魏秀麗,張傳津*,劉道中,李有志*,楊志昆,陳志強(qiáng)

(1.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心;2.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測與精準(zhǔn)化用藥山東省工程實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250022)

楊樹花口服液是《中國獸藥典》2020年版第二部中收載的產(chǎn)品,主要由楊樹花經(jīng)提取制成的合劑,功能化濕止痢,主治痢疾和腸炎,廣泛用于馬牛羊豬大動物和兔家禽[1-3];但2020年版《中國獸藥典》楊樹花口服液質(zhì)量控制有薄層鑒別,沒有含量測定項(xiàng),容易被非法企業(yè)非法添加其他化合物。據(jù)賈紀(jì)萍和韓立等報(bào)道楊樹花中含有豐富的黃酮類蒽醌類等物質(zhì)[4-9],楊樹花口服液中有多種有效成分:芹菜素、木犀草素、槲皮素和水楊苷、多糖、黃酮類、有機(jī)酸、強(qiáng)心甙、內(nèi)酯及香豆素,蒽醌類化合物、甾醇、酚類或鞣質(zhì)[10-12]等,均未見其含有甘草酸的報(bào)道。魏秀麗和龔旭昊[13-15]報(bào)道在楊樹花口服液中檢出過非法添加的黃芩苷,環(huán)丙沙星和乙酰甲喹等。由于標(biāo)準(zhǔn)本身不可能針對所有的添加物進(jìn)行質(zhì)量控制,所以需要檢驗(yàn)人員熟悉楊樹花口服液的圖譜,并對處方外的成分進(jìn)行辨識。本實(shí)驗(yàn)室在監(jiān)督抽檢獸藥樣品過程中,發(fā)現(xiàn)一批次標(biāo)稱楊樹花口服液薄層鑒別不合格,而且檢出了處方外成分。本研究使用UPLC-PDA聯(lián)合UPLC-MS/MS法通過對比色譜圖保留時間和光譜圖的峰形結(jié)果及質(zhì)譜圖,來判定其非法添加物,以期為獸藥監(jiān)管提供依據(jù)和借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平(感量0.01 g、0.00001 g, 瑞士Mettler公司);Waters AcquityTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司);AB 4000 Q TRAP液質(zhì)(美國AB公司)。

1.2 藥品及試劑 甘草酸對照品(含量94.4%,批號:110731-202122,中國食品藥品檢定研究院);乙腈、甲醇、磷酸(色譜純, 德國默克公司);水為一級水自制。企業(yè)報(bào)批產(chǎn)品作為陰性對照樣品;監(jiān)督抽檢產(chǎn)品:一批標(biāo)稱楊樹花口服液。

2 方法與結(jié)果

2.1 超高效液相色譜-二極管陣列檢測法色譜條件 色譜柱:waters T3色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm);流動相A:乙腈(0.1%磷酸);流動相B:水(0.1%磷酸),梯度洗脫;流速:0.35 mL/min;進(jìn)樣量:0.1-5 μL;柱溫:40 ℃,進(jìn)樣室溫度10 ℃。二極管陣列檢測器,3D掃描范圍:190-400 nm,檢測波長為251 nm。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 液相梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution condition

2.2 超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法色譜條件 采用AB 4000 Q TRAP液質(zhì),waters BEH C18 色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流速0.3 mL/min,進(jìn)樣量1-5 μL;柱溫40 ℃;流動相:A:乙腈;B:水;色譜洗脫條件如表2所示:

表2 液質(zhì)色譜洗脫梯度Tab 2 Liquid chromatography elution gradient

串聯(lián)質(zhì)譜條件為:使用電噴霧離子源,負(fù)離子掃描模式,離子噴霧電壓(IS): -4500V;離子源溫度:550 ℃;氣簾氣(CUR):20 L/min;霧化氣(GS1):55 L/min;輔助氣(GS2):55 L/min。

離子對及質(zhì)譜參數(shù)如表3所示:

表3 甘草酸母離子子離子及質(zhì)譜參數(shù)表Tab 3 glycyrrhizic acid mother ion daughter ion and mass spectrometry parameter table

2.4 樣品制備

2.4.1 陰性樣品 報(bào)批樣品作為陰性樣品。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液及工作液的制備 精密稱取甘草酸對照品約20 mg,置于50 mL量瓶中,加50%甲醇適量,置水浴中振搖使溶解,放置至室溫,稀釋至刻度,搖勻,即得約400 μg/mL的對照儲備液,-20 ℃冰箱保存。

2.4.3 超高效液相色譜法工作液的制備 精密量取儲備液適量,至10 mL容量瓶中,配置成200 μg/mL的工作液,4 ℃冰箱保存,用于超高效液相色譜的標(biāo)準(zhǔn)工作液使用。

