李 亞 ,梁劍鋒* ,賓月景 ,奚廣生 ,陳金輝 ,梁燕妮 ,蔣德莉

(1.梧州學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院(六堡茶現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院),梧州 543002;2.廣西六堡茶產(chǎn)業(yè)科研人才小高地,梧州 543002;3.梧州市食品藥品檢驗所,梧州 543002)

六堡茶是我國六大茶類之一,屬于后發(fā)酵茶,主產(chǎn)區(qū)為廣西、四川、云南、湖南等地。六堡茶采用的渥堆發(fā)酵、陳化工藝使其具有獨特風(fēng)味,但由于發(fā)酵過程是在高溫高濕環(huán)境下進(jìn)行,且有時候茶葉表面會有金黃色物質(zhì),所以近年來社會上廣泛流傳六堡茶會產(chǎn)生黃曲霉毒素的說法,這在一定程度上影響了人們對六堡茶的喜好。高溫高濕環(huán)境中,玉米、花生等食品容易產(chǎn)生黃曲霉毒素[1-2],其中黃曲霉毒素B1最常見且毒性最強(qiáng)[3],被列為Ⅰ類致癌物[4-5]。食品中黃曲霉毒素B1的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)[6-7]、薄層色譜法(TLC)[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9-10]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)[11]、免疫傳感法[12]等,其中ELISA、HPLC 容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果,而UHPLC-MS/MS可同時分析多種真菌毒素,已經(jīng)成為食品中真菌毒素檢測的首選方法。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G 族的測定》中的方法適應(yīng)基質(zhì)并未包含茶葉類。茶葉由于含有大量茶色素及無機(jī)雜質(zhì),常規(guī)的黃曲霉毒素B1檢測方法存在干擾問題,因此開發(fā)一種適用于茶葉,特別是含有大量茶褐素的六堡茶中黃曲霉毒素B1的檢測方法,對澄清社會關(guān)于六堡茶含有黃曲霉毒素的流傳,保障飲茶安全尤為重要。

Qu ECh ERS是由美國化學(xué)家Steven J.Lehotay 和德國化學(xué)家Michelangelo Anastassiadas于2003年提出的農(nóng)殘快速樣品前處理技術(shù)[13],該方法具有快速、高效、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確等特點[14-18],在許多食品農(nóng)殘檢測中被廣泛應(yīng)用[19-24],但在茶葉真菌毒素類檢測中應(yīng)用較少。因此,本工作提出了QuECh-ERS-UHPLC-MS/MS 測定六堡茶中黃曲霉毒素B1含量的方法,可為監(jiān)測六堡茶中真菌毒素殘留提供技術(shù)支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC1290-QQQ6490 型超高效液質(zhì)聯(lián)用儀;X-30型高速冷凍離心機(jī);Multi reax 型渦旋混合器;Million Q 型超純水器;CPA225D 型十萬分之一電子天平。

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.02 mg·L—1。

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;無水硫酸鎂為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Eclipse XDB C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫5 ℃;流動相A 為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為乙腈;流量0.3 mL·min—1;進(jìn)樣量2.0μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)模式;多反應(yīng)監(jiān)測模式;定性離子對質(zhì)荷比(m/z)313.0/285.2,313.0/269.1,313.0/241.1,定量離子對m/z313.0/285.2;離子駐留時間120 ms;碎裂電壓139 V;碰撞能量40 eV。

1.3 試驗方法

將茶葉用中藥粉碎機(jī)粉碎后過80 目(0.178 mm)篩,分取2.50 g過篩的茶葉樣品,置于25 mL塑料離心管中,加入2.0 mL 水潤濕,再加入20 mL含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)甲酸的乙腈溶液,振蕩180 s,于4 ℃以轉(zhuǎn)速4 000 r·min—1離 心10 min。取出,靜置至室溫,分取1.0 mL 上清液,置于預(yù)先裝有250 mg無水硫酸鎂、15 mg HC-C18吸附劑、80 mgN-丙基乙二胺(PSA)的2.0 mL 塑料離心管中,振蕩180 s,于4 ℃以轉(zhuǎn)速15 000 r·min—1離心10 min。取出,靜置至室溫,上清液過0.22μm 有機(jī)濾膜,續(xù)濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

茶葉主要成分為茶多酚、氨基酸、咖啡堿、兒茶素、芳香物質(zhì)、色素、有機(jī)酸、可溶性糖、維生素等,其中色素、可溶性糖等雜質(zhì)對目標(biāo)物有較強(qiáng)的干擾。綜合考慮目標(biāo)物、雜質(zhì)、提取溶劑的性質(zhì)后,分別選擇乙腈、含1%甲酸的乙腈溶液、甲醇、含1%甲酸的甲醇溶液、體積比3∶1的甲醇-乙腈混合溶液、體積比1∶1的甲醇-乙腈混合溶液作為提取溶劑,以目標(biāo)物回收率為考核指標(biāo)對空白加標(biāo)樣品(加標(biāo)量2.88μg·kg—1)進(jìn)行試驗。

結(jié)果表明:以含1%甲酸的乙腈溶液為提取溶劑時,黃曲霉毒素B1回收率為88.1%,大于其他5種提取溶劑所得回收率(72.5%～81.5%)。因此,試驗選擇以含1%甲酸的乙腈溶液為提取溶劑,從而減少雜質(zhì)對黃曲霉毒素B1的干擾。

