張傳津,牛華星,魏茂蓮,門曉冬,張志民

(山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心,濟(jì)南 250010)

三味拳參口服液是由拳參、穿心蓮、苦參三味藥經(jīng)現(xiàn)代化提取工藝制成的口服溶液劑,現(xiàn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版(中藥卷),廣泛應(yīng)用于集約化家禽養(yǎng)殖企業(yè),具有清熱解毒、燥濕止痢的功效,臨床用于治療濕熱泄瀉,雞大腸桿菌病等見于該證候者。日常監(jiān)督檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三味拳參口服液質(zhì)量標(biāo)存在一定的問題,一是標(biāo)準(zhǔn)中只規(guī)定了苦參及穿心蓮的薄層色譜鑒別方法,缺少拳參的質(zhì)量控制;二是該標(biāo)準(zhǔn)苦參的鑒別方法從樣品制備及展開系統(tǒng)都存在問題,此方法對(duì)照是采用苦參的指標(biāo)成份苦參堿、氧化苦參堿,但氧化苦參堿對(duì)照品及樣品在薄層色譜中皆無斑點(diǎn)顯示,導(dǎo)致結(jié)果無法判定,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1,2]。由于標(biāo)準(zhǔn)的不完善,致使有些不良企業(yè)為降低生產(chǎn)成本,未嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)處方投料,不加或少加拳參,從而影響產(chǎn)品質(zhì)量及實(shí)際臨床藥效;而且苦參薄層色譜法鑒別采用的展開劑是苯-丙酮-乙酸乙酯-濃氨試液(2∶3∶4∶0.2)[1],展開劑中苯具有較高毒性,被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布為Ⅰ類致癌物。將綠色環(huán)保理念貫穿于標(biāo)準(zhǔn)制定與修訂中,減少有毒有害試劑使用已成為我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)制修訂的必然趨勢(shì),《中國(guó)獸藥典》(2020版)的編修過程中,中國(guó)獸藥典辦公室著手組織開展了替代苯檢測(cè)方法的研究工作,并最終形成了一系列切實(shí)可行的無苯檢測(cè)方法。為提升與完善本產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)拳參、穿心蓮、苦參的薄層色譜方法開展研究,結(jié)果表明,所建立的方法簡(jiǎn)單高效、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好,專屬性強(qiáng),對(duì)環(huán)境友好。

1 材料與方法

1.1 儀器 BP211D 分析天平 (賽多利斯,德國(guó));瑞氏卡瑪LINOMAT5型薄層自動(dòng)點(diǎn)樣器、瑞氏卡瑪Visualizer薄層成像系統(tǒng)。

1.2 材料與試藥 三味拳參口服液自制樣品,批號(hào):2020031501;缺苦參自制陰性對(duì)照樣品,批號(hào):202012018,缺拳參自制陰性對(duì)照樣品,批號(hào):202011016,缺穿心蓮自制陰性對(duì)照樣品,批號(hào):202012018;苦參堿對(duì)照品,批號(hào):110805-200508;氧化苦參堿對(duì)照品(含量92.3%),批號(hào):110780-201007,沒食子酸對(duì)照品(含量89.9%),批號(hào):110831-201204,拳參對(duì)照藥材,批號(hào):121569-201602;穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品,批號(hào):110797-201108,均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。硅膠 G高效 薄層板,規(guī)格: 10×20 cm,分別購(gòu)自青島海洋化工有限公司(批號(hào) 20190622)和德國(guó) MN 公司(批號(hào) 405127);硅膠GF254薄層板,規(guī)格:10 cm×20 cm,分別購(gòu)自青島海洋化工有限公司(批號(hào):20180508)和德國(guó) MN 公司(批號(hào) 305129)。所用試劑均為分析純,水為超純水。

1.3 三味拳參口服液中苦參、穿心蓮薄層鑒別

1.3.1 供試品溶液的制備 取本品10 mL,加三氯甲烷25 mL,振搖提取,分取三氯甲烷層,蒸干,殘?jiān)右掖? mL使溶解,作為供試品溶液。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取氧化苦參堿、苦參堿對(duì)照品,加乙醇制成每1 mL各含1 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液;再取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。

1.3.3 缺苦參陰性對(duì)照樣品溶液的制備 取缺苦參陰性樣品10 mL,照2.1.1項(xiàng)下的方法制備。

1.3.4 缺穿心蓮陰性對(duì)照樣品溶液的制備 取缺穿心蓮陰性樣品10 mL,照2.1.1項(xiàng)下的方法制備。

1.3.5 薄層鑒別 吸取上述四種溶液各5μl,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(7∶H∶0.5∶0.2)為展開劑,展開,取出,晾干。分別置紫外光燈(254 nm)和日光下檢視。

