王 歡，陳煜民，李 凱，張微微*，鄧建玲*

（1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)系，上海 201699；2.東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 201620）

Kr-h1（Krüppel-homolog 1）是一種含有C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子[1]，協(xié)同Met 基因與E93 基因，由這三者作為關(guān)鍵因子共同組成了MEKRE93 通路，并控制著變態(tài)[2]。Met 基因協(xié)同保幼激素通過結(jié)合Kr-h1基因上游應(yīng)答原件來激活Kr-h1[3]，Broad 復(fù)合體作為蛻皮激素信號通路的重要節(jié)點，E93 轉(zhuǎn)錄因子作為觸發(fā)成蟲特征出現(xiàn)的關(guān)鍵因子，均受到Kr-h1 基因的調(diào)控[4]。Kr-h1 作為昆蟲變態(tài)發(fā)育重要因子，主要參與保幼激素對于昆蟲變態(tài)發(fā)育的調(diào)控[5]，在昆蟲翅型分化[6]、社會化分工[7]、神經(jīng)系統(tǒng)形成[8]與卵巢發(fā)育[9,10]等生理過程中都發(fā)揮著重要的作用，是近年來研究昆蟲變態(tài)發(fā)育與害蟲生物防治的重要靶標(biāo)分子。

鑒于Kr-h1 在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中的重要性，無論是Kr-h1 抑或C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)均已發(fā)現(xiàn)在昆蟲中相當(dāng)保守[11]，而Kr-h1 本身的磷酸化位點及其激素調(diào)控[12]，也已證明在昆蟲中是進(jìn)化保守的。但對Kr-h1 進(jìn)化的研究尚不充分，其在不同昆蟲中表達(dá)模式的共性尚未明確，因此，全面分析Kr-h1 在不同目昆蟲中的蛋白結(jié)構(gòu)特點與基因表達(dá)模式及其進(jìn)化特征，或可用于限制Kr-h1 在昆蟲化蛹或者蛹期變態(tài)時的表達(dá)、阻斷保幼激素代謝通路，進(jìn)而起到阻礙有害昆蟲正常變態(tài)發(fā)育的目的，這可能成為菜粉蝶等農(nóng)業(yè)害蟲生物防治的新策略。

本研究基于菜粉蝶Kr-h1 基因與NCBI 序列數(shù)據(jù)，解析了昆蟲Kr-h1 基因結(jié)構(gòu)、序列比對、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)與表達(dá)模式分析，并重構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹。以期從基因結(jié)構(gòu)、蛋白特性、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式四個角度對不同昆蟲Kr-h1 基因進(jìn)行分析，進(jìn)一步揭示該基因保守結(jié)構(gòu)特征及表達(dá)模式，為研究Kr-h1 在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能與害蟲的生物防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

菜粉蝶1 齡幼蟲、3 齡幼蟲、5 齡幼蟲、蛹期與成蟲期5 個不同生長發(fā)育時期Kr-h1 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與成蟲基因組數(shù)據(jù)為本實驗室前期測序拼接而成。本研究中涉及到的其他昆蟲的相關(guān)Kr-h1 序列均下載自NCBI數(shù)據(jù)庫（表1）。使用課題組提供的菜粉蝶Kr-h1 基因序列以及在NCBI 網(wǎng)站上檢索并下載目前已確定的昆蟲Kr-h1 序列及其注釋文件。利用GSDS 在線工具（http://gsds.gao-lab.org/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖，分析基因結(jié)構(gòu)，明確Kr-h1 基因在不同昆蟲中外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量與位置。

表1 NCBI 下載的昆蟲Kr-h1 蛋白序列Table 1 Insect Kr-h1 sequences downloaded from NCBI

1.2 昆蟲Kr-h1 蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析

利用ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）得到Kr-h1 蛋白理化性質(zhì)和氨基酸組成。利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html）預(yù)測Kr-h1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)元件組成；使用SWISS-MODEL 在線網(wǎng)站（https://swissmodel.expasy.org/），預(yù)測Kr-h1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)；利用NetPhos-3.1Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）預(yù)測磷酸化位點；通過CBS 網(wǎng)站( http:∥www.cbs.dtu.dk/) 預(yù)測糖基化位點。使用SMART 在線軟件（http://smart.emblheidelberg.de/）對不同昆蟲的Kr-h1 蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。利用MEME（https://prosite.expasy.org/scanprosite/）在線工具分析不同目昆蟲Kr-h1 蛋白的保守基序?qū)EME 預(yù)測得到的文件儲存為XML 格式，導(dǎo)入Tbtool軟件中，繪制保守基序圖。

