曹鵬飛　吳華芬　陳銀華

摘要：桃樹細(xì)菌性穿孔病發(fā)生普遍，嚴(yán)重制約了桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為研究植物內(nèi)生菌對桃樹細(xì)菌性穿孔病病原菌的抑制作用，從健康桃樹、博落回、金銀花、板栗等健康植物材料中分離篩選出優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株，并測定其胞外代謝產(chǎn)物對病原菌細(xì)胞膜與細(xì)胞壁通透性、纖維素酶活性、胞外多糖（EPS）含量、呼吸代謝、核酸含量的影響。結(jié)果表明，分離得到的45株內(nèi)生菌中，從金銀花植株中分離的曲霉屬JYY-3菌株抑菌效果最好，其最小抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC）分別為50、200 mg/mL。經(jīng)該菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌核酸泄漏量、AKP活性和電導(dǎo)率顯著提高，且濃度越高效果越明顯。此外，JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物能顯著降低病原菌纖維素酶活性、EPS含量、DNA和RNA含量，抑制其琥珀酸脫氫酶（SDH）、蘋果酸脫氫酶（MDH）活性，且濃度越高作用越強(qiáng)，經(jīng)2.0MIC 菌株JYY-3代謝產(chǎn)物處理12 h后，桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌的SDH、MDH活性較對照組分別降低107.644、13.729 U/mg?？梢?，金銀花內(nèi)生菌株JYY-3對桃樹細(xì)菌性穿孔病病原菌有顯著的抑制作用，可通過抑制纖維素酶活性及EPS合成以減弱病原菌入侵植物能力，增大細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性使內(nèi)容物外泄，抑制核酸合成以及呼吸酶活性等途徑抑制病原菌的繁殖。本研究結(jié)果為植物內(nèi)生菌防治桃樹細(xì)菌性穿孔病的進(jìn)一步研究奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桃樹細(xì)菌性穿孔??；植物內(nèi)生菌；抑菌活性；抑菌機(jī)制；胞外代謝產(chǎn)物

中圖分類號：S436.621.1+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2023）17-0131-07

桃樹細(xì)菌性穿孔病是由黃單胞桿菌屬甘藍(lán)黑腐黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv. pruni）侵染造成的劣性病害［1］。該病害在全國各地普遍發(fā)生，發(fā)病時間多在4—5月中旬，8月為發(fā)病盛期。若該病防治不及時，常造成大量落葉，營養(yǎng)累積減少，花芽形成異常，最終導(dǎo)致樹勢衰落，嚴(yán)重制約桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前針對桃樹細(xì)菌性穿孔病的防治主要以傳統(tǒng)防治和化學(xué)防治為主，常用的化學(xué)農(nóng)藥主要有葉枯唑可濕性粉劑、二氯異氰酸鈉、波爾多液及噻菌銅等［2］。這些化學(xué)農(nóng)藥主要在植株發(fā)病初期使用才能達(dá)到較好的防效，但隨著病害的大面積暴發(fā)，防效會明顯降低。同時，隨著化學(xué)農(nóng)藥的反復(fù)使用常造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等一系列問題。因此，尋找低毒、高效的防治手段迫在眉睫。

植物內(nèi)生菌（endophyte）是存活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群，是其微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分［3-4］。據(jù)研究表明，許多內(nèi)生菌能產(chǎn)生抗生素、水解酶類、黃酮和生物堿等次級代謝產(chǎn)物，可抵抗宿主植株中致病菌引起的病害發(fā)生［5］。目前已有學(xué)者對內(nèi)生菌防治果樹細(xì)菌性病害做了一定的研究，如劉冰等從臍橙中分離獲得1株對柑橘潰瘍病防效達(dá)89.4%的內(nèi)生細(xì)菌［6］；崔麗紅等通過拮抗活性試驗從9株絞股藍(lán)根際內(nèi)生菌中篩選出3株對獼猴桃潰瘍病致病菌有明顯抑制效果的內(nèi)生菌，經(jīng)盆栽試驗表明這3株菌均可降低致病菌入侵植物體內(nèi)的概率［7］。近年來，雖已分離出一些拮抗作用較強(qiáng)的內(nèi)生菌，但主要用于果樹潰瘍病的防治，對于桃樹細(xì)菌性穿孔病防治及其機(jī)制研究少有報道。因此，本研究從健康植株中分離篩選出對桃樹細(xì)菌性穿孔病有拮抗作用的菌株，并對其抑菌機(jī)制進(jìn)行初步研究，旨在為桃樹細(xì)菌性穿孔病提供新的防治途徑，為內(nèi)生菌防治桃樹細(xì)菌性穿孔病提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料與供試菌株