1.4 三味拳參口服液中拳參的薄層鑒別

1.4.1 供試品溶液的制備 取本品5 mL,加乙酸乙酯,振搖提取2次,每次20 mL,合并提取液,置水浴上蒸干,殘?jiān)蛹状? mL使溶解,作為供試品溶液。

1.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取沒食子酸對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。

1.4.3 拳參對(duì)照藥材溶液的制備 取拳參對(duì)照藥材1 g,加水30 mL,超聲處理30分鐘,濾過,濾液用乙酸乙酯振搖提取2次,每次10 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解,作為對(duì)照藥材溶液。

1.4.4 缺拳參陰性對(duì)照樣品溶液制備 取缺拳參陰性對(duì)照樣品5 mL,照2.2.1項(xiàng)下的方法制備。

1.4.5 薄層鑒別 吸取上述三種溶液各2～5 uL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以 5%三氯化鐵溶液,檢視。

2 結(jié)果與分析

2.1 三味拳參口服液中苦參、穿心蓮薄層鑒別結(jié)果判定 在紫外光燈(254 nm)條件下檢視發(fā)現(xiàn):供試品色譜中,在與穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn);再噴以稀碘化鉍鉀試液,日光下檢視,供試品色譜中,在與氧化苦參堿、苦參堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾,說明本方法具有專屬性。圖譜見圖1、圖2。

1.苦參堿;2.氧化苦參堿;3.穿心蓮內(nèi)酯;4.三味拳參口服液;5.三味拳參口服液;6.缺苦參陰性;7.缺穿心蓮陰性圖1 紫外光燈(254 nm)下檢視Fig 1 View under ultraviolet lamp (254 nm)

1.苦參堿;2.氧化苦參堿;3.穿心蓮內(nèi)酯;4.三味拳參口服液;5.三味拳參口服液;6.缺苦參陰性;7.缺穿心蓮陰性圖2 日光下檢視Fig 2 Daylight view

2.2 三味拳參口服液中拳參的薄層鑒別結(jié)果判定 供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾,說明本方法專屬性可行。圖譜見圖3、圖4.

1.樣(4uL); 2.樣(2uL);3.陰性樣(5uL);4.陰性樣(2uL);5.沒食子酸對(duì)照(5uL);6.拳參對(duì)照藥材(3uL);7.拳參對(duì)照藥材(5uL);8.樣(5ul);9.樣(3uL)

(德國(guó)MN板)1.樣(2uL); 2.樣(5uL);3.樣(3uL);4.樣(5uL);5.沒食子酸對(duì)照(3uL); 6.沒食子酸對(duì)照(5uL)圖4 拳參的TLC圖譜Fig4 TLC chromatogram of Bistortae rhizoma

3 討論與結(jié)論

3.1 三味拳參口服液原標(biāo)準(zhǔn)修訂必要性 三味拳參口服液由拳參、穿心蓮、苦參三味藥味組成,其中拳參為蓼科植物拳參Polygonumbistorta L.的干燥根莖,具有清熱解毒、消腫、止血之功效,主治赤痢熱瀉、肺熱咳嗽等癥,目前獸醫(yī)臨床呼吸道、腸道混合感染較多,因此拳參兼具治療呼吸道、腸道疾病雙重藥效,在此組方中有君藥的作用[3-4];穿心蓮為爵床科穿心蓮 Andrographis paniculata(BurmF)Nees干燥地上部分,性味苦,寒?，F(xiàn)代藥理研究證明,主要藥效成分是穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類、黃酮類等[5],其具有良好的抗菌、抗病毒等效果,劉衍芬[6]等采用以穿心蓮為主藥的中藥復(fù)方制劑治療仔豬流行性腹瀉(PED)效果良好,胡宇莉等[7-8]研究表明,不同劑型、不同劑量穿心蓮對(duì)肉雞體液免疫、細(xì)胞免疫皆有促進(jìn)作用;李江北等[9]等在飲水中添加穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑治療大腸桿菌感染致肉雞腹瀉,效果顯著;苦參為豆科植物,味苦,性寒,具有清熱燥濕、殺蟲、利尿功能,是獸醫(yī)臨床上治療濕熱瀉痢的要藥。所以此方三味藥配伍相得益彰,藥效相加,缺一不可;原標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)苦參、穿心蓮進(jìn)行鑒別,缺少對(duì)拳參的質(zhì)量控制,而質(zhì)量是保證臨床有效性、安全性的基礎(chǔ),只有制定嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)才能更有效的控制其內(nèi)在質(zhì)量,發(fā)揮良好的藥效。

