涂 敏,趙 蕾,史愛(ài)華,沈 佳,習(xí) 碩,張建偉,彭 湃,王海良,章振華*,靳 換*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100097; 2.北京翎羽生物科技有限公司, 北京 101302;3.北京市獸藥飼料檢測(cè)中心,北京 102200。)

鴿Ⅰ型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus type Ⅰ,PPMV-Ⅰ),又稱鴿新城疫病毒,其引起的臨床癥狀與雞新城疫相似,常見(jiàn)腸炎、下痢和神經(jīng)癥狀,尤以嗜神經(jīng)速發(fā)型多見(jiàn)[1]。各年齡段鴿均易感染,發(fā)病率可達(dá)80%,死亡率可達(dá)50%以上。

新城疫在世界范圍內(nèi)呈地方流行,因此世界各國(guó)對(duì)該疫病的發(fā)生和流行均高度重視[2]。雖然世界各國(guó)充分認(rèn)識(shí)到了新城疫的危害,促進(jìn)了新城疫疫苗的研發(fā)和開(kāi)發(fā),免疫預(yù)防策略得到高度重視,但是賽鴿、觀賞鴿和肉鴿等作為新城疫強(qiáng)毒的潛在來(lái)源則被忽視。正因?yàn)槿绱?鴿子作為媒介在短時(shí)間里把新城疫病毒傳播到世界各國(guó),造成了大流行,此次流行主要?dú)w咎于賽鴿。1981年到1984年,PPMV-Ⅰ通過(guò)賽鴿迅速傳遍整個(gè)歐洲[3,4]。美國(guó)第一例PPMV-Ⅰ是1984年在紐約分離得到的,隨后1990～1998年間,美國(guó)國(guó)家獸醫(yī)局先后在東海岸地區(qū)、加利福尼亞州和德克薩斯州等地,從鴿群中分離到PPMV-Ⅰ,分離到的這些毒株基本都屬于基因Ⅵb亞型。2001年到2009年間,Pchelkina等人對(duì)從俄羅斯分離得到的77株P(guān)PMV-Ⅰ進(jìn)行測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)這些毒株都屬于基因Ⅵ型[5]。我國(guó)最早于1985年和1986年在深圳和珠海的進(jìn)口鴿中分離到PPMV-Ⅰ,隨后我國(guó)多個(gè)省市出現(xiàn)鴿新城疫的報(bào)道。我國(guó)目前鴿群中主要流行的毒株為基因Ⅵb亞型,該基因型對(duì)鴿有明顯的宿主特異性,在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上形成了一個(gè)獨(dú)立的分支[6-7]。到目前為止,除了主要的新城疫基因Ⅶ型流行株外,其他基因型的毒株依然存在[8,9]。尤其是對(duì)鴿有明顯宿主特異性的Ⅵ型毒株,由于疫苗和其他生物制品的缺失,以及隨著我國(guó)養(yǎng)鴿業(yè)的迅速發(fā)展和在發(fā)展過(guò)程中凸顯出來(lái)的不平衡因素導(dǎo)致鴿新城疫給養(yǎng)鴿業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。

到目前為止,疫苗的免疫接種是防治新城疫最有效的手段,其不僅可以減輕發(fā)病和死亡的經(jīng)濟(jì)損失,而且還可以降低強(qiáng)毒感染后的排毒量。目前常規(guī)的新城疫疫苗主要是弱毒疫苗和滅活疫苗,包括Ⅰ系疫苗(Mukteswar株)[10]、Ⅱ系疫苗(Hitchner B1)[11,12]、Ⅲ系疫苗(F株)[13]、Ⅳ系疫苗(Lasota株與Clone30株)[14,15]和V4疫苗株[16],由于市場(chǎng)上的這些疫苗主要是為防控雞新城疫而開(kāi)發(fā)的,雖然在實(shí)際應(yīng)用中能為鴿提供一定的免疫保護(hù),但是效果不佳,經(jīng)常出現(xiàn)免疫過(guò)的鴿場(chǎng)散發(fā)鴿新城疫的現(xiàn)象。其主要原因是由于疫苗毒株與流行毒株之間存在抗原差異。PPMV-Ⅰ為基因Ⅵ型,在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上形成了一個(gè)獨(dú)立的分支[17,18],而疫苗株主要屬于基因Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等基因型,其與基因Ⅵ型的鴿新城疫病病毒遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),存在明顯的抗原差異性;另外,交叉血凝抑制試驗(yàn)和交叉中和實(shí)驗(yàn)表明PPMV-Ⅰ與常用的疫苗Lasota株和強(qiáng)毒株之間存在顯著的抗原差異[19],表明了基因Ⅵ型的鴿新城疫病毒抗原發(fā)生了變異。用于疫苗免疫的毒株與流行毒株基因型越接近,則保護(hù)效果越好,群體帶毒和排毒量越低[20]。因此,研發(fā)與目前流行毒株匹配的基因Ⅵ型新城疫疫苗將有利于我國(guó)鴿新城疫的防控,對(duì)保障鴿養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義。本研究利用基因Ⅵ新城疫致弱毒株rGX-mF制備滅活疫苗,評(píng)價(jià)該疫苗的免疫效果,為鴿新城疫的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 鴿新城疫病毒弱毒rGX-mF 株和雞新城疫病毒弱毒株La Sota株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10日齡SPF雞胚,3周齡和6周齡SPF雛雞購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司;1日齡雛雞:SPF種蛋購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司,在本實(shí)驗(yàn)室孵化出雛;1月齡～2月齡鴿新城疫病毒抗體陰性鴿,購(gòu)自某鴿廠。

