孫立嬌 孫迪 程顯好 史曉委 趙志龍

摘要：茶藨子葉狀層菌（Phylloporia ribis）是一種寄生于5年以上金銀花活體根莖韌皮部的藥食兩用真菌，具有抗炎、抗病毒等作用。采用4種液體培養(yǎng)基對茶藨子葉狀層菌進行人工培養(yǎng)，并探究不同培養(yǎng)基對生物量、三萜、多糖及腺苷含量的影響。結(jié)果表明：茶藨子葉狀層菌在馬鈴薯液體培養(yǎng)基和忍冬馬鈴薯液體培養(yǎng)基中多糖含量較高，分別為2.910 mg/g和2.708 mg/g，在忍冬麥麩培養(yǎng)基中生物量為3.280 mg/g、三萜為6.426 mg/g、腺苷為3.182 mg/g，含量均高于其他三種培養(yǎng)基。本研究為大規(guī)模人工培養(yǎng)茶藨子葉狀層菌提供參考。

關(guān)鍵詞：茶藨子葉狀層菌；液體培養(yǎng)；忍冬；代謝產(chǎn)物

中圖分類號：Q93-335?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1002-4026（2023）05-0027-06

Effects of different liquid culture media on growth and metabolism of Phylloporia ribis

SUN Lijiao1，SUN Di2，CHENG Xianhao3，SHI Xiaowei1，ZHAO Zhilong1*

（1. College of Medicine， Linyi University， Linyi 27600， China；2. Shandong （Linyi） Institute of Modern Agriculture ，?Zhejiang University， Linyi 27600， China；3. School of Agriculture， Ludong University， Yantai 264000， China）

Abstract∶Phylloporia ribis， a type of medicinal and edible fungus that parasitizes the phloem of Lonicera japonica rootstock for more than 5 years， has anti-inflammatory and antiviral effects. In this study， four types of liquid media（PD， LPD，MF，LMF） were used for its artificial culture. Furthermore， the effects of different media on the contents of triterpene polysaccharide and adenosine in the biomass were investigated. The results showed that the polysaccharide contents of Phylloporia ribis were high in PD and LPD media （2.910 mg/g and 2.708 mg/g， respectively）. The biomass， triterpenoid， and adenosine contents of Phylloporia ribis in LMF medium were 3.280 mg/g， 6.426 mg/g， and 3.182 mg/g， respectively， which were higher than those in the other three media. This study provides a reference for the large-scale artificial cultivation of Phylloporia ribis.

Key words∶ Phylloporia ribis; liquid culture; Lonicera japonica Thunb.; metabolism

茶藨子葉狀層菌（Phylloporia ribis）屬于銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）葉狀層菌屬（Phylloporia），是一種寄生于5年以上忍冬科植物金銀花活體根莖韌皮部的藥食兩用真菌[1-2]。該菌含有甾醇、有機酸、多糖、三萜和苯乙烯基吡喃酮等化學成分[3-5]，其中化合物drosophilin A、crototropone及核苷類成分等具有顯著的抗炎、抗病毒活性[5]，多糖類化合物具有抗腫瘤[6]、促進免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[7-9]，且毒理研究表明其安全無毒[9-10]。作為新資源食品以及民間常用藥，廣泛用于防治咽炎、扁桃體炎等口腔炎癥，在醫(yī)療保健方面展現(xiàn)出重要的開發(fā)價值，應用前景廣闊。茶藨子葉狀層孔菌作為非腐生類真菌，對生長條件要求嚴苛，野生菌稀少，嚴重限制了茶藨子葉狀層孔菌的深入開發(fā)。因此，茶藨子葉狀層菌的人工培養(yǎng)是對其開發(fā)利用具有重要意義。

近年來，國內(nèi)學者對于該菌的人工培養(yǎng)已展開初步相應研究，陳蒙蒙等[2]采用6種固體培養(yǎng)基人工培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌在麥芽汁固體培養(yǎng)基中生長速度最快，在麥麩固體培養(yǎng)基中色素積累明顯較多，且生物量最高，而在GPY培養(yǎng)基（葡萄糖蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基）中培養(yǎng)40 d左右三萜含量最高。周麗思等［11］通過添加不同生藥量忍冬莖水提取物對茶藨子葉狀層菌發(fā)酵的影響進行了探究，忍冬莖水提物可顯著提高菌絲體中麥角甾醇、總多糖等含量。因此，基于茶藨子葉狀層菌的生長習性[1，3]以及其他真菌的人工培養(yǎng)研究基礎(chǔ)[11-19]，本文采用4種不同液體培養(yǎng)基，對該菌進行人工液體培養(yǎng)，探究不同液體培養(yǎng)基對茶藨子葉狀層菌代謝的影響，為茶藨子葉狀層菌的人工培養(yǎng)提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

