任永寧,劉新鑫,閆巍文,姜姍姍,汪思捷,沙雨欣,王夢(mèng)君,徐小洪,丁 壯,高 超,尹仁福

(吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)系人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,人畜共患傳染病重癥診治全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130062)

H9N2亞型AIV自1992年首次在我國(guó)檢測(cè)到[1],如今已廣泛分布在全國(guó)?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示我國(guó)H9N2已經(jīng)取代H5和H7亞型,成為AIV中優(yōu)勢(shì)亞型[2-3]。研究證明H9N2亞型AIV可為新型重組的H5N1、H5N6、H5N2和H7N9等高致病性流感病毒提供基因片段,為其變異提供材料[4-5]。且近些年來,人感染H9N2禽流感的病例也愈發(fā)增多。因此,定期開展AIV的流行病學(xué)調(diào)查不可或缺。本研究在長(zhǎng)春市周邊活禽市場(chǎng)展開調(diào)查,對(duì)鑒定為陽(yáng)性的樣本進(jìn)行全基因組測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析,為當(dāng)前國(guó)內(nèi)H9N2亞型AIV的流行病學(xué)研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源與雞胚 本實(shí)驗(yàn)所涉及的樣本收集來自2021年9月至2023年4月在長(zhǎng)春市周邊城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng),共計(jì)170份。SPF雞胚購(gòu)于濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司,由本實(shí)驗(yàn)自行孵化至10日齡胚。

1.1.2 主要試劑 Trizol LS Reagent購(gòu)自Sigma公司;6×loading buffer、DL2000 Marker購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司;NovoScript?One-Step RT-PCR Kit一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 待檢測(cè)樣品取上清液接種至10日齡SPF雞胚,置于37 ℃培養(yǎng)箱中觀察,72 h后收集雞胚尿囊液。經(jīng)HA-HI檢測(cè)后對(duì)無血凝性的樣品盲傳2代,如仍未有血凝效價(jià)則認(rèn)為AIV陰性。通過血凝抑制實(shí)驗(yàn)確定分離的病毒亞型以及混合感染。血凝陽(yáng)性樣本總RNA提取按照制造商的建議用Trizol Reagent 分離。使用NovoScript?One-Step RT-PCR Kit 一步法RT - PCR試劑盒鑒定AIV。結(jié)果為陽(yáng)性按照有限稀釋法純化病毒并進(jìn)行全基因組測(cè)序。全基因組擴(kuò)增引物信息參考霍夫曼引物[6]。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,將陽(yáng)性條帶送至生工生物工程(上海) 股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 序列比對(duì)與遺傳進(jìn)化分析 使用Lasergene11軟件進(jìn)行序列拼接及同源性分析,利用NetNGlyc 1.0預(yù)測(cè)3株分離株的HA和NA基因糖基化位點(diǎn)。在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)及全球流感基因共享數(shù)據(jù)庫(kù)(Global Initiative on Sharing All Influenza Data, GISAID)中下載參考毒株,使用MEGA 7軟件設(shè)置鄰接法(Neighbor-joining, NJ, Bootstrap=1000)進(jìn)行多序列比對(duì),對(duì)各基因片段繪制遺傳發(fā)生樹。

2 結(jié) 果

2.1 樣品的檢測(cè)與病毒的分離鑒定 本實(shí)驗(yàn)所涉及的樣本收集于長(zhǎng)春市周邊城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)共計(jì)170份,鑒定為AIV的26份,其中選取3株具有代表性H9N2毒株使用有限稀釋法連傳三代純化后進(jìn)行全基因組測(cè)序。三株AIV序列已上傳至GENEBANK,序列號(hào)為OR230154至OR230177。將其分別命名為A/chicken/Jilin/HL45/2022、A/pigeon/Jilin/HL55/2022、A/pigeon/Jilin/HL56/2022簡(jiǎn)稱(CK/JL/45/22、PGN/JL/55/22、PGN/JL/56/22))并進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 HA基因序列及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析 3株H9N2亞型分離株均來自于長(zhǎng)春市活禽市場(chǎng),HA基因ORF全長(zhǎng)均為1683 bp,編碼560個(gè)氨基酸。其中HA的蛋白裂解位點(diǎn)為PSKSSR↓GLF,屬于不連續(xù)堿性氨基酸序列,未發(fā)現(xiàn)連續(xù)多堿性氨基酸的插入,符合LPAIV特征。分離株之間HA基因核苷酸同源性為99.7%～99.9%。與經(jīng)典毒株對(duì)比后,發(fā)現(xiàn)3株分離株與A/Chicken/HongKong/G9/1997的同源性最高為 87.3%～87.6%。對(duì)3株分離株HA基因受體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析如表1所示,發(fā)現(xiàn)Q226L位點(diǎn)、Q227M(H3編號(hào))發(fā)生突變,Q226L位點(diǎn)突變更傾向于結(jié)合α, 2-6唾液酸受體,導(dǎo)致親嗜性由禽類轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯?dòng)物。此外,分析發(fā)現(xiàn)3株分離株381位氨基酸位點(diǎn)存在E381K突變,先前研究表明此為一個(gè)有利于AIV氣溶膠傳播的關(guān)鍵位點(diǎn)[7]。對(duì)3株分離株HA蛋白的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),3株分離株的HA蛋白具有8個(gè)潛在糖基化位點(diǎn),在29-31、82-84、141-143、298-300、305-307、313-315、492-494、551-553位出現(xiàn)潛在糖基化位點(diǎn)。分離株在313位增加了一個(gè)糖基化位點(diǎn),這會(huì)導(dǎo)致病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合和受體結(jié)合能力增強(qiáng)[8]。HA基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析如圖1所示,3株分離株HA基因均屬于BJ-94 like分支。與廈門人流感A/Fujiansiming/19/2021基因高度同源,在進(jìn)化樹屬同一分支。