1.1.1 植物材料

健康的桃樹、板栗植株，采自浙江省麗水市蓮都區(qū)雙黃鄉(xiāng)雨傘崗；金銀花和博落回采自蓮都區(qū)白云山。以上樣品均于2022年3月5日采回進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。

1.1.2 供試菌株

桃樹穿孔病病原菌甘藍(lán)黑腐黃單胞菌，從患病的桃樹莖部分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

試驗主要培養(yǎng)基有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基，分別用于植物內(nèi)生細(xì)菌、真菌和放線菌的分離與培養(yǎng)。

1.2.2 主要試劑

試驗主要試劑有堿性磷酸酶（AKP）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，DAPI熒光染料購自Gen-View科技有限公司。

1.3 主要儀器

試驗主要儀器有熒光分光光度計（天津拓普儀器有限公司，F(xiàn)97）、顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)，DMi8）、電導(dǎo)率儀（上海雷磁新涇儀器有限公司）、紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司，SP-756P）等。

1.4 植物內(nèi)生菌的分離與優(yōu)勢拮抗菌株的篩選

1.4.1 植物內(nèi)生菌株的分離及其胞外代謝產(chǎn)物的制備

采用組織塊分離法［8］，將健康桃樹、板栗、博落回、金銀花等植物的根、莖、葉消毒后，接種于牛肉膏蛋白胨、PDA、高氏一號培養(yǎng)基平板上，于適宜溫度培養(yǎng)1～7 d，每天觀察各平板上的菌落形態(tài)、顏色等特征，挑取菌落形態(tài)明顯不同的單菌落經(jīng)純化后于4 ℃保存。將各菌株接入相應(yīng)的培養(yǎng)液，于適宜溫度振蕩培養(yǎng)1～5 d，4 000 r/min離心10 min，取上清于55 ℃蒸發(fā)濃縮至20 mL后冷凍干燥，配成0.2 g/mL母液，用0.22 μm的無菌過濾器過濾除菌后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 優(yōu)勢拮抗菌株的篩選及MIC、MBC測定

取活化24 h的桃樹穿孔病病原菌甘藍(lán)黑腐黃單胞菌于牛肉膏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，稀釋成2×107 CFU/mL。用濾紙片法［9］測定各內(nèi)生菌菌株對病原菌的抑菌圈大小，初步篩選出優(yōu)勢菌株。用二倍稀釋法［10］將初篩菌株胞外代謝產(chǎn)物稀釋成1.562 5～400.000 0 mg/mL，每管加入2.5 mL對數(shù)期病原菌菌懸液（濃度為107 CFU/mL），以未接菌的培養(yǎng)液為對照，28 ℃ 振蕩培養(yǎng)24 h后加入配制好的 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染液? 5 μL，2 h后觀察培養(yǎng)液顏色的變化，以未出現(xiàn)顏色的最低濃度為該菌株的最小抑菌濃度（MIC）［11］。以MIC最小的菌株為優(yōu)勢拮抗菌株。取優(yōu)勢菌株無色菌懸液進(jìn)行平板計數(shù)，以剛好無菌落生長的濃度為最低殺菌濃度（MBC）。

1.5 優(yōu)勢拮抗菌株 JYY-3的鑒定

參考《真菌鑒定手冊》［12］，通過觀察優(yōu)勢拮抗菌株 JYY-3 菌落的形態(tài)、大小、顏色以及菌絲、孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等顯微特征，以初步鑒定其種屬。