1.2 方法

1.2.1 種毒的傳代增殖及無(wú)菌檢驗(yàn) 將rGX-mF 株第一代種毒E1原液用滅菌生理鹽水按照1∶10000 倍進(jìn)行稀釋,經(jīng)尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚,0.1 mL/胚。接種后24 h內(nèi)死胚棄去,收獲24 h～120 h死胚及120 h活胚,測(cè)定HA效價(jià),收獲HA效價(jià)為210以上的尿囊液,-80 ℃保存?zhèn)溆?。按此方法將種毒連續(xù)傳6代,命名為E1～E6。每代次毒種測(cè)定HA效價(jià)、雞胚半數(shù)感染量(EID50)以及進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

1.2.2 種毒的遺傳穩(wěn)定性 參考引物F:5’-GTCAGTTTACCTGCCTAT-3’,R:5’-CTCCGACCGTTCTAC-3’,擴(kuò)增插入的La Sota F基因序列。提取E1～E6各代次種毒的病毒基因組RNA,利用隨機(jī)引物對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn),對(duì)擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3 種毒毒力的測(cè)定 根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH) 推薦的判定標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)測(cè)定種毒的雞胚最小致死量的平均死亡時(shí)間(MDT)、1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)以及6周齡雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)來(lái)判定rGX-mF種毒毒力的強(qiáng)弱。

1.2.4 滅活疫苗的制備 rGX-mF株毒種用滅菌生理鹽水稀釋按照1:10000倍,接種10日齡SPF雞胚,每胚接0.1 mL,置37 ℃繼續(xù)孵育。將接種后24 h內(nèi)死胚棄去,24 h～120 h死胚及120 h活胚及時(shí)收取尿囊液,將HA效價(jià)為29及以上的樣品混合。測(cè)定混合后樣本的HA效價(jià)為210,病毒滴度為109.3EID50/0.1 mL。將測(cè)定好效價(jià)的病毒液導(dǎo)入滅活瓶?jī)?nèi),加入終濃度為0.1%的甲醛溶液使其充分混合,置搖床160轉(zhuǎn)/min,37 ℃滅活24 h。滅活后的病毒原液按常規(guī)方法制備油佐劑滅活疫苗。用同樣的方法制備La Sota株滅活疫苗。

1.2.5 滅活疫苗的安全性試驗(yàn) 將制備的rGX-mF株滅活疫苗免疫1～2月齡非免疫鴿10只,每只肌肉注射疫苗0.4 mL,同時(shí)設(shè)對(duì)照5只,在相同的條件下飼養(yǎng),連續(xù)觀察14日,記錄試驗(yàn)鴿采食、飲水及精神狀態(tài)。觀察疫苗接種后局部和全身不良反應(yīng)情況。

1.2.6 抗體產(chǎn)生時(shí)間及免疫持續(xù)期 將15只鴿新城疫抗體陰性的雛鴿分為2組,免疫組10 只,對(duì)照組5只。將rGX-mF株滅活疫苗經(jīng)胸部肌肉注射免疫,0.2 mL/只,分別于免疫后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、16、20、24、28、32、36、40、44、48和52周對(duì)兩組鴿子進(jìn)行翅靜脈采血分離血清,檢測(cè)抗體水平,結(jié)果以 log2 表示,確定免疫后抗體產(chǎn)生的規(guī)律及持續(xù)期。