SW-CJ-2D超凈工作臺（蘇州凈化）、YXQ-75S11高壓滅菌鍋（上海博訊）、HNY恒溫振蕩培養(yǎng)箱（天津歐諾）、pH計、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、高效液相色譜儀（華普儀器）、Zorbax Extend-C18色譜柱、ZF紫外分光光度計（上?？等A）、KQ-500DE超聲波清洗機。

1.2 實驗材料

供試菌株魯東大學提供，經(jīng)ITS序列鑒定，為茶藨子葉狀層菌（Phylloporia ribis）。

菌絲體培養(yǎng)試劑：PD培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基）、葡萄糖、麩皮、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、忍冬藤。

多糖含量檢測劑：葡萄糖、6%苯酚、硫酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無水乙醇、丙酮、乙醚。

三萜含量檢測劑：齊墩果酸標準品（上海源葉生物科技有限公司）、95%乙醇（體積分數(shù)）、5%香草醛冰醋酸溶液（體積分數(shù)）、高氯酸、冰醋酸。

腺苷含量檢測劑：腺苷標準品（上海源葉生物科技有限公司）、50%甲醇（體積分數(shù)）、甲醇（分析純、色譜純）。

1.3 培養(yǎng)基及其制備方法。

茶藨子葉狀層菌液體培養(yǎng)基配方見表1。

液體培養(yǎng)基按上述配方準確稱重，攪拌均勻后，以80 mL/瓶分裝至250 mL的錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種的制備

菌種的活化：取4 ℃保藏的茶藨子葉狀層菌接種至PDA（馬鈴薯固體培養(yǎng)基）培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱，28 ℃培養(yǎng)15 d。

一級搖瓶種子制備：活化菌種生長直徑至5 cm時，無菌打孔器制備茶藨子葉狀層菌菌塊，挑取菌塊接種至PD培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，220 r/min，28 ℃培養(yǎng)8 d。

二級搖瓶種子制備：取5 mL 一級種子培養(yǎng)液，接種于二級搖瓶種子PD培養(yǎng)基中，220 r/min，28 ℃培養(yǎng)7 d。

測試培養(yǎng)基的接種與培養(yǎng)：取5 mL 二級搖瓶種子培養(yǎng)液，接種于不同培養(yǎng)基中，220 r/min，28 ℃培養(yǎng)10 d。

1.4.2 生物量的測定

采用濾紙過濾法定期測定各培養(yǎng)基中茶藨子葉狀層菌菌絲體生物量。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液離心棄上清，沉淀物置于烘箱中，100 ℃烘干至恒重。蒸餾水洗滌沉淀3次，80 ℃烘干至恒重，獲得菌絲生物量。

1.4.3 pH的測定

以pH計對發(fā)酵液pH進行測定，具體方法依照GB 6920—1986《水質(zhì)pH值的測定玻璃電極法》[20]規(guī)定方法，同一樣品重復測定3次。

1.4.4 三萜含量測定

采用香草醛-冰醋酸法測定忍冬茶藨子葉狀層孔菌三萜含量[21-22]。收集菌絲烘干至恒重后研磨，稱取0.5 g 菌絲粉末置于15 mL試管中，加入8 mL 70%乙醇溶液（體積分數(shù)），用超聲波（42 kHz）室溫提取1.5 h，收集上清液，沉淀繼續(xù)用6 mL 70%乙醇根據(jù)以上條件重復提取2次，合并3次提取液，2 000 r/min離心10 min，取上清液，70%乙醇定容至20 mL，即得醇提樣液。

1.4.5 多糖含量測定

采用硫酸苯酚法測定忍冬茶藨子葉狀層孔菌多糖含量[22-25]。稱取0.5 g 菌絲體粉末加水15 mL，沸騰2 h，浸泡過夜，紗布過濾后，殘渣重復上述步驟兩次，合并濾液，將所獲得濾液加熱濃縮至原體積的1/5，再向其中緩慢加入4倍濃縮液體積的無水乙醇，置于4 ℃冰箱中過夜醇沉，2 000 r/min離心后傾去上清液得到沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后再用蒸餾水溶解，最后在100 mL容量瓶中定容，即得多糖樣品溶液。