1.3 昆蟲Kr-h1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGAX 軟件（http://www.megasoftware.net/）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并分析其保守結(jié)構(gòu)域氨基酸位點的特征。使用MEGAX 軟件，構(gòu)建昆蟲Kr-h1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析昆蟲Kr-h1 的進(jìn)化特征。

1.4 昆蟲Kr-h1 基因的表達(dá)模式分析

本實驗室前期獲得的菜粉蝶1 齡幼蟲、3 齡幼蟲、5 齡幼蟲、蛹期及成蟲期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并根據(jù)文獻(xiàn)篩選出本次研究相關(guān)的Kr-h1 蛋白基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)[13-19]。通過相對蛹期或最后幼蟲期作歸一化處理，并構(gòu)建熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲Kr-h1 的基因結(jié)構(gòu)

Kr-h1 基因包含2～4 個外顯子，以2 個外顯子組成為主。故種間內(nèi)含子數(shù)目差異較小，但種間內(nèi)含子距離相差較大，范圍涵蓋100 bp 至4 kb。斷裂最明顯的是蚤目的貓蚤與雙翅目的黑腹果蠅，其Kr-h1 基因由4個外顯子與3 個內(nèi)含子構(gòu)成。通過序列觀察可知，昆蟲Kr-h1 基因內(nèi)含子剪切位點滿足GT-AG 規(guī)則（圖1）。

2.2 昆蟲Kr-h1 蛋白氨基酸組成分析

序列相似性分析結(jié)果顯示，菜粉蝶Kr-h1 蛋白與除了與同為鱗翅目的家蠶相似度較高外，與其他目昆蟲的相似度都在60%上下（表2）。多序列比對發(fā)現(xiàn)，昆蟲Kr-h1 蛋白均含8 個保守的C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)，且所有鋅指結(jié)構(gòu)攜有共同序列：賴氨酸-X2～4-賴氨酸-X8～9-亮氨酸-X2-組氨酸-X3-組氨酸（圖2），提示該基因在進(jìn)化中功能保守性較好。

Kr-h1 蛋白在不同目昆蟲中差異較大，分子量在39 K～91 K，等電點PI 在9.15～6.84。Kr-h1 中含量最豐富的氨基酸都是絲氨酸，其次為脯氨酸，通過對保守結(jié)構(gòu)域的分析發(fā)現(xiàn)這可能與其鋅指結(jié)構(gòu)組成有關(guān)。

2.3 二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)

Kr-h1 蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測結(jié)果表明：多數(shù)昆蟲Kr-h1 約20%為α-螺旋，無規(guī)卷曲占約60%，延伸鏈約15%。菜粉蝶α-螺旋占比只有9.63%，同時無規(guī)卷曲的占比卻高達(dá)72.24%，表現(xiàn)出與其他昆蟲不同的結(jié)構(gòu)特性（表3）。

昆蟲Kr-h1 蛋白三級結(jié)構(gòu)表明，昆蟲Kr-h1 蛋白都具有8 個鋅指結(jié)構(gòu)，而每個鋅指結(jié)構(gòu)又由一個α-螺旋與一個β-折疊構(gòu)成（圖3），使得Kr-h1 蛋白二級結(jié)構(gòu)元件組成相對穩(wěn)定。通過圖中可以看出，雖然菜粉蝶Kr-h1 蛋白具有較多的無規(guī)卷曲比例，其Kr-h1 蛋白與其他昆蟲在保守結(jié)構(gòu)上無明顯差異。

圖3 四種昆蟲Kr-h1 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Tertiary structure prediction of four insect Kr-h1 protein

2.4 保守基序與結(jié)構(gòu)域

昆蟲中的Kr-h1 蛋白大部分含有相同的基序構(gòu)成（圖4）。Motif 1～8 為所有Kr-h1 蛋白的共有結(jié)構(gòu)域，但是其中motif 1～6 共同構(gòu)成Kr-h18 個保守的鋅指結(jié)構(gòu)（圖5），motif 9 與motif 10 保守性較差，結(jié)合進(jìn)化樹分析（圖6）發(fā)現(xiàn)，motif 9 僅存在于進(jìn)化樹的下半部分，motif 10 只在鱗翅目的菜粉蝶、家蠶、草地貪夜蛾和玉帶鳳蝶中存在，與之類似的Motif15 同樣只存在于鞘翅目昆蟲中，體現(xiàn)出在長期進(jìn)化過程中鱗翅目昆蟲與鞘翅目昆蟲獨特的進(jìn)化選擇。