1.6 優(yōu)勢拮抗菌株 JYY-3抑菌機(jī)制確定

1.6.1 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對病原菌生長曲線的影響

將培養(yǎng)好的甘藍(lán)黑腐黃單胞菌菌懸液與菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物等體積混合培養(yǎng)，使胞外代謝產(chǎn)物終濃度分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，以不加胞外代謝產(chǎn)物為對照，28 ℃振蕩培養(yǎng)0、1、2、4、6、8、10、14、18、24 h后進(jìn)行平板菌落計數(shù)［13］，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、菌落數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制菌株 JYY-3不同濃度胞外代謝產(chǎn)物作用下病原菌的生長曲線。

1.6.2 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對病原菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的影響

取病原菌菌懸液加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度為分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，振蕩培養(yǎng)0、1/6、1/3、1/2、2/3、5/6、1、2、8 h后取菌懸液，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液測定電導(dǎo)率。取培養(yǎng)好的病原菌菌液于4 000 r/min離心 10 min，取沉淀用1×PBS緩沖液洗滌2次后用PBS緩沖液制成2×107CFU/mL菌懸液，加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，振蕩培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6 h后取菌懸液，離心取上清液于260 nm處測定吸光度。另外按上述方法配制混合培養(yǎng)液，培養(yǎng) 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后離心取上清，按試劑盒說明書測定堿性磷酸酶的活性。

1.6.3 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對病原菌致病能力的影響

取病原菌菌液加入胞外代謝產(chǎn)物，配制混合培養(yǎng)液，培養(yǎng)2、4、12、24 h后取菌懸液，用二硝基水楊酸（DNS）法［14］測定纖維素酶活力。取病原菌菌液加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度分別為 1/128MIC、1/64MIC、1/32MIC，培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后取菌懸液，3 000 r/min離心10 min，取沉淀，蒸餾水洗滌3次（10 000 r/min，10 min），合并上清液，取1 mL加入4 mL無水乙醇沉淀多糖，3 000 r/min離心10 min，1 mL 蒸餾水復(fù)溶多糖，采用濃硫酸苯酚法［15］測定病原菌的胞外多糖（EPS）含量。

1.6.4 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對病原菌呼吸代謝的影響

取病原菌菌懸液加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，振蕩培養(yǎng)2、6、12、24 h后取菌懸液，于5 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，參照黃燕飛的方法［16］制備粗酶液，按試劑盒說明書測定琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）的活性，其活性以1 mg蛋白所含的活力單位數(shù)表示（U/mg）。

1.6.5 菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物對病原菌核酸合成的影響 取病原菌菌懸液加入胞外代謝產(chǎn)物，使其終濃度分別為0.5、1.0、2.0倍MIC，振蕩培養(yǎng)4、12、24 h后取菌懸液稀釋至600 nm下吸光度為0.5，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色法［17］處理病原菌，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度；用熒光分光光度計分別于364、400 nm 下測定病原菌 DNA和RNA的熒光強(qiáng)度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物內(nèi)生菌的分離與優(yōu)勢拮抗菌株的篩選