圖1 HA、NA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 1 The phylogenetic tree based on genes of HA and NA

表1 H9N2亞型AIV分離株HA關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析及潛在糖基化位點(diǎn)分析Tab 1 Analysis of key amino acid sites and potential glycosylation sites in HA of H9N2 subtype AIV isolates

2.3 NA基因序列及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析 3株H9N2分離株NA基因ORF全長(zhǎng)均為1463 bp,編碼466個(gè)氨基酸。3株分離株核苷酸同源性為99.6%～99.9%。與經(jīng)典毒株氨基酸比對(duì)分析如表2所示,發(fā)現(xiàn)3株分離株在NA莖部62-64位都缺少三個(gè)氨基酸,這表明毒株對(duì)小鼠的毒力可能增強(qiáng)[9]。在紅細(xì)胞吸附位點(diǎn)上存在K68 N、D369S突變,而在431-433位及活性中心位均未發(fā)現(xiàn)突變現(xiàn)象。在氨基酸N70S位點(diǎn)發(fā)生突變,該位點(diǎn)突變可以產(chǎn)生對(duì)扎納米韋的耐藥性[10],而在119、274、292位中沒有出現(xiàn)對(duì)達(dá)菲有耐藥性的突變位點(diǎn)。3株H9N2分離株NA蛋白糖基化位點(diǎn)如表2所示,其均存在44、66、83、143、197、231、365、399位的糖基化位點(diǎn)。3株H9N2分離株的NA基因均屬于Y280-like分支,其基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析如圖1所示。

2.4 內(nèi)部基因序列及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析 對(duì)3株H9N2 亞型AIV毒株內(nèi)部核苷酸同源性基因進(jìn)行分析,各基因節(jié)段同源性為: PB2:99.7%～99.8%、PB1:99.5%～99.8%、PA:99.5%～99.7%、NP:98.9%～99.3%、M:95.0%～96.2%、NS:97.6%～98.6%。3株H9N2分離株的PB2、M基因均屬于G1譜系;PB1、PA、NP、NS均屬于F-98譜系,其內(nèi)部6個(gè)基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析如圖2所示。對(duì)3株H9N2分離株的PB2蛋白關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在E627K、D701 N均未發(fā)生突變。而在V147I、A184T、I292V、R389K、A588V、T598I、L648V和T676M位點(diǎn)均存在突變。其中V147I突變會(huì)增加小鼠致病性、A588V突變提高了病毒在宿主體內(nèi)的適應(yīng)性并使其獲得了在哺乳動(dòng)物間的傳播能力[11]。此外,對(duì)PB1蛋白關(guān)鍵氨基酸的分析發(fā)現(xiàn)PB1上發(fā)生了能增強(qiáng)AIV在雪貂中傳播能力的I368V突變[12]。此前有研究表明PA蛋白672L是影響H9N2亞型AIV氣溶膠傳播特性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)[7],本研究3株毒株P(guān)B1蛋白第672位點(diǎn)均不為L(zhǎng)。M基因編碼M1和M2蛋白,在M1上第231位沒有發(fā)生與大鼠適應(yīng)性相關(guān)的D231 N突變,而在M2基因片段中發(fā)現(xiàn)S31 N點(diǎn)突變,該位點(diǎn)突變使得病毒對(duì)金剛烷胺類藥物產(chǎn)生耐藥性[13]。NS基因編碼NS1蛋白和NS2蛋白,其中NS1蛋白的第42位發(fā)生P42S的突變,這導(dǎo)致AIV對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性增強(qiáng)[14]。NS1 V149A突變后,則能夠使病毒在雞體內(nèi)復(fù)制,從而影響病毒對(duì)雞的致病性[15]。

