王冬納，李六民，徐建邦，張意林，周文良，何淑明

[1.中山市小欖人民醫(yī)院（中山市第五人民醫(yī)院）婦產(chǎn)科，廣東 中山 528415；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275]

需氧菌性陰道炎（aerobic vaginitis,AV）是生育期婦女常見的生殖道感染性疾病，與流產(chǎn)、胎兒感染和早產(chǎn)密切相關(guān)[1]。AV 的治療手段包括雌激素、抗菌藥物、抗炎藥物和益生菌療法等[2]。AV 發(fā)生的分子機(jī)制尚不清楚，治療方案尚未形成共識(shí)，有待進(jìn)一步研究從而提供更有效的治療新策略。

AV 的突出臨床表現(xiàn)是陰道內(nèi)出現(xiàn)顯著炎癥反應(yīng)和陰道上皮損傷。需氧性泌尿生殖道病原體的黏附導(dǎo)致局部免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)失衡；促炎細(xì)胞因子如IL-6 和IL-1β等在AV 患者陰道中生成顯著增加[3]，這是不良妊娠事件的重要危險(xiǎn)因素[4]。AV患者陰道中最常見的致病菌是大腸桿菌（E. coli，7.5%）和金黃色葡萄球菌（S.aureus，4.5%）[5]。當(dāng)陰道內(nèi)菌群紊亂時(shí)，這些促炎細(xì)胞因子促進(jìn)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的生長，抑制乳酸桿菌的生長，加劇陰道炎癥[6]。這些致病菌（如大腸桿菌）被用來制備大鼠AV 模型，研究AV 的發(fā)病機(jī)制和治療措施[7]。

硫化氫（H2S）是一種氣體，產(chǎn)生于各種器官，如大腦、肝臟和心血管系統(tǒng)[8]。H2S在炎癥中的作用與其濃度密切相關(guān)：高濃度（病理濃度）的H2S 具有促炎作用，而低濃度（生理濃度）的H2S 具有抗炎作用[9]。研究表明，H2S 通過增強(qiáng)cAMP/蛋白激酶A（PKA）信號(hào)軸而激活囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR），從而調(diào)控陰道上皮細(xì)胞的Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)[10-11]。CFTR 表達(dá)下調(diào)促進(jìn)人陰道上皮細(xì)胞內(nèi)Cl-聚集，而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[12]。H2S 在AV 炎癥反應(yīng)中的作用尚不清楚。NaHS 在水溶液中易水解生成H2S 和氫氧根。本研究用它作為H2S 的供體，探討H2S 對(duì)需氧性細(xì)菌（大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌）引起的陰道炎癥反應(yīng)的作用及其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人陰道上皮細(xì)胞株（VK2/E6E7）購自美國ATCC 公司。胎牛血清（1027-106）購自美國Gibco公司。青霉素/鏈霉素雙抗（WH0518）購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。Keratinocyte sFm培養(yǎng)基（17005042）購自美國Thermo Fisher 公司。NaHS（16721-80-5）購自安耐吉化學(xué)公司。CCK-8試劑盒（C0039）、RIPA 裂解液（P0013B）、PMSF（ST506）和氯離子探針MQAE（S1082）購自碧云天生物科技有限公司。大腸埃希菌（133264）和金黃色葡萄球菌（186335）購自北納生物公司。RNA 提取試劑盒（RP1201）購自百泰克生物技術(shù)有限公司。HiScript II Q RT SuperMix 試劑盒（R223-01）購自諾唯贊公司。BCA 試劑盒（23227）購自美國Pierce 公司。PVDF 膜（IPVH00010）購自美國Millipore 公司。牛血清白蛋白BSA（A600332）購自中國生工生物工程股份有限公司。CFTR 一抗（sc-376683）購自美國Santa Cruz 公司。磷酸化p65 一抗（YP0191）和p65 一抗（YM3111）購自美國Immunoway 公司。β-actin 一抗（20536-1-AP）購自美國Proteintech 公司。HRP 偶聯(lián)的抗兔二抗（BA1054）和抗鼠二抗（BA1051）購自武漢博士德生物工程有限公司。β-雌二醇（50-28-2）購自美國Sigma Aldrich公司。4%（φ）多聚甲醛（30525-89-4）購自西亞試劑公司。脫蠟劑（CX-001）購自廣西岑溪松香廠。蘇木精溶液（G1004）和伊紅溶液（G1001）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只SPF 級(jí)雌性SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)中山市小欖人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（ZSXL-LL2018-038）

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

VK2/E6E7 細(xì)胞在含10%（φ）胎牛血清和青霉素/鏈霉素（100 u/mL）的Keratinocyte sFm 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為確定NaHS 的最佳濃度，VK2/E6E7細(xì)胞在培養(yǎng)皿或板中過夜生長，然后給予不同濃度（1 ～200 μmol/L）的NaHS 孵育24 h 或48 h；NaHS 母溶液用超純水（ddH2O）配制，然后在培養(yǎng)基中稀釋到相應(yīng)工作濃度。對(duì)照組細(xì)胞的培養(yǎng)基加入與處理組等量的ddH2O。