本試驗從健康桃樹、博落回、板栗和金銀花中共分離出45株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌各19株，內(nèi)生放線菌7株。在4種植株中，從桃樹上分離得到的內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌最多，分別為6、8株，內(nèi)生放線菌于板栗中未有分離獲得，在其余植株中分離得也較少，總計僅7株。拮抗試驗結(jié)果表明，在這45株內(nèi)生菌中共有38株對桃樹穿孔病病原菌甘藍(lán)黑腐黃單胞菌有抑制效果，其中15株內(nèi)生細(xì)菌，18株內(nèi)生真菌，5株內(nèi)生放線菌。抑制效果較好的菌株分別為分離自桃樹的內(nèi)生菌株TY-1和TG-6及金銀花內(nèi)生菌株JYY-3，其抑菌圈直徑分別達(dá)9.98、10.18、20.50 mm。經(jīng)TTC染色法分析可知，分別經(jīng)1.562 5～400.000 0 mg/mL 內(nèi)生菌株TY-1、TG-6、JYY-3 代謝產(chǎn)物處理后，桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌培養(yǎng)液顏色隨胞外代謝產(chǎn)物濃度增大而變淺直至無色，其中JYY-3菌株處理組在 50 mg/mL 時開始出現(xiàn)無色，TY-1、TG-6菌株2個處理組均在400 mg/mL時才呈無色。這表明3個菌株的胞外代謝產(chǎn)物均能抑制桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌生長，其中JYY-3菌株MIC為50 mg/mL，TY-1與TG-6菌株MIC均為400 mg/mL。MIC越小，說明其拮抗能力越強(qiáng)，故金銀花內(nèi)生菌株JYY-3為優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌。由平板菌落計數(shù)結(jié)果可知，當(dāng)菌株JYY-3代謝產(chǎn)物終濃度≥200 mg/mL時，平板上無菌落生長，因此其MBC為200 mg/mL。

2.2 優(yōu)勢拮抗菌株JYY-3的鑒定

金銀花內(nèi)生菌株JYY-3的菌絲白色，疏松，菌落形態(tài)為圓形，向四周擴(kuò)散，產(chǎn)綠色孢子；孢子梗光滑，呈桿狀，頂端著生分生孢子團(tuán)；孢子呈球形或卵狀（圖1），根據(jù)《真菌鑒定手冊》可初步確定JYY-3菌株為曲霉屬內(nèi)生真菌。

2.3 優(yōu)勢拮抗菌株JYY-3對甘藍(lán)黑腐黃單胞菌的抑菌機(jī)制

2.3.1 對桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌生長曲線的影響

由圖2可知，對照組幾乎觀察不到遲緩期，在4 h處即開始進(jìn)入對數(shù)期，病菌大量繁殖，菌體數(shù)量迅速增加。經(jīng)各濃度JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌菌體濃度較對照組極顯著下降（P<0.01），0.5MIC、1.0MIC 胞外代謝產(chǎn)物處理組的病原菌菌體均在4 h處進(jìn)入對數(shù)期，但菌體數(shù)量增加較對照組?。?.0MIC處理組的病原菌增長最為緩慢，10 h后開始明顯下降。各濃度處理組在14 h時的病原菌菌濃度與對照差異較大，分別減少10.23%、21.42%、36.36%，表明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物可通過延長遲緩期或減弱穿孔病菌對數(shù)期，有效抑制菌體增長，達(dá)到抑菌效果，且濃度越大，抑制作用越明顯。

2.3.2 對桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌細(xì)胞膜的影響

細(xì)胞通透性的改變會引起胞內(nèi)成分如鉀離子、鈉離子、核酸等物質(zhì)的釋放［18］，因此，可通過測定 JYY-3 菌株胞外代謝產(chǎn)物作用后穿孔病病原菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率和核酸含量的變化來研究其對菌體細(xì)胞膜的影響。由圖3可知，隨處理時間的延長，對照組電導(dǎo)率于80 min內(nèi)穩(wěn)步上升，之后趨于穩(wěn)定，這可能與病原菌菌體濃度的升高有一定的關(guān)系［19］。而在0～40 min內(nèi)，各濃度JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理組的電導(dǎo)率較對照組極顯著上升（P<0.01），在40 min時達(dá)到最大，分別比對照組高0.94、1.06、3.47 μS/cm，說明高濃度的胞外代謝產(chǎn)物對細(xì)胞膜的影響較大，能使原生質(zhì)及電解質(zhì)外滲，增大細(xì)胞膜的通透性。之后隨作用時間延長，2.0MIC組電導(dǎo)率略有下降，但高于對照組。1.0MIC、0.5MIC組電導(dǎo)率顯著下降，明顯低于對照組，這可能是由于JYY-3菌株代謝產(chǎn)物濃度較小，致使后期隨著藥效下降使其對病原菌細(xì)胞膜的作用減弱；反而可能由于對金屬離子有螯合作用，使其電導(dǎo)率降低［19］。由圖4可知，隨著處理時間延長，對照組胞外大分子物質(zhì)核酸含量維持在較低水平，而經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，菌體在260 nm處的吸光度顯著高于對照組（P<0.05），在6 h時0.5MIC、1.0MIC、2.0MIC 組分別較對照高0.85、1.06、1.16，可見JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，從菌體內(nèi)流出的 DNA、RNA 等大分子物質(zhì)成分越多，菌體細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重。