圖2 PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 2 The phylogenetic tree based on genes of PB2, PB1, PA, NP, M and NS

3 討 論

H9N2亞型AIV作為全球廣泛流行的AIV之一,其對(duì)世界養(yǎng)殖業(yè)的危害日益增加,這也是相關(guān)從業(yè)者亟待解決的問題之一。本研究于2021年9月至2023年4月長(zhǎng)春市周邊城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)采樣檢測(cè)并分離鑒定3株H9N2亞型AIV并進(jìn)行全基因組測(cè)序。補(bǔ)充了國(guó)內(nèi)該亞型AIV毒株的生物學(xué)信息,同時(shí)對(duì)其分子生物學(xué)特性展開分析。經(jīng)對(duì)其核苷酸序列分析,發(fā)現(xiàn)在3株分離株出現(xiàn)HA-Q226L,這表明分離株更傾向于結(jié)合α,2-6唾液酸受體結(jié)合,導(dǎo)致親嗜性由禽類轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯?dòng)物。3株分離株HA基因均屬于BJ-94 like分支,與廈門人流感A/Fujiansiming/19/2021基因高度同源,在進(jìn)化樹屬同一亞分支[16]。這表明我國(guó)當(dāng)前AIV傳播迅速,傳播范圍廣泛。家禽業(yè)的從業(yè)者要加強(qiáng)防護(hù)措施。分子遺傳進(jìn)化分析顯示3株毒株的HA基因歸屬于BJ-94譜系中h9.4.2.5亞分支;NA基因歸屬Y280譜系;PB2、M基因均屬于G1譜系;剩余內(nèi)部基因均屬于F-98譜系,這表明本文中分離3株H9N2亞型AIV均屬于G57基因型[17]。有研究表明,自2013年以來,G57基因型AIV病毒為我國(guó)主要流行毒株[18]。3株分離株在NA莖部62-64位都缺少三個(gè)氨基酸,已經(jīng)被推測(cè)為這種缺失模式的短莖NA可能是水禽傳播到陸生家禽,并對(duì)其逐漸產(chǎn)生適應(yīng)性的一個(gè)重要分子標(biāo)記[19]。PB2 588位點(diǎn)作為PB2-F6 組合突變的關(guān)鍵共適應(yīng)位點(diǎn),在鳥類和哺乳動(dòng)物中獲得了比PB2 588位點(diǎn)單突變更高的AIV適應(yīng)性,這表明PB2 588位點(diǎn)與其他突變位點(diǎn)的協(xié)同作用可以進(jìn)一步增強(qiáng)這種共適應(yīng)性,共同適應(yīng)的出現(xiàn)不僅增加了對(duì)鳥類和哺乳動(dòng)物的威脅,而且還可能導(dǎo)致鳥類之間的大流行,并跨越哺乳動(dòng)物的種間障礙[20]。在針對(duì)耐藥性方面發(fā)現(xiàn)在NA在氨基酸N70S位點(diǎn)發(fā)生突變,該位點(diǎn)突變可以產(chǎn)生對(duì)扎納米韋的耐藥性[10],而在119、274、292位中沒有出現(xiàn)對(duì)達(dá)菲有耐藥性的突變位點(diǎn)。在M2基因片段中發(fā)現(xiàn)S31 N點(diǎn)突變,該位點(diǎn)突變使得病毒對(duì)金剛烷胺類藥物的產(chǎn)生耐藥性,而在L26F、V27A、A30V/T/S和G34E位點(diǎn)均未出現(xiàn)耐藥性突變位點(diǎn)。

H9N2亞型AIV如今已被認(rèn)為是AIV基因的主要供體,通過重組共循環(huán)的流感病毒可導(dǎo)致人畜共患重組[21]。自2013年以來, AIV已在中國(guó)造成5次連續(xù)人間流行。蒲娟等[22]發(fā)現(xiàn)H9N2在第五次大流行前發(fā)生了包含哺乳動(dòng)物適應(yīng)性突變的PB2和PA基因的新的H9N2病毒亞分支被重組為共循環(huán)的H7N9病毒,形成了一種新的顯性H7N9病毒基因型。過去的研究表明活禽市場(chǎng)是人感染禽流感的傳播源甚至是潛在的孵化器。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在城鄉(xiāng)結(jié)合地區(qū)中仍能檢測(cè)出H9N2亞型AIV,且和不經(jīng)適應(yīng)直接感染人的禽流感毒株高度同源。因此,應(yīng)在已有成績(jī)之上繼續(xù)完善一體化的防控機(jī)制,加強(qiáng)城鄉(xiāng)結(jié)合地區(qū)的監(jiān)管力度,實(shí)現(xiàn)人病獸防,關(guān)口前移、在人與動(dòng)物間切斷傳染源,以降低人類感染AIV的風(fēng)險(xiǎn)。