1.4.6 腺苷含量測定

采用高效液相色譜法測定茶藨子葉狀層菌腺苷含量[26]。取5支10 mL具塞試管，分別精確稱取四種茶藨子葉狀層菌菌絲粉末0.5 g，分別加入5 mL 的50%的甲醇溶液，超聲（100 W，60 ℃）震蕩溶解30 min后收集上清液。收集沉淀物，重復提取2次，合并3次提取液，2 000 r/min 離心10 min，取上清液。旋干后加入甲醇5 mL溶解，壓濾獲得腺苷樣品液[26]。色譜柱為Zorbax Extend-C18 （4.6 mm×150 mm，4 μm）；流動相為甲醇-水（體積比為1∶9）；流速為1 mL/min；檢測波長為260 nm；進樣量5 μL。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件和SPSS 21軟件進行數(shù)據(jù)分析和標準差分析。所有試驗重復3次，結(jié)果為（平均值±標準差）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對茶藨子葉狀層菌菌絲體生長的影響

在同等培養(yǎng)條件下，在不同培養(yǎng)基中生長的茶藨子葉狀層菌菌絲生長特性及生物量具有明顯差別（表2）。LMF培養(yǎng)基的菌絲生物量最高，達到3.28 g，其他依次為MF培養(yǎng)基、LPD培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基。同時，通過檢測各培養(yǎng)基的發(fā)酵液pH發(fā)現(xiàn)，茶藨子葉狀層菌的適宜pH在5.0～5.3之間。

2.2 不同培養(yǎng)基對茶藨子葉狀層菌三萜含量的影響

在三萜含量比較中，經(jīng)LMF培養(yǎng)基培養(yǎng)的茶藨子葉狀層菌菌絲三萜含量最高，三萜含量達到6.426 mg/g，[JP]其次是LPD培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基，分別為3.313 mg/g和 2.703 mg/g，經(jīng)培養(yǎng)基LPD培養(yǎng)的忍冬茶藨子葉狀層孔菌雖然生物量較高，但三萜成分含量最低，僅有2.333 mg/g。

在茶藨子葉狀層菌三萜產(chǎn)量方面，產(chǎn)量從高到低依次為培養(yǎng)基LMF、培養(yǎng)基MF、培養(yǎng)基PD、培養(yǎng)基LPD。在所有培養(yǎng)基培養(yǎng)的茶藨子葉狀層菌菌絲中，經(jīng)培養(yǎng)基LMF培養(yǎng)的茶藨子葉狀層菌菌絲三萜產(chǎn)量最高，80 mL發(fā)酵液中，達到1.928 mg，與其余三種培養(yǎng)基相比，具有顯著差異（P<0.05），三萜產(chǎn)量最低的是LPD培養(yǎng)基培養(yǎng)的茶藨子葉狀層菌菌絲。以茶藨子葉狀層菌三萜為目標產(chǎn)物時，應首選培養(yǎng)基LMF培養(yǎng)基作為茶藨子葉狀層菌菌絲發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.3 不同培養(yǎng)基對茶藨子葉狀層菌腺苷含量和產(chǎn)量的影響

在腺苷含量比較中，經(jīng)LMF培養(yǎng)基培養(yǎng)的茶藨子葉狀層孔菌菌絲腺苷含量最高，達到3.182 mg/g，腺苷含量由高到低依次為LPD培養(yǎng)基、MF培養(yǎng)基、PD培養(yǎng)基，分別為2.853、1.752、0.988 mg/g。

在茶藨子葉狀層菌腺苷產(chǎn)量方面，產(chǎn)量從高到低依次為LMF培養(yǎng)、LPD培養(yǎng)、MF培養(yǎng)基、PD培養(yǎng)基。在所有培養(yǎng)基培養(yǎng)的茶藨子葉狀層菌菌絲中，LMF培養(yǎng)中茶藨子葉狀層菌菌絲腺苷產(chǎn)量最高，80 mL發(fā)酵液中，達到0.954 mg，與其余3種培養(yǎng)基相比，具有顯著差異（P<0.05），腺苷產(chǎn)量最低的是經(jīng)PD培養(yǎng)基培養(yǎng)的茶藨子葉狀層菌菌絲。以高產(chǎn)茶藨子葉狀層菌腺苷為目標產(chǎn)物時，應首選LMF培養(yǎng)基作為茶藨子葉狀層菌菌絲發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.4 不同培養(yǎng)基對茶藨子葉狀層菌多糖含量和產(chǎn)量的影響