2.3.3 對桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌細(xì)胞壁的影響

堿性磷酸酶（AKP）是存在于細(xì)菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的一種酶，在菌體正常生長時胞外不能檢測到該酶活性，但當(dāng)細(xì)胞壁破壞后，將大量泄漏到胞外［20］。由圖5可知，在0～4.0 h的處理時間內(nèi)，對照組AKP活性始終較低，表明病原菌生長較好，細(xì)胞壁完整。但經(jīng)不同濃度JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，在最初的3.0 h內(nèi)AKP活性迅速上升，之后趨于穩(wěn)定，且胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，AKP活性越高。這說明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物能破壞桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌細(xì)胞壁的完整性，并且在較短的時間內(nèi)就能造成菌體細(xì)胞壁通透性的增加。

2.3.4 對桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌纖維素酶的影響

纖維素酶是病原物產(chǎn)生的、能引起植物致病的重要因子，可通過水解宿主植物細(xì)胞壁組分使病原菌穿入并侵染宿主組織［21］。因此可通過測定纖維素酶的活性來研究JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物對穿孔病菌侵入能力的影響。由圖6可知，試驗組穿孔病菌纖維素酶活性極顯著低于對照組（P<0.01），且胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，其活性越低。隨胞外代謝產(chǎn)物處理時間的延長，纖維素酶活性不斷下降，在12 h時與對照組差異最大，經(jīng)0.5MIC、1.0MIC、2.0MIC胞外代謝產(chǎn)物作用后的菌體纖維素酶活性分別下降了50.43%、58.81%和74.87%。這表明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物能通過抑制纖維素酶的活性來減弱桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌對宿主細(xì)胞細(xì)胞壁的破壞作用，從而削弱病原菌入侵能力，且胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，效果越好。

2.3.5 對桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌胞外多糖（EPS）的影響

EPS是病原菌的致病生化因子，可導(dǎo)致宿主局部組織壞死，有助于病原菌抵御宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)或氧化劑的攻擊，也能干擾宿主對病原菌的免疫識別［22］。由圖7可知，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后穿孔病病原菌菌體EPS含量極顯著的低于對照組。隨著濃度的升高，EPS含量逐漸降低，其中1/20MIC組含量最低。這說明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物能抑制桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌胞外多糖的合成，使其毒性和擴(kuò)散能力降低，起到抑制病原菌致病性的作用，且胞外代謝產(chǎn)物濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。

2.3.6 對桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌呼吸代謝的影響

琥珀酸脫氫酶（SDH） 和蘋果酸脫氫酶（MDH）存在于所有氧呼吸細(xì)胞中，是三羧酸循環(huán)中的2種關(guān)鍵酶類，在電子傳遞與能量轉(zhuǎn)換中起著關(guān)鍵作用［23-24］。由圖8、圖9可知，0～2 h內(nèi)，不同濃度JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理組的SDH、MDH活性極顯著低于對照組。在12 h，2種酶活性下降最大，其中2.0MIC處理組SDH、MDH的活性最低，較對照組分別降低107.644、13.729 U/mg。這表明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3可通過抑制SDH、MDH活性以抑制桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌的呼吸作用，從而對能量代謝系統(tǒng)產(chǎn)生影響，且濃度越高，影響越大。

