為103.28%和101.85%，說(shuō)明CLIA 試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確率更高。

2.5 正常參考值范圍

RIA 試劑盒測(cè)定正常人血清樣本中hVEGF 濃度，計(jì)算得到xˉ =99.82 pg/ml、SD=20.53、xˉ+2SD=140.88；CLIA 試劑盒測(cè)定正常人血清樣本中hVEGF濃 度，計(jì) 算 得 到xˉ = 102.35 pg/ml、SD=19.59、xˉ+2SD=141.53。因此將RIA 和CLIA 試劑盒測(cè)定hVEGF 的正常參考值統(tǒng)一確定為＜142 pg/ml。

2.6 臨床血清樣本測(cè)定結(jié)果

由表1 可知，每種試劑盒檢測(cè)肺癌患者和結(jié)直腸癌患者分別與正常人血清樣本hVEGF 測(cè)定值均值相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-16.695～-14.920，均P＜0.01）。RIA試劑盒和CLIA 試劑盒檢測(cè)出肺癌、結(jié)直腸癌靈敏度分別為90.38%（47/52）和92.31%（48/52）、92.86%（52/53）和91.07%（51/56）；RIA 試劑盒和CLIA 試劑盒檢測(cè)出正常人血清樣本的特異度分別為98.11%（104/106）和99.06%（105/106）。

表1 RIA 和CLIA 2 種試劑盒測(cè)定臨床血清樣本中人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的結(jié)果分析Table 1 Analysis of the results of determination of human vascular endothelial growth factor in clinical serum samples by RIA and CLIA kits

3 討論

癌癥給人類(lèi)的生命健康造成了嚴(yán)重威脅。我國(guó)每年約有150 萬(wàn)人患癌癥，約80 萬(wàn)人因癌癥病死，且發(fā)病率和病死率均呈逐年上升趨勢(shì)。癌癥患者病死率居高不下的主要原因是早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)已至晚期，錯(cuò)過(guò)了治療時(shí)機(jī)。癌癥具有器官特異性，目前研究成熟的腫瘤生物標(biāo)志物一般只對(duì)部分腫瘤敏感，做一次全面體檢需要測(cè)十幾種腫瘤生物標(biāo)志物，費(fèi)用高且檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜。因此非常有必要選擇一種對(duì)所有腫瘤都靈敏的生物標(biāo)志物用于體檢普通篩查。而hVEGF 是腫瘤新生血管生成最重要的促進(jìn)因子之一，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中出現(xiàn)早，且對(duì)所有腫瘤都敏感，因此對(duì)早期腫瘤診斷具有重要意義[13-16]。

本研究制備了以磁微粒為固相載體的RIA 試劑盒和CLIA 試劑盒，對(duì)其檢測(cè)hVEGF 的分析靈敏度、精密度、回收率等技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，探討其在早期肺癌和結(jié)直腸癌臨床診斷中的價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，CLIA 試劑盒的分析靈敏度高于RIA 試劑盒。在精密度方面，CLIA 試劑盒的批內(nèi)變異性略高于RIA試劑盒，而批間變異性略低于RIA 試劑盒。在準(zhǔn)確率方面，與RIA 試劑盒相比，CLIA 試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確率更高。在臨床樣本檢測(cè)方面，CLIA 試劑盒對(duì)肺癌的臨床檢測(cè)靈敏度略高于RIA 試劑盒；RIA 試劑盒對(duì)結(jié)直腸癌的臨床檢測(cè)靈敏度略高于CLIA 試劑盒；CLIA 試劑盒檢測(cè)正常人血清樣本的特異度略高于RIA 試劑盒。由于所使用的抗原抗體完全相同，RIA 試劑盒和CLIA試劑盒的臨床檢測(cè)結(jié)果相差不大。

綜上，CLIA 試劑盒的分析靈敏度、特異度均高于RIA 試劑盒，精密度和臨床血清樣本檢測(cè)結(jié)果與RIA 試劑盒基本相當(dāng)。從試劑成本來(lái)看，CLIA試劑盒的標(biāo)記抗體用量約為RIA 試劑盒的一半，成本相對(duì)較低。CLIA 試劑盒可由全自動(dòng)CLIA 儀完成操作，溫育時(shí)間為20 min；而RIA 試劑盒需人工操作，溫育時(shí)間為1 h，因此CLIA 試劑盒操作更加快速便捷。另外，RIA 試劑盒的有效期約為45 d，而CLIA 試劑盒的有效期可達(dá)1 年，且放射免疫試劑有一定的放射性污染，而化學(xué)發(fā)光試劑則更加環(huán)保。因此，CLIA 試劑盒的優(yōu)勢(shì)更加明顯，有利于市場(chǎng)推廣。總之，本研究研制的2 種試劑盒的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)較好，具有較高的性?xún)r(jià)比，這與文獻(xiàn)[17-18]報(bào)道一致，其在早期肺癌和結(jié)直腸癌臨床檢測(cè)中具有一定的臨床價(jià)值。

利益沖突 所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 王立凱負(fù)責(zé)方法學(xué)的建立、論文的撰寫(xiě)；范文紅負(fù)責(zé)臨床試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)及實(shí)施；楊思思負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計(jì)分析、論文的修改；鄧德文負(fù)責(zé)放射免疫測(cè)定現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；諶紅彬負(fù)責(zé)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；張文杰負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)方案的總體設(shè)計(jì)、論文的審閱