3.2 在苦參、穿心蓮TLC實(shí)驗(yàn)中, 供試品溶液制備方法的改進(jìn) 原標(biāo)準(zhǔn)供試品溶液的制備為“取本品10 mL,加三氯甲烷25 mL,搖勻,加濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至9.5,加熱回流1小時(shí),放冷,取三氯甲烷液蒸干,殘?jiān)右掖? mL使溶解,作為供試品溶液”[1];本試驗(yàn)將供試品溶液的制備優(yōu)化為“取本品10 mL,加三氯甲烷25 mL,振搖提取,分取三氯甲烷層,蒸干,殘?jiān)右掖? mL使溶解,作為供試品溶液”。經(jīng)試驗(yàn)比較,該制備方法提取效果更好,因?yàn)樵摦a(chǎn)品是經(jīng)過提取制備的口服溶液劑,所以取消了加熱回流1 h,也無需用濃氨試液調(diào)節(jié)pH,既節(jié)省了時(shí)間,又避免了加熱及堿性環(huán)境對(duì)氧化苦參堿的破壞[10]。

3.3 在苦參、穿心蓮TLC實(shí)驗(yàn)中,吸附劑及展開劑的優(yōu)化改進(jìn) 苦參堿、氧化苦參堿是苦參含量較高的兩種主要生物堿成份,所以是苦參質(zhì)量控制的主要指標(biāo)成份[3,11],二萜內(nèi)酯類成份穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮質(zhì)量控制的主要指標(biāo)成份[3,5],查閱苦參薄層鑒別相關(guān)文獻(xiàn)及《中國(guó)獸藥典》2020年版二部,所用到的吸附劑基本都是硅膠G薄層板或2%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分離度不理想,重現(xiàn)性差?！吨袊?guó)獸藥典》采用兩套展開劑,進(jìn)行2次展開,顯色劑為依次噴以碘化秘鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液,操作較繁瑣,效果不理想[3,12-14];在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)改進(jìn)了樣品處理方法,采用一次樣品處理、一套無苯薄層色譜鑒別系統(tǒng),采用硅膠GF254薄層板,同時(shí)鑒別苦參、穿心蓮,不僅節(jié)省了時(shí)間,提高了工作效率,而且無苯檢測(cè)方法環(huán)保安全。本方法分離效果好,專屬性強(qiáng),斑點(diǎn)清晰,操作簡(jiǎn)便、快捷,可以更好的對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.4 在苦參、穿心蓮的TLC實(shí)驗(yàn)中,不同點(diǎn)樣量的篩選 分別點(diǎn)樣2、3、5 uL,結(jié)果顯示,點(diǎn)樣量為5 uL時(shí),斑點(diǎn)顔色清晰,大小適宜,分離度好。

3.5 拳參鑒別指標(biāo)成份的選擇 有機(jī)酸及酚類是拳參的最主要成分,其中沒食子酸是拳參質(zhì)量控制的主要指標(biāo)成份[3,15-16]。在拳參的TLC實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照分別選擇了拳參對(duì)照藥材、沒食子酸,試驗(yàn)結(jié)果顯示拳參對(duì)照藥材顯示兩個(gè)斑點(diǎn),沒食子酸主斑點(diǎn)清晰,另一個(gè)斑點(diǎn)不清晰,而且陰性對(duì)照色譜在同一位置也有這個(gè)不清晰斑點(diǎn)。因此對(duì)照選擇采用沒食子酸,陰性樣品在主斑點(diǎn)沒食子酸相應(yīng)的位置上,未顯相同顏色的斑點(diǎn),說明該方法專屬性較好。

3.6 拳參鑒別顯色劑的確定 《中國(guó)獸藥典》2020年版二部對(duì)拳參的薄層鑒別展開后,置氨蒸氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰,最終結(jié)果呈現(xiàn)斑點(diǎn)顏色較淺,且氨蒸氣有刺激性臭味,而本試驗(yàn)采用5%三氯化鐵溶液作為顯色劑,斑點(diǎn)清晰穩(wěn)定,易于觀察,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3,17]。

3.7 拳參TLC實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同點(diǎn)樣量篩選 分別點(diǎn)樣2、3、4、5 uL,結(jié)果顯示,點(diǎn)樣量為2～5 uL時(shí),斑點(diǎn)顔色清晰,大小適宜,分離度好。

3.7 薄層板耐用性 以上實(shí)驗(yàn)均用進(jìn)口薄層板和國(guó)產(chǎn)薄層板進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn),均達(dá)到較好的分離效果,說明本方法具有較好的耐用性。

通過薄層鑒別控制三味拳參口服液中苦參、穿心蓮及拳參的質(zhì)量,使標(biāo)準(zhǔn)更加完善,因?yàn)門CL法不僅能夠定性,還具有半定量的效果,從而更好地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。