2.3.7 對桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌胞內(nèi)核酸含量的影響 蛋白質(zhì)、DNA和RNA是衡量菌體生長狀況的重要生物大分子，三者合成若受到影響會造成代謝紊亂［24-25］。由圖10可知，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌熒光強(qiáng)度明顯降低，且濃度越高，熒光亮度越弱。由圖11、圖12可知，胞外代謝產(chǎn)物處理組DNA、RNA含量均極顯著減少（P<0.01），經(jīng)2.0MIC胞外代謝產(chǎn)物作用24 h后，穿孔病菌DNA、RNA含量分別減少了58.46%、77.8%，表明JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物對桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌DNA、RNA的合成有抑制作用，且胞外代謝產(chǎn)物濃度越大，對病原菌正常生長代謝影響越嚴(yán)重。

3 討論與結(jié)論

本試驗從健康金銀花、桃樹、博落回、板栗植株中共分離得到45株內(nèi)生菌，包括19株內(nèi)生細(xì)菌，19株內(nèi)生真菌，7株內(nèi)生放線菌，其中抑菌活性最強(qiáng)的為從金銀花植株中分離的JYY-3菌株，經(jīng)鑒定為曲霉屬。李瑾也證實金銀花內(nèi)生真菌JY-2也具有較好抑菌活性，但經(jīng)鑒定其為鐮刀菌屬［26］。MIC測定結(jié)果表明，JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物對桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌甘藍(lán)黑腐黃單胞菌的最低抑菌濃度為50 mg/mL，當(dāng)其等于或高于此濃度時能延長穿孔病菌遲緩期或減弱其對數(shù)期，使菌濃度保持在較低水平，以此達(dá)到抑制病原菌生長的目的。

病原菌在生長和繁殖過程中釋放的代謝產(chǎn)物對于菌體吸收營養(yǎng)物質(zhì)、吸附和入侵宿主機(jī)體以及抵抗宿主免疫因子的反應(yīng)等具有極為重要的作用［27-29］。如林海云等在青枯雷爾氏菌致病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，病菌分泌的胞外多糖及纖維素酶可加快其在植物體內(nèi)的擴(kuò)散，進(jìn)而造成植株萎蔫或死亡［30］。因此，可通過抑制纖維素酶、胞外多糖等物質(zhì)合成來抑制病原菌對植物的入侵作用，如王芳研究發(fā)現(xiàn)，從苦參中篩選出的B36菌株能有效抑制葉霉病菌纖維素酶活性，從而降低其入侵番茄植株能力［31］。黃青春發(fā)現(xiàn)，拌種靈可通過抑制柑橘潰瘍病病原菌胞外多糖分泌從而抑制該病害在植株中生長［32］。本試驗研究結(jié)果也顯示，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌胞外多糖合成和纖維素酶活性在24 h較對照組分別降低58.81%、74.87%，這表明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物可通過弱化胞外多糖的分泌及纖維素酶的活性來抑制桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌在植株中的生長及致病能力。

已有研究證實，許多活性成分的抑菌機(jī)制主要是通過破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性和抑制蛋白、核酸的合成等途徑來實現(xiàn)［33］。細(xì)胞膜和細(xì)胞壁是許多藥物發(fā)揮抑菌作用的靶點(diǎn)，如謝晶等研究植酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，藥物作用會導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，使通透性增大，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物的外漏，使培養(yǎng)液電導(dǎo)率和AKP活性上升［19］。本試驗也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，桃細(xì)菌穿孔病病原菌培養(yǎng)液中電導(dǎo)率和核酸含量、AKP活性均較對照組顯著上升，這說明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3可通過破壞病菌的細(xì)胞膜及細(xì)胞壁完整性以抑制桃樹細(xì)菌穿孔病病原菌的生長。