2.2 凈化劑用量的選擇

樣品經(jīng)過含1%甲酸的乙腈溶液提取后,提取液中還有大量的無機(jī)鹽、色素、可溶性糖等共提取雜質(zhì),因此需要進(jìn)一步凈化。試驗考察了無水硫酸鎂用量分別為50,100,150,200,250,300 mg,HC-C18吸附劑用量分別為5,10,15,20,25,30 mg,PSA 用量分別為50,60,70,80,90,100 mg時對空白加標(biāo)樣品(加標(biāo)量2.88μg·kg—1)中黃曲霉毒素B1回收率的影響。

結(jié)果表明:隨著3種凈化劑用量的增加,黃曲霉毒素B1回收率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢;當(dāng)無水硫酸鎂用量為250 mg,HC-C18吸附劑用量為15 mg,PSA 用量為80 mg時,黃曲霉毒素B1回收率較大,達(dá)到87.3%。無水硫酸鎂具有較強(qiáng)的吸水能力,在吸附提取液中水分的同時也可以吸附水溶性等強(qiáng)極性雜質(zhì);PSA 可與金屬離子鰲合,可以有效去除茶葉中的金屬離子、脂肪酸、有機(jī)酸和一些極性色素及糖;HC-C18吸附劑具有疏水性,對非極性雜質(zhì)有吸附作用,可以去除茶葉中咖啡堿、茶堿、水溶性維生素等。當(dāng)無水硫酸鎂用量過多時,過量的無水硫酸鎂在提取液中大量結(jié)塊并局部放熱,導(dǎo)致黃曲霉毒素B1被結(jié)塊無水硫酸鎂包裹而出現(xiàn)回收率下降的現(xiàn)象;當(dāng)PSA 和HC-C18吸附劑用量過多時,黃曲霉毒素B1被凈化劑吸附的概率增大,導(dǎo)致目標(biāo)物回收率下降。綜上分析,試驗選擇無水硫酸鎂、HC-C18吸附劑、PSA 用量分別為250,15,80 mg。

2.3 流動相體系的選擇

分別以甲醇、乙腈為有機(jī)相,0.1%甲酸溶液、水為水相進(jìn)行組合試驗考察。結(jié)果表明:以0.1%甲酸溶液-乙腈為流動相體系時,黃曲霉毒素B1的分離效果、質(zhì)譜響應(yīng)信號、色譜峰峰形較佳。因此,試驗選擇的流動相體系為0.1%甲酸溶液-乙腈。黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of aflatoxin B1 standard solution

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

取適量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈逐級稀釋,配制成黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度為1.44,2.88,5.76,11.52,14.40μg·L—1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照儀器工作條件進(jìn)行測定,以黃曲霉毒素B1的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的定量離子對響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為1.44～14.40μg·L—1,線性回歸方程為y＝5 910x＋998.4,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

分別以3,10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結(jié)果分別為0.03μg·kg—1和0.09μg·kg—1。

2.5 精密度和回收試驗

在空白六堡茶樣品中加入不同質(zhì)量濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液,使黃曲霉毒素B1加標(biāo)量分別為1.00,2.50,5.00,10.00μg·kg—1,分別采用本方法和GB 5009.22—2016(以黃曲霉毒素B1免疫親和柱凈化)進(jìn)行測定,每個濃度水平重復(fù)測定6次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

結(jié)果顯示:本方法的回收率為76.3%～87.3%,測定值的RSD 為2.5%～5.9%;GB 5009.22—2016的回收率為47.3%～74.0%,測定 值的RSD 為3.6%～5.1%。六堡茶在渥堆、陳化加工過程中,茶葉中的茶多酚在微生物作用下會氧化形成大量的茶褐素、茶紅素等水溶性茶色素[25-26],這些茶色素大分子物質(zhì)可能對免疫親和柱吸附、分離黃曲霉毒素B1形成干擾,造成GB 5009.22—2016的回收率和精密度較差。而本方法的回收率和精密度均符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F.1和F.2的要求,說明本方法適用于六堡茶樣品中黃曲霉毒素B1的安全檢測分析與風(fēng)險防控。

2.6 樣品分析

按照試驗方法對市售的50批六堡茶樣品進(jìn)行分析,結(jié)果均未檢出黃曲霉毒素B1,在一定程度上說明六堡茶受到黃曲霉毒素B1污染的安全風(fēng)險較低。相關(guān)研究已明確曲霉屬真菌為黑茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群[27],從食品安全角度考慮,茶葉發(fā)酵過程中曲霉屬真菌可能產(chǎn)生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、青霉酸等多種有害真菌毒素殘留風(fēng)險,但是茶葉基質(zhì)成分中含有豐富的咖啡堿、茶色素、多酚、多糖等功效成分,其次生代謝物在外源真菌存在的情況下,具有可以抑制霉菌產(chǎn)生有害真菌毒素的能力[28]?；谝陨舷嚓P(guān)研究可以推測,六堡茶這種后發(fā)酵黑茶雖然在渥堆、陳化過程中可能產(chǎn)生大量曲霉屬真菌,但由于茶葉中含有大量的功效成分從而抑制外源微生物產(chǎn)生有害真菌毒素,所以檢測的50批六堡茶樣品中未檢出黃曲霉毒素B1。

本工作通過優(yōu)化提取溶劑、凈化劑、色譜流動相等條件,提出了Qu ECh ERS-UHPLC-MS/MS測定六堡茶中黃曲霉毒素B1含量的方法。該方法無需使用免疫親和柱或固相微萃取柱,具有操作簡單、分析成本低等優(yōu)點,并且精密度好、準(zhǔn)確度高;同時本方法適用于高纖維茶葉類基質(zhì)中黃曲霉毒素B1的檢測,拓展了目前相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)適用基質(zhì)的范圍。