圖4 昆蟲Kr-h1 蛋白保守基序分析Fig.4 Conserved motifs in insect Kr-h1 protein

圖5 昆蟲Kr-h1 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Conserved domain prediction of insect Kr-h1 protein

圖6 昆蟲Kr-h1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on insect Kr-h1 protein

2.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

昆蟲綱9 個目計40 種昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖6 所示，Kr-h1 蛋白在進(jìn)化樹分支上存在明顯種屬特征，同目昆蟲多為單系群存在，表明Kr-h1 蛋白為直系同源，分化晚于目分化，如菜粉蝶Kr-h1 與同目的家蠶Kr-h1 最為接近。但半翅目為非單系群，有待進(jìn)一步研究。

分別重構(gòu)Zn1～Zn8 的鋅指蛋白基因進(jìn)化樹圖。結(jié)果如圖7 所示，Zn1-8，不同昆蟲的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不一，表明不同鋅指結(jié)構(gòu)基因進(jìn)化存在差異。Zn1 與Zn8 進(jìn)化樹中不同昆蟲間較為分散，相互之間遺傳距離較遠(yuǎn)，序列差異度大，即Zn1 與Zn8 保守性不足（圖7A，圖7H）。在Zn2 中可明顯發(fā)現(xiàn)部分昆蟲序列差異較小，這說明在昆蟲長期進(jìn)化過程中Zn2 的保守性較好（圖7B），其余鋅指結(jié)構(gòu)亦呈現(xiàn)類似Zn2 特征。

圖7 昆蟲Kr-h1 蛋白Zn1～Zn8 的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.7 Phylogenetic analysis based on Zn1―Zn8 of insect Kr-h1 protein

2.6 昆蟲Kr-h1 基因的表達(dá)模式分析

從圖8 中可知，Kr-h1 在幼蟲階段的表達(dá)明顯高于蛹期。在幼蟲早期階段Kr-h1 的明顯高表達(dá)，特別是果蠅中幼蟲早期階段的表達(dá)量數(shù)據(jù)達(dá)到了蛹期表達(dá)量的4 倍以上，在鱗翅目梨小食心蟲中也有著相似的表達(dá)趨勢。發(fā)育中期大部分昆蟲Kr-h1 的表達(dá)量都有所回落，其中屬于鱗翅目的梨小食心蟲與鞘翅目的赤擬谷盜中這一趨勢較為明顯，提示與迅速生長與頻繁蛻皮有關(guān)。在黑腹果蠅與梨小食心蟲中，幼蟲末期Kr-h1 的表達(dá)量與蛹期差距不大，但是在赤擬谷盜與桔小實蠅中卻出現(xiàn)明顯差距。在成蟲階段可見Kr-h1的表達(dá)有部分回升，例如黑腹果蠅與梨小食心蟲。

圖8 昆蟲Kr-h1 基因表達(dá)模式Fig.8 Insect Kr-h1 gene express pattern

在不完全變態(tài)昆蟲中，同樣體現(xiàn)出了與完全變態(tài)昆蟲類似的表達(dá)模式，都與昆蟲的發(fā)育階段高度相關(guān)。例如在幼蟲早期中高表達(dá)，幼蟲中期表達(dá)下降，幼蟲后期有所回升。由于不完全變態(tài)昆蟲并沒有蛹期，最后一個幼蟲期Kr-h1 同樣會出現(xiàn)低表達(dá)，這與完全變態(tài)昆蟲中Kr-h1 在蛹期的表達(dá)趨勢一致，體現(xiàn)出Kr-h1在完全變態(tài)昆蟲或者不完全變態(tài)昆蟲中表達(dá)模式高度相似。

3 討論

本研究結(jié)果表明，Kr-h1 外顯子數(shù)量保守，內(nèi)含子長度變異較大。Kr-h1 蛋白二維與三維結(jié)構(gòu)的保守性與8 個鋅指結(jié)構(gòu)的保守性，共同促進(jìn)了Kr-h1 蛋白功能的穩(wěn)定性。系統(tǒng)發(fā)育分析昆蟲Kr-h1 為直系同源，親緣關(guān)系與物種進(jìn)化相吻合，基于鋅指結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育則表現(xiàn)Kr-h1 不同模塊進(jìn)化中的差異。