蛋白質(zhì)是生物生命活動的主要承擔(dān)者，而核酸是遺傳信息的攜帶者，核酸含量的減少，會直接導(dǎo)致蛋白合成量的降低，從會嚴(yán)重影響菌體細(xì)胞的各項生理機(jī)能［34］。本試驗結(jié)果表明，經(jīng)JYY-3菌株胞外代謝產(chǎn)物作用后，桃細(xì)菌穿孔病病原菌DNA和RNA含量極顯著低于對照組，這說明金銀花內(nèi)生菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物可明顯抑制病原菌核酸的合成，從而影響其各項生理機(jī)能。另一方面，呼吸代謝是生物體進(jìn)行各項生命活動的重要基礎(chǔ)，若病原菌的呼吸鏈被阻斷，其生長所需的能量就無法合成［23-24］。本試驗結(jié)果顯示，經(jīng)菌株JYY-3胞外代謝產(chǎn)物處理后，桃細(xì)菌穿孔病病原菌呼吸代謝所必需的琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶活性被顯著抑制。這表明，金銀花內(nèi)生菌株JYY-3可通過抑制琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶活性以阻斷桃細(xì)菌穿孔病病原菌的呼吸鏈，進(jìn)而抑制其生長。其作用機(jī)制可能是胞外代謝產(chǎn)物中的有效成分與這2個酶側(cè)鏈的氨基酸結(jié)合，改變其構(gòu)象，使酶活性降低，從而抑制病原菌的呼吸代謝，但其具體的作用機(jī)制尚未明確。

綜上所述，從金銀花健康植株中篩選出的曲霉屬JYY-3菌株對桃樹細(xì)菌性穿孔病有較強(qiáng)抑制作用，其抑菌機(jī)制主要是通過抑制病原菌胞內(nèi)DNA、RNA的合成，破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的完整結(jié)構(gòu)，抑制胞外多糖和纖維素酶合成，抑制菌體的呼吸代謝等途徑來實現(xiàn)的。因此曲霉屬JYY-3菌株有望用于桃樹細(xì)菌性穿孔病的防治，但其抑菌活性物質(zhì)的確定及分離還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］何 敬. 秦安縣桃樹細(xì)菌性穿孔病的發(fā)生及防治［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（7）：88-89.

［2］秦 霞，楊紅芳，劉清瑞. 桃樹細(xì)菌性穿孔病的發(fā)生因素與綜合防治［J］. 種業(yè)導(dǎo)刊，2016（7）：13-14.

［3］Wilson D. Endophyte：the evolution of a term，and clarification of its use and definition［J］. Oikos，1995，73（2）：274-276.

［4］Jia M，Chen L，Xin H L，et al. A friendly relationship between endophytic fungi and medicinal plants：a systematic review［J］. Frontiers in Microbiology，2016，7：906.

［5］尹雁玲，蔡 然，張功良，等. 植物內(nèi)生菌增強(qiáng)植物對生物脅迫抗性的研究進(jìn)展［J］. 廣西植物，2023，43（2）：212-220.

［6］劉 冰，李冬植，胡長志，等. 柑橘可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌與寄主品種抗?jié)儾∠嚓P(guān)性的初步研究［J］. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，35（2）：319-323，418.

［7］崔麗紅，宋金秋，陳繼富，等. 根際內(nèi)生菌對獼猴桃潰瘍病生防作用研究初探［J］. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，33（6）：28-32.

［8］黃海東，楊紅澎，王 玉，等. 云霧龍膽內(nèi)生菌的分離鑒定及抗菌活性分析［J］. 微生物學(xué)通報，2010，37（7）：1017-1021.

［9］譚才鄧，朱美娟，杜淑霞，等. 抑菌試驗中抑菌圈法的比較研究［J］. 食品工業(yè)，2016，37（11）：122-125.

［10］曾范利，于 錄，葛 發(fā)，等. MABA法與二倍稀釋法測定齊墩果酸體外抗結(jié)核菌活性［J］. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（7）：22-25.

［11］張 燕. 酸馬奶源乳酸乳球菌代謝物和大黃聯(lián)合作用對小鼠盲腸微生物以及營養(yǎng)代謝的影響［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：16-17.

［12］魏景超. 真菌鑒定手冊［M］. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：1-10.

［13］朱艷蕾. 細(xì)菌生長曲線測定實驗方法的研究［J］. 微生物學(xué)雜志，2016，36（5）：108-112.