1.2.7 rGX-mF株與La Sota株滅活疫苗免疫原性的對(duì)比試驗(yàn) 將20只1～2月齡鴿新城疫抗體陰性的雛鴿隨機(jī)分為2組,rGX-mF株組和La Sota株組,每組10 只。將rGX-mF株滅活疫苗和La Sota株滅活疫苗分別經(jīng)胸部肌肉注射免疫,0.2 mL/只,分別于免疫后第21和28天對(duì)兩組鴿子進(jìn)行翅靜脈采血分離血清,檢測(cè)抗體水平,結(jié)果以 log2 表示,對(duì)比分析兩種疫苗產(chǎn)生抗體的差異。

亞急性甲狀腺炎是一種常見(jiàn)于的內(nèi)分泌腺病變，直接原因?yàn)椴《靖腥?，其發(fā)病率和人們的生活方式和環(huán)境密切相關(guān)，主要是由綜合因素引起的炎癥反應(yīng)，常見(jiàn)的因素包括環(huán)境因素、內(nèi)分泌因素、消化系統(tǒng)因素和精神因素等。臨床發(fā)生亞急性甲狀腺炎的原因通常為內(nèi)外相互作用的結(jié)果，所以亞急性甲狀腺炎的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜[1]。亞急性甲狀腺在診斷上存在一定的難度，為了提高診斷的準(zhǔn)確率，減少對(duì)亞急性甲狀腺炎診斷的漏診和誤診率，必須提高診斷的準(zhǔn)確率。臨床研究發(fā)現(xiàn)[1]，本文將選取我院2016年5月—2017年5月收治的60例亞急性甲狀腺炎診斷患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1.2.8 rGX-mF株滅活疫苗對(duì)不同宿主免疫原性的對(duì)比試驗(yàn) 分別取10只3周齡SPF雞作為雞免疫組,取10只1～2月齡鴿新城疫抗體陰性的雛鴿作為鴿免疫組。將rGX-mF株滅活疫苗經(jīng)胸部肌肉注射免疫,0.2 mL/只,分別注射雞免疫組和鴿免疫組,于免疫后第7,14,21和28天對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行翅靜脈采血分離血清,檢測(cè)抗體水平,結(jié)果以 log2 表示,對(duì)比分析 rGX-mF株滅活疫苗在不同宿主中產(chǎn)生抗體水平的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 種毒的傳代增殖及無(wú)菌檢驗(yàn) rGX-mF株毒種經(jīng)SPF雞胚連續(xù)傳代后,各個(gè)代次種毒的HA效價(jià)在1:1024～1:2048之間,毒價(jià)均在108.7EID50/0.1 mL以上,無(wú)菌檢驗(yàn)合格,結(jié)果見(jiàn)表1。以上結(jié)果表明rGX-mF株病毒能在SPF雞胚中維持較高且穩(wěn)定的毒價(jià)。

表1 rGX-mF株E1～E6代毒種無(wú)菌、支原體檢驗(yàn)及病毒含量測(cè)定結(jié)果Tab 1 The sterility test, mycoplasma test and virus titer of E1～E6 generation viruses of rGX-mF strain

2.2 種毒的遺傳穩(wěn)定性 將E1～E6代種毒的F基因進(jìn)行測(cè)序,對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,F基因序列中的核苷酸未發(fā)生任何突變或缺失,rGX-mF株種毒能夠在SPF雞胚中連續(xù)穩(wěn)定的傳代。

圖1 rGX-mF 株E1-E6代F基因核苷酸序列比對(duì)Fig 1 Comparison of the nucleotide sequence of the F gene in the rGX-mF strain E1-E6

2.3 種毒毒力的測(cè)定 用于評(píng)價(jià)新城疫毒力的方法有MDT、ICPI及 IVPI。取1日齡SPF雛雞10只,雞只經(jīng)腦內(nèi)接種rGX-mF株 E5代種毒后,觀察的8天,10只雛雞全部正常,計(jì)算ICPI為0,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 rGX-mF株對(duì)1日齡SPF雛雞的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)Tab 2 Intracerebral pathogenicity index (ICPI) of rGX-mF strain in 1-day-old SPF chicks

用滅菌生理鹽水將收獲新鮮的含毒尿囊液做10倍系列稀釋從10-1至10-9共9個(gè)稀釋度,分別接種10日齡SPF雞胚,上午8點(diǎn)每個(gè)稀釋度接種5個(gè)雞胚,每胚尿囊腔內(nèi)注射0.1 mL,標(biāo)記為A組。接種后剩余的病毒稀釋液放4 ℃保存,下午5點(diǎn)每個(gè)稀釋度分別再接種剩余的5個(gè)雞胚,標(biāo)記為B組。接種后,每天分別于上午8點(diǎn)和下午5點(diǎn),對(duì)A組和B組雞胚分別各照蛋一次,記錄每一雞胚的死亡時(shí)間,并測(cè)定每胚HA效價(jià), 7天后,將所有活胚冷卻,測(cè)定每胚HA效價(jià)。A組和B組接種的雞胚全部死亡的最高稀釋度即為最小致死量,計(jì)算最小致死量的平均死亡時(shí)間。結(jié)果表明,120 h以內(nèi)每個(gè)稀釋度的雞胚均沒(méi)有全部死亡,因此判定結(jié)果為MDT≥120 h,結(jié)果見(jiàn)表3A和表3B。