2.4.4 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法工作液的制備 取200 μg/mL的工作液用液相串聯(lián)質(zhì)譜方法中的初始比例流動相適量倍比稀釋,得5、10、25、40、50、100 ng/mL的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜用的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。最終取濃度為25 ng/mL的甘草酸作為UPLC-MS/MS對照溶液。

2.4.5 陽性添加樣品的制備 取楊樹花口服液1.0 mL,加入甘草酸對照品溶液5 mL,置10 mL量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。重復(fù)配制6份,進(jìn)樣,計(jì)算甘草酸添加量和回收率平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

該課程中使用的形成性評價(jià)指標(biāo)有：公司考勤、經(jīng)營進(jìn)度、過程正確率、經(jīng)營能力提升度四個大類，每一個評價(jià)指標(biāo)都在形成性評價(jià)過程中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。

2.5 提取凈化方法

2.5.1 樣品提取 精密量取空白樣品、待測樣品1 mL,置10 mL量瓶中,加50%甲醇適量,超聲處理30分鐘使溶解,放置至室溫,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取濾液作為UPLC-PDA供試品溶液。

2.5.2 樣品稀釋 取適量母液,用初始流動相水:乙腈=(95∶5)稀釋適宜倍數(shù),用濾膜(0.22 μm)濾過,取濾液作為UPLC-MS/MS供試品溶液。(根據(jù)供試品UPLC-PDA測定的含量值,稀釋適量倍數(shù)至約25 ng/mL的濃度,供超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜上機(jī)測定,本批次楊樹花樣品多次稀釋累計(jì)20000倍,上液質(zhì)測定。)

2.6 方法線性考察及添加回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 UPLC-PDA專屬性 在選定的色譜條件下,測得甘草酸色譜峰峰形良好,且均達(dá)到基線分離,在2.1項(xiàng)條件下,甘草酸對照品和楊樹花口服液樣品待測液,色譜保留時間為20.1 min左右,保留時間相差不超過+0.1 min; 分離度遠(yuǎn)大于1.5,理論塔板數(shù)達(dá)2.6-3.2×105,見圖1-3,均滿足檢測要求, 純度角和純度閾值均滿足要求,見表4。

圖1 楊樹花口服液樣品UPLC色譜圖Fig 1 UPLC chromatogram of Yangshuhua koufuye sample

圖2 200 μg/mL甘草酸對照溶液色譜圖(進(jìn)樣量0.1 μL)Fig 2 UPLC Chromatography of 200 μg/mL glycyrrhizic acid reference solution Injection volume:0.1 μL

圖3 200 μg/mL甘草酸對照品溶液UPLC色譜圖 (進(jìn)樣量1 μL)Fig 3 UPLC chromatogram of 200 μg/mL glycyrrhizic acid reference solution Injection volume 1 μL

表4 不同樣品的色譜參數(shù)表Tab 4 Table of chromatographic parameters for different samples

本研究利用PDA檢測器采集甘草酸的對照溶液光譜圖,在波長190-400 nm范圍內(nèi)掃描,發(fā)現(xiàn)甘草酸在251 nm處有最大吸收,故選擇251 nm作為兩者的檢測波長,光譜圖見圖4-5。

圖4 甘草酸對照品溶液光譜圖Fig 4 Spectrogram of glycyrrhizic acid reference solution

圖5 楊樹花口服液中甘草酸光譜圖Fig 5 Spectrogram of glycyrrhizic acid inYangshuhua koufuye

而且待測樣品色譜圖中出現(xiàn)色譜峰與相應(yīng)對照品主峰保留時間一致(差異小于等于±5%)。陽性添加樣品的光譜圖、色譜圖與對照品和待測樣品的圖譜較一致,純度角小于純度閾值說明純度高、無包裹共流出物,確證樣品中添加了甘草酸。對照品和待測樣品的純度角純度閾值圖見圖6-7,陽性添加樣品的色譜圖見圖8,報(bào)批合格樣品中不含甘草酸,色譜圖見圖9。

表8 甘草酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 8 Result of glycyrrhizic acid Sample Addition Recovery Test

進(jìn)樣量體積μL進(jìn)樣量ng峰面積0.120488710.240954270.510023841312004782722400964726510002417810

圖6 甘草酸對照品溶液純度閾值圖Fig 6 Purity threshold of glycyrrhizic Acid reference solution

圖7 楊樹花口服液樣品中甘草酸純度閾值圖Fig 7 Purity threshold of glycyrrhizic Acid in Yangshuhua koufuye

圖8 楊樹花口服液添加樣品甘草酸色譜圖Fig 8 UPLC Spectrogram of glycyrrhizic acid with positive addition sample of Yangshuhua koufuye

圖9 楊樹花口服液報(bào)批合格樣品色譜圖Fig 9 UPLC Spectrogram of Yangshuhua koufuye Samfor approval

2.6.2 UPLC-PDA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取甘草酸對照品工作溶液適量,以不同的體積:0.1、0.2、0.5、1,2、5 μL進(jìn)樣,以進(jìn)樣量(μg)和峰面積響應(yīng)值為X和Y,來繪制校準(zhǔn)曲線。

甘草酸在20-1000 ng范圍內(nèi),線性良好,對照曲線為y=2419.3537x-2423.9239,R2=1.0000 。對照曲線見圖10.