不同培養(yǎng)基對茶藨子葉狀層菌多糖的含量和產(chǎn)量影響見表5。在多糖含量比較中，經(jīng)PD培養(yǎng)基培養(yǎng)的忍冬茶藨子葉狀層孔菌菌絲多糖含量最高，高達2.91 mg/g，培養(yǎng)LPD中的忍冬茶藨子葉狀層孔菌菌絲多糖含量為2.708 mg/g，培養(yǎng)基MF中的忍冬茶藨子葉狀層孔菌菌絲多糖含量為2.498 mg/g，經(jīng)培養(yǎng)LMF培養(yǎng)的忍冬茶藨子葉狀層孔菌菌絲生物量、三萜含量以及腺苷含量均最高，但其多糖含量僅有2.311 mg/g，相較其他培養(yǎng)基，多糖含量最低。

在茶藨子葉狀層菌多糖產(chǎn)量方面，產(chǎn)量從高到低依次為培養(yǎng)基PD、培養(yǎng)基LPD、培養(yǎng)基MF、培養(yǎng)基LMF。在所有培養(yǎng)基培養(yǎng)的茶藨子葉狀層菌菌絲中，培養(yǎng)基PD中茶藨子葉狀層菌菌絲多糖產(chǎn)量最高，80 mL發(fā)酵液中，達到0.873 mg，[JP]與培養(yǎng)基LPD中的菌絲相比差異不明顯，不具有統(tǒng)計學意義，與培養(yǎng)基MF、 培養(yǎng)基LMF相比，具有顯著差異（P<0.05），多糖產(chǎn)量最低的是經(jīng)LMF培養(yǎng)基培養(yǎng)的茶藨子葉狀層菌菌絲。以高產(chǎn)茶藨子葉狀層菌多糖為目標產(chǎn)物時，應首選培養(yǎng)基PD培養(yǎng)基作為茶藨子葉狀層菌菌絲發(fā)酵培養(yǎng)基。

3 討論

綜上實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加忍冬莖葉水提液的培養(yǎng)基更適合茶藨子葉狀層菌的發(fā)酵培養(yǎng)，LPD與LMF培養(yǎng)基中菌絲體生物量明顯增加，其菌絲疏松，有利于菌絲高效利用發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)與溶解氧，從而生長速度提高。同等條件下培養(yǎng)60 d，LMF培養(yǎng)基產(chǎn)出的菌絲生物量、腺苷含量以及三萜含量最高，菌絲干重高達164.0 mg，三萜含量高達0.64%，是GPY培養(yǎng)基的1.65倍左右，腺苷含量高達0.32%，綜合生物量、三萜、多糖以及腺苷等多個指標來看，適宜茶藨子葉狀層菌發(fā)酵的培養(yǎng)基由高到低依次為LMF、LPD、MF、PD。雖然人工菌絲培養(yǎng)取得一定進展，但茶藨子葉狀層菌的產(chǎn)量較低，仍未達到大規(guī)模生產(chǎn)的要求，還需要進一步探索。

參考文獻：

［1］張小青，戴玉成. 中國真菌志第二十九卷 銹革孔菌科[M]. 北京：科學出版社，2005： 169-170.

［2］陳蒙蒙， 程顯好， 孫磊， 等. 茶藨子葉狀層菌固體培養(yǎng)特性[J]. 食用菌學報， 2015， 22（4）： 37-39. DOI： 10.16488/j.cnki.1005-9873.2015.04.007.

[3]范軼歐， 陳敏， 周雯， 等. 茶藨子葉狀層菌研究概況及開發(fā)利用[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報， 2013， 15（1）： 91-94. DOI： 10.13194/j.jlunivtcm.2013.01.93.fanyo.055.

[4]劉玉紅， 徐凌川， 王建平， 等. 茶藨子葉孔菌化學成分的研究[J]. 中藥材， 2005， 28（11）： 998-999. DOI： 10.13863/j.issn1001-4454.2005.11.014

[5]于秀玲， 白麗君， 李琳， 等. 茶藨子葉狀層菌化學成分及其體外抗病毒活性[J]. 中成藥， 2020， 42（7）： 1777-1781. DOI： 10.3969/j.issn.1001-1528.2020.07.019.

[6]牟玥靜， 方磊， 李佳， 等. 茶藨子葉狀層菌的化學成分及抗腫瘤活性研究進展[J]. 中國藥房， 2016， 27（4）： 542-544.

[7]王薪. 環(huán)棱褐孔菌水溶性提取物的化學成分研究[D]. 濟南： 山東中醫(yī)藥大學， 2002： 1-8.