表3 A rGX-mF株對(duì)雞胚最小致死量的平均死亡時(shí)間(MDT/MLD)Tab 3 A The mean time to death (MDT/MLD) of minimum lethal dose of rGX-mF strain on chicken embryos

取6周齡SPF雛雞10只,用1 mL一次性注射器各靜脈注射10-1稀釋的新鮮rGX-mF株 E5代毒種0.1 mL。另取5只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各0.1 mL。接種后,每天在相應(yīng)接種的時(shí)間觀察、記錄雛雞情況,包括正常、發(fā)病、癱瘓或出現(xiàn)其他神經(jīng)癥狀和死亡。觀察10天,計(jì)算分?jǐn)?shù),正常為0,發(fā)病為1,癱瘓或出現(xiàn)神經(jīng)癥狀為2,死亡為3。IVPI是指每只雞10天內(nèi)所有每次觀察數(shù)值的平均值,計(jì)算IVPI=0,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 rGX-mF株對(duì)6周齡SPF雛雞的靜脈致病指數(shù)(IVPI)Tab 4 Intravenous pathogenicity index (IVPI) of rGX-mF strain in 6-weeks-old SPF chicks

2.4 滅活疫苗的制備 按常規(guī)方法制備rGX-mF株油佐劑滅活疫苗,油水比為2∶1。經(jīng)檢驗(yàn),rGX-mF株滅活疫苗性狀如下:為乳白色均勻乳劑;W/O型,將疫苗滴入水中除第一滴外,均呈滴狀不擴(kuò)散;黏度為74.10 cP;穩(wěn)定性,吸取10 mL疫苗,3500轉(zhuǎn)/min,離心15 min,管底無(wú)水相析出;無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

2.5 滅活疫苗的安全性試驗(yàn) 與對(duì)照組鴿相比,免疫組鴿采食和飲水正常,精神狀態(tài)良好,注射部位疫苗吸收良好、無(wú)結(jié)塊和腫脹等炎性反應(yīng),注射疫苗未對(duì)雛鴿產(chǎn)生不良影響。

2.6 抗體產(chǎn)生時(shí)間及免疫持續(xù)期 免疫后第1～52周采集免疫組和對(duì)照組鴿翅靜脈血,分離血清,進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn),檢測(cè)血清中抗體水平,確定免疫后抗體產(chǎn)生的規(guī)律及持續(xù)期。結(jié)果顯示,免疫組在免疫后至52周監(jiān)測(cè)期結(jié)束均可產(chǎn)生一定效價(jià)的抗體,對(duì)照組無(wú)抗體(圖3)。rGX-mF株滅活疫苗免疫組在免疫后第7、8周免疫鴿的抗體水平達(dá)到最高,HI抗體滴度幾何平均值為8.8 log2,且其在免疫后第52周還可以產(chǎn)生較高的抗體水平,HI抗體滴度幾何平均值為5.6 log2(圖2)。

圖2 rGX-mF株滅活疫苗抗體的產(chǎn)生期和持續(xù)期Fig 2 The antibody production and duration of rGX-mF inactivated vaccine

圖3 rGX-mF株La Sota株滅活疫苗免疫鴿產(chǎn)生抗體的差異Fig 3 Difference of antibody production in pigeons immunized with rGX-mF strain and La Sota strain Inactivated vaccine

2.7 rGX-mF株滅活疫苗與La Sota株滅活疫苗的對(duì)比試驗(yàn) 測(cè)定rGX-mF株疫苗免疫組和La Sota株疫苗免疫組血清中的抗體水平,對(duì)比分析兩種疫苗產(chǎn)生抗體的差異。結(jié)果顯示,兩組免疫組免疫21和28天后均可產(chǎn)生一定效價(jià)的抗體,rGX-mF株滅活疫苗免疫組的抗體效價(jià)明顯高于La Sota株滅活疫苗免疫組,并且差異顯著(圖3)。

2.8 rGX-mF株滅活疫苗對(duì)不同宿主免疫原性的對(duì)比試驗(yàn)