圖10 甘草酸對照曲線圖Fig 10 Standard curve diagram of glycyrrhizic acid

2.6.3 UPLC-PDA方法的檢出限和定量限 對甘草酸對照品溶液,倍比稀釋成含甘草酸約5、10、20、50 μg/mL的溶液,進(jìn)行UPLC分析,以溶液檢測時的信噪比(S/N)分別大于等于3,且光譜圖不失真為前提,結(jié)果20 μg/mL作為藥物的檢出限。以溶液檢測時的信噪比(S/N)分別大于等于10,且光譜圖不失真為前提,結(jié)果50 μg/mL作為藥物的定量限。

2.6.4 UPLC-PDA方法的準(zhǔn)確度和精密度 待測樣品楊樹花口服液,通過六次樣品平行處理的檢測,平均含量為0.528 mg/mL;添加量為0.964 mg/mL時,實(shí)際回收率平均值102.8%,變異系數(shù)0.32%,完全滿足檢測需求。

2.6.5 UPLC-MS/MS專屬性 在質(zhì)譜中,對照品和待測楊樹花口服液中的甘草酸在5.87 min左右出峰,保留時間和兩個定性離子對都非常一致,未知樣品主成分進(jìn)一步確證為甘草酸。稀釋至含25 ng/mL左右的甘草酸待測樣品溶液進(jìn)樣量1 μL,其特征離子質(zhì)量色譜圖見圖11。甘草酸 821.5>351.0定量離子對保留時間5.87 min,峰面積1.148E4,峰高3.024E3,信噪比S/N為30.2;甘草酸821.5>193.2定性離子對保留時間5.87 min,峰面積3.795E3,峰高1.143E3, 信噪比S/N為11.4。

3 討論與結(jié)論

3.1 如何初步判斷發(fā)現(xiàn)處方外成分 近十年來,每年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下達(dá)的獸藥監(jiān)督抽檢任務(wù),都特別注重獸藥中非法添加物的測定,并對獸藥抽檢的不合法生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)控、處罰甚至吊銷生產(chǎn)許可。如何來判定其處方外添加了化合物,添加了何種化合物,是難點(diǎn)。所以我們查閱了大量的文獻(xiàn),楊樹花藥材中會含有豐富的黃酮類物質(zhì)、多糖、氨基酸、植物甾醇等[4-9],楊樹花口服液中韓立等曾報(bào)道含有蒽醌類、槲皮素、水楊酸等[10-12];曾經(jīng)檢出處方外不該含有哪些物質(zhì),如魏秀麗等報(bào)道[13-15]在楊樹花口服液中檢出過非法添加的黃芩苷,環(huán)丙沙星和乙酰甲喹等。采用報(bào)批合格的楊樹花口服液作為陰性樣品,觀察其色譜特征圖譜和光譜圖,對比待測的抽檢樣品楊樹花口服液的色譜峰和光譜圖,并查看異常峰及其光譜圖,我們發(fā)現(xiàn)了含量高的一個色譜峰光譜圖與甘草酸光譜圖一致,是特意處方外非法添加物。

3.2 如何初步確定處方外成分 UPLC-PDA方法中,在相同實(shí)驗(yàn)條件下,供試品色譜圖中如出現(xiàn)色譜峰與相應(yīng)對照品主峰保留時間一致(差異小于等于±5%)、在190-400 nm波長范圍內(nèi),兩者光譜圖無明顯差異,最大吸收處波長一致(差異小于等于±2 nm),則初步判為檢出被測試藥物為甘草酸。供試品色譜圖中如出現(xiàn)與相應(yīng)對照品保留時間一致的色譜峰,但小于檢出限,判定為未檢出被測試藥物。

3.3 如何最終確證處方外成分 在UPLC-MS/MS方法中,通過母離子和子離子定量離子對和定性離子對的比較,進(jìn)一步確證處方外非法添加物為甘草酸;由于樣品稀釋了20000倍,依然具有卓越的檢測能力,其實(shí)與UPLC-PDA方法相比,大大提升了檢出限和定量限,顯示了液質(zhì)的準(zhǔn)確性和優(yōu)越性。

綜上所述,使用UPLC-PDA聯(lián)合UPLC-MS/MS法檢測本批次標(biāo)稱為楊樹花口服液中的甘草酸,精準(zhǔn)快捷、經(jīng)濟(jì)環(huán)保,能有效控制楊樹花口服液的質(zhì)量。而且這是本實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)楊樹花口服液中非法添加甘草酸,以中國知網(wǎng)的搜索結(jié)果來看,暫時未發(fā)現(xiàn)相同的報(bào)道。