[8]LIU Y H， WANG F S. Structural characterization of an active polysaccharide from Phellinus ribis[J]. Carbohydrate Polymers， 2007， 70（4）： 386-392. DOI： 10.1016/j.carbpol.2007.04.019.

[9]盧連華， 姚文環(huán)， 徐凌川， 等. 茶藨子葉孔菌（金芝）的急性毒性和遺傳毒性研究[J]. 環(huán)境與健康雜志， 2011， 28（9）： 830-831. DOI： 10.16241/j.cnki.1001-5914.2011.09.023.

[10]盧連華， 姚文環(huán)， 謝瑋， 等. 茶藨子葉孔菌大鼠90d喂養(yǎng)試驗研究[J]. 毒理學雜志， 2013， 27（2）： 103-106. DOI： 10.16421/j.cnki.1002-3127.2013.02.005.

[11]周麗思， 陳彤垚， 曾旭， 等. 不同生藥量忍冬莖水提物對茶藨子葉狀層菌發(fā)酵菌絲體生長和代謝產(chǎn)物的影響[J]. 食用菌學報， 2021， 28（3）： 78-85. DOI： 10.16488/j.cnki.1005-9873.2021.03.010.

[12]韓樹，張云，王俊儒. 栽培忍冬莖葉活性成分含量測定及其抑菌活性研究[J]．河 南 農(nóng) 業(yè) 科 學，2012，41（3）：133-136.

[13]韓樹. 忍冬莖葉化學成分及其抑菌活性的研究[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學， 2008.

[14]魯思愛. 忍冬藤的化學成分及其藥理應用研究進展[J]. 臨沂大學學報， 2012， 34（3）： 132-134. DOI： 10.3969/j.issn.1009-6051.2012.03.037.

[15]秦國培. 茶藨子葉狀層菌的深層發(fā)酵及其菌絲質(zhì)量標準研究[D]. 濟南： 山東中醫(yī)藥大學， 2011.

[16]侯曉梅， 陳敏青， 張慧蕾， 等. 中藥提取物對灰樹花深層發(fā)酵的影響[J]. 食品科技， 2013， 38（9）： 185-188. DOI： 10.13684/j.cnki.spkj.2013.09.033.

[17]景思佳， 張蕾， 劉洋， 等. 11種樟科樹枝水提物對樟芝液體培養(yǎng)的比較[J]. 浙江林業(yè)科技， 2019， 39（5）： 17-23. DOI： 10.3969/j.issn.1001-3776.2019.05.003.

[18]胡彩香. 阿魏提取物對阿魏菇菌絲生長及生物活性影響的研究[D]. 烏魯木齊： 新疆農(nóng)業(yè)大學， 2009.

[19]吳紅娟， 魯耀邦， 肖錦仁， 等. 松根液對發(fā)酵茯苓菌絲產(chǎn)量和多糖成分的影響[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志， 2010， 17（2）： 40-41. DOI： 10.3969/j.issn.1005-5304.2010.02.017.

[20]國家環(huán)境保護局. 水質(zhì)pH值的測定玻璃電極法：GB/T 6920—1986[S]. 北京：中國標準出版社，1987.

[21]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2015年版三部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015.

[22]陳飛， 馬閩卉， 梁運祥， 等. 不同品種靈芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體多糖和三萜含量的比較[J]. 食品科技， 2011， 36（9）： 19-22. DOI： 10.13684/j.cnki.spkj.2011.09.031.

[23]丁霄霄， 李鳳偉， 商曰玲， 等. 靈芝多糖的復合酶法提取工藝優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā)， 2020， 41（5）： 34-39. DOI： 10.12161/j.issn.1005-6521.2020.05.006.

[24]李曉紅， 鄒昀員， 田易玲， 等. 苯酚-硫酸法測定茶藨子葉狀層菌發(fā)酵菌絲多糖含量[J]. 山東中醫(yī)雜志， 2013， 32（5）： 346-348. DOI： 10.16295/j.cnki.0257-358x.2013.05.038.

[25]張惟杰. 復合多糖生化研究技術(shù)[M]. 上海： 上?？茖W技術(shù)出版社， 1987.

[26]左言美， 程顯好， 朱萌， 等. 錳離子脅迫對蛹蟲草菌絲體內(nèi)蟲草素、腺苷含量的影響[J]. 中國藥學雜志， 2013， 48（16）： 1363-1368. DOI： 10.11669/cpj.2013.16.008.