檢測(cè)rGX-mF株滅活疫苗在雞免疫組和鴿免疫組血清中的抗體水平,對(duì)比分析rGX-mF株滅活疫苗在不同宿主中產(chǎn)生抗體水平的差異。結(jié)果顯示免疫后7,14,21和28天,SPF雞產(chǎn)生的抗體水平顯著高于鴿(圖4)。

圖4 rGX-mF 株滅活疫苗免疫鴿和雞產(chǎn)生抗體的差異Fig 4 Difference of antibody production between pigeons and chickens immunized with rGX-mF strain Inactivated vaccine

3 討 論

基因Ⅵ型鴿新城疫病毒在世界范圍內(nèi)的鴿群中廣泛流行,給養(yǎng)鴿業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)目前對(duì)鴿新城疫的防控主要是以疫苗免疫為主,但是用于鴿免疫的疫苗株都是雞源新城疫疫苗,對(duì)鴿不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。研發(fā)與目前流行毒株基因型一致的鴿新城疫疫苗,可以有效的控制鴿新城疫的病程,為鴿群提供良好的免疫保護(hù),降低鴿新城疫的防控成本?；颌鲂网澬鲁且卟《居忻黠@的宿主特異性,主要感染鴿[23,24]。因此,本研究利用基因Ⅵ型鴿新城疫病毒弱毒株rGX-mF制備滅活疫苗,評(píng)估其免疫原性,為鴿新城疫滅活疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

WOAH規(guī)定禁止使用新城疫病毒強(qiáng)毒株制備新城疫疫苗,本研究首先測(cè)定rGX-mF株的毒力,結(jié)果顯示rGX-mF株的MDT大于120 h,ICPI=0, IVPI=0。依據(jù)WOAH的判定標(biāo)準(zhǔn),rGX-mF株為弱毒株。將rGX-mF株在SPF雞胚上連續(xù)傳代,各個(gè)代次種毒的HA效價(jià)在1:1024～1:2048之間,毒價(jià)均在108.7EID50/0.1 mL以上。將各個(gè)代次病毒的F基因進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示F基因序列中的核苷酸未發(fā)生任何突變或缺失,表明rGX-mF株在SPF雞胚中具有穩(wěn)定的遺傳能力。以上研究結(jié)果表明,rGX-mF株具有毒力弱,繁殖能力高和遺傳穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。

本研究將rGX-mF株制備成油佐劑滅活疫苗,對(duì)該疫苗的免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用制備合格的rGX-mF滅活疫苗,免疫1～2月齡雛鴿,免疫后鴿采食和飲水正常,精神狀態(tài)良好,注射部位疫苗吸收良好、無(wú)結(jié)塊和腫脹等炎性反應(yīng),表明疫苗注射未對(duì)雛鴿產(chǎn)生不良影響,無(wú)其他副作用。隨后對(duì)疫苗免疫后的抗體產(chǎn)生規(guī)律和水平進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)免疫后第2周開(kāi)始產(chǎn)生抗體,抗體滴度為4.8 log2,第4周抗體滴度達(dá)到7.4 log2,第7、8周抗體水平達(dá)到高峰,平均值為8.8 log2,且其在免疫后第52周還可以產(chǎn)生較高水平的抗體,平均滴度為5.6 log2。表明制備的油佐劑疫苗能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生較高滴度的抗體,并且抗體滴度在5.6l og2以上至少可以維持 12個(gè)月。參考葉賀佳[25]等制定的標(biāo)準(zhǔn),本研究制備的rGX-mF株滅活疫苗免疫鴿后可以產(chǎn)生良好的免疫效果。

與雞新城疫滅活疫苗(La Sota株) 進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)rGX-mF株滅活疫苗在鴿體內(nèi)能夠產(chǎn)生更高水平的抗體。張俊平[26]等研究表明在免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中鴿新城疫疫苗的保護(hù)效果明顯優(yōu)于雞新城疫疫苗,表明本研究制備的rGX-mF株滅活疫苗更適宜于鴿群中流行的基因Ⅵ型鴿新城疫病毒的防控。另外,本研究還對(duì)比了rGX-mF株滅活疫苗在不同靶動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體水平的差異,結(jié)果表明雞體內(nèi)的抗體水平顯著高于鴿體內(nèi)的抗體水平,這可能與雞和鴿的免疫系統(tǒng)差異有關(guān)。

綜上所述,rGX-mF株具有毒力弱,繁殖能力高,遺傳穩(wěn)定性和免疫原性好的特點(diǎn),可以作為鴿新城疫疫苗候選株,為臨床中鴿新城疫的防控提供保障。