［14］韓學(xué)易，陳 惠，吳 琦，等. 產(chǎn)纖維素酶枯草芽孢桿菌C-36的產(chǎn)酶條件研究［J］. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，24（2）：178-181.

［15］李佳佳，鞠玉琳，李 楊. 樺褐孔菌多糖的提取及含量測定方法的研究［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（12）：3133-3135.

［16］黃燕飛. 黃連水提物對痢疾桿菌的抑菌機(jī)制研究［D］. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：16.

［17］王海濤，王 倩，謝明杰. 大豆異黃酮對金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制研究［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（7）：2586-2591.

［18］謝 強(qiáng)，林玉桓，苗淑萍，等. 香芹酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的影響［J］. 食品工業(yè)科技，2014，35（23）：54-58，62.

［19］謝 晶，侯偉峰，湯 毅，等. 植酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌機(jī)理［J］. 食品工業(yè)科技，2011，32（10）：85-88.

［20］李昌勤，趙 琳，薛志平，等. 隱丹參酮抑菌作用機(jī)制研究［J］. 中國藥學(xué)雜志，2012，47（21）：1706-1710.

［21］趙 蕾，張?zhí)煊? 植物病原菌產(chǎn)生的降解酶及其作用［J］. 微生物學(xué)通報，2002，29（1）：89-93.

［22］葛紅娟，龍桂友，戴素明，等. 冰糖橙與枸櫞 C-05 對潰瘍病菌生長特性的影響［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（7）：1383-1391.

［23］徐明生，陳錦屏，上官新晨. 魚精蛋白對黑曲霉細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶的影響［J］. 食品科學(xué)，2005，26（4）：48-51.

［24］曹鵬飛，劉青娥. 楊梅枯萎病拮抗內(nèi)生菌的分離及其抑菌機(jī)制研究［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，50（ 4）：96-105.[HJ1.7mm]

［25］周 磊，云寶儀，汪業(yè)菊，等. 大黃素對金黃色葡萄球菌的抑菌作用機(jī)制［J］. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2011，27（12）：1156-1160.

［26］李 瑾. 金銀花內(nèi)生真菌的分離鑒定和抗菌性研究［D］. 鄭州：河南工業(yè)大學(xué)，2010：60-61.

［27］周 晶. 病原菌致病性胞外產(chǎn)物（ECP）的研究進(jìn)展［J］. 畜牧與飼料科學(xué)，2009，30 （1）：8-9.

［28］陳 成. 擬態(tài)弧菌感染黃顙魚的組織嗜性與動態(tài)病理損傷研究［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：5-6.

［29］婁喜艷，郭洋洋，裴冬麗. 河南商丘月季黑斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（19）：138-143.

［30］林海云，車建美，劉 波，等. 青枯雷爾氏菌致病機(jī)制及其相關(guān)基因的研究進(jìn)展［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，26（5）：899-906.

［31］王 芳. 苦參內(nèi)生拮抗細(xì)菌篩選及其抗菌物質(zhì)純化鑒定［D］. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：125-127.

［32］黃青春. 拌種靈（Amicarthiazol）對柑橘潰瘍病菌作用機(jī)制研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001：59-70.

［33］鄧 超，付海田，谷 鵬. 長裙竹蓀子實體乙醚和乙酸乙酯提取物的化學(xué)組成分析及抑菌活性研究［J］. 食品工業(yè)科技，2014，35（22）：128-134.

［34］吳華彰，費(fèi)鴻君，趙云利，等. 蘿卜硫素對大腸桿菌抑菌機(jī)制的研究［J］. 四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，43（3）：386-390.

收稿日期：2022-10-08

基金項目：浙江省麗水市重大科技計劃（編號：2019ZDYF01）。

作者簡介：曹鵬飛（1978—），男，陜西旬邑人，副研究員，從事園藝植物病理研究工作。E-mail：297473247@qq.com。

通信作者：吳華芬，高級農(nóng)藝師，從事植物資源研究推廣工作。E-mail：631154131@qq.com。