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明在長期進(jìn)化過程中Kr-h1 基因較為保守，斷裂程度不高，由此推測其編碼蛋白在不同昆蟲中的結(jié)構(gòu)變化不大且作用相似。結(jié)合進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)Kr-h1 基因結(jié)構(gòu)的變化與昆蟲的生活習(xí)性呈現(xiàn)一定關(guān)聯(lián)性，在進(jìn)化樹中同屬于一個單系群，同時基因結(jié)構(gòu)也更為相似，這暗示著Kr-h1 的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化伴隨著昆蟲生活習(xí)性演化。此外，可變剪切如在果蠅體內(nèi)存在著Kr-h1 的三種剪切亞型α、β與λ[16]，亦有可能是進(jìn)化的形式。

通過對于Kr-h1 蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Kr-h1 蛋白在不同昆蟲中理化性質(zhì)并沒有體現(xiàn)出明顯規(guī)律，但在大多數(shù)昆蟲中都具有明顯的絲氨酸偏好性，進(jìn)一步通過磷酸化位點預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，這種絲氨酸偏好性與絲氨酸磷酸化調(diào)控Kr-h1 生物學(xué)活性有關(guān)[20]。二級結(jié)構(gòu)元件組成分析發(fā)現(xiàn)Kr-h1 蛋白在不同昆蟲中各二級結(jié)構(gòu)比例較為穩(wěn)定。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測、保守結(jié)構(gòu)域及氨基酸序列分析顯示，Kr-h1 蛋白在不同昆蟲中具有8 個保守的鋅指結(jié)構(gòu)，其共有序列特征為：賴氨酸-X2～4-賴氨酸-X8～9-亮氨酸-X2-組氨酸-X3-組氨酸。進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，這8 個鋅指的保守性存在差異，處于首尾位置的Zn1 和Zn8 保守性較低，Zn2～Zn7 的保守性較高。推測這與不同物種間Kr-h1 的功能差異有關(guān)。同時，在少數(shù)昆蟲中，亦發(fā)現(xiàn)可能存在Zn1 確實的情況[21]，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在表達(dá)模式分析中發(fā)現(xiàn)，Kr-h1 表達(dá)水平顯示出了與發(fā)育階段高度的相關(guān)性。在在幼蟲早期高表達(dá)，不同物種幼蟲期高低各異，但總體上幼蟲中后期有所回落，蛹期（完全變態(tài)）或末齡若蟲階段（不完全變態(tài)）維持低水平表達(dá)，在成蟲期又出現(xiàn)明顯回升。成蟲期Kr-h1 表達(dá)量的回升，考慮到Kr-h1 有著調(diào)控生殖行為，影響果蠅產(chǎn)卵的作用，推測昆蟲在Kr-h1 在成蟲階段參與調(diào)控昆蟲繁殖過程調(diào)控。同時，卵巢成熟與Kr-h1 蛋白表達(dá)的相關(guān)性，進(jìn)一步提示Kr-h1 作為藥物靶點的可行性[22]。此外不同組織內(nèi)Kr-h1 的表達(dá)變化還有待探索，后續(xù)可以探索使用多種昆蟲原始測序數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探究Kr-h1 的功能表達(dá)特征。

正如Gilbert[23]所述，昆蟲發(fā)育的研究對于防治具有無可估量的價值，通過挖掘發(fā)育中的關(guān)鍵基因，既可直接采用RNA 干擾等措施直接防治，亦可為害蟲防控策略的探索提供重要參考。因此，從發(fā)育分子生物學(xué)視角挖掘昆蟲變態(tài)分子機(jī)制，可為菜青蟲等害蟲生物防治提供更多的防治策略與手段。通過菜粉蝶Kr-h1 基因及其編碼蛋白的鑒定、相關(guān)保守結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化分析和不同昆蟲的表達(dá)模式分析，豐富了我們對昆蟲Kr-h1 蛋白的認(rèn)識，但是對于昆蟲Kr-h1 蛋白功能方面的研究尚未完全清晰，而上述研究也為今后進(jìn)一步研究昆蟲Kr-h1 的功能以及其在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Kr-h1 蛋白在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中起到的作用不言而喻，因此上述對昆蟲Kr-h1 基因及其編碼蛋白的研究為尋找新型生物農(nóng)藥靶點提供了有利參考，為菜粉蝶等農(nóng)業(yè)害蟲的防治策略開辟了新思路，其實踐意義重大。