1.4 AV細(xì)胞模型的制備與NaHS干預(yù)

AV 細(xì)胞模型制備：VK2/E6E7 細(xì)胞與大腸埃希菌或者金黃色葡萄球菌共同孵育24 h。感染的細(xì)胞中加入NaHS（20 μmol/L）孵育24 h，進(jìn)行ELISA、實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）、蛋白印跡和流式細(xì)胞檢測。

1.5 CCK-8檢測

根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行細(xì)胞活性測定。細(xì)胞處理完成后，將10 μL 的CCK-8 溶液加入到含有100 μL 培養(yǎng)基的孔中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后在多功能微孔分光光度計(jì)（Thermo Fisher，Multiskoun，美國）中測量450 nm波長處的吸光度值（A）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 qPCR檢測

根據(jù)產(chǎn)品說明書操作，使用RNA 提取試劑盒提取樣品總RNA。采用HiScript II Q RT SuperMix試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。qPCR 引物在探真生物公司合成。引物序列為：ACTB，正向引物：5′-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCCT-3′，反向引物：5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCT-3′；IL-6，正向引物：5′-TGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGC-3′，反向引物：5′-CGGAACTCCAGAAGACCAGA-3′；IL-1β，正向引物：5′-CCTATGTCTTGCCCGTGGAG-3′，反向引物：5′-CACACACTAGCAGGTCGTCA-3′。qPCR在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行：1 μL cDNA，1.6 μL引物，10 μL SYBR，和7.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件為94 °C，30 s；60 °C，20 s；72 °C，20 s；40 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 蛋白印跡檢測

細(xì)胞在含有PMSF（2 mmol/L）的RIPA 裂解液中裂解，使用BCA試劑盒檢測樣品的蛋白濃度。蛋白樣品（10 μg/條帶）在SDS-PAGE 凝膠中以80～120 V 電壓進(jìn)行電泳分離1.5 h。以250 mA 電流轉(zhuǎn)移100 min將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在室溫下與TBST（含5% BSA）孵育1.5 h 進(jìn)行封閉。PVDF 膜在4 °C 與以下一抗抗體孵育過夜：CFTR 一抗（1∶1 000）、磷酸化p65 一抗（1∶1 000）、p65 一抗（1∶1 000）和β-actin 一抗（1∶1 000）。PVDF膜用TBST 洗3 遍后，在室溫下與HRP 偶聯(lián)的抗兔/抗鼠二抗（1∶7 500）共同孵育2 h。印跡膜使用TanonTMHigh-sig ECL 底物按照產(chǎn)品說明進(jìn)行孵育，在Tanon-5200 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取和分析蛋白印跡圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 流式細(xì)胞檢測

細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化獲取細(xì)胞懸液，離心去上清。用PBS 洗滌3 次后，將細(xì)胞沉淀與含5 mmol/L MQAE 的Krebs-HEPES 溶液混勻，在室溫下避光孵育30 min。用PBS 洗滌細(xì)胞3 次后，使用流式細(xì)胞儀（Novocyte2040R，ACEA，美國）和NovoExpress軟件進(jìn)行分析。測量并比較各組的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 AV動(dòng)物模型與分組給藥

將40 只大鼠隨機(jī)分為5 組，每組8 只，分別為：對(duì)照組、E. coli感染組（E. coli）、E. coli感染+NaHS處理組（E.coli+NaHS）、S.aureus感染組（S.aureus）和S.aureus感染+NaHS 處理組（S.aureus+NaHS）。AV 大鼠模型制備參照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行。給予大鼠每天皮下注射0.5 mgβ-雌二醇，持續(xù)2 d 以誘導(dǎo)發(fā)情。通過用無菌棉簽?zāi)Σ陵幍澜M織50 次造成陰道壁機(jī)械性損傷。隨后，將E.coli或S.aureus菌液（0.025 mL/100 g，3×107CFU）灌入陰道，并保持陰道呈朝上以防止溶液流出，連續(xù)灌注6 d；對(duì)照組陰道灌注等量生理鹽水。NaHS 濃度為400 μmol/L。NaHS 治療（E.coli/S.aureus+NaHS 組）從感染的第6 天開始進(jìn)行。每只大鼠每天經(jīng)陰道注射NaHS 溶液100 μL，連續(xù)3 d。在完成最后一次治療24 h后，經(jīng)麻醉后處死大鼠并收集陰道組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色和qPCR分析。

1.10 HE染色

陰道組織用4%（φ）的多聚甲醛固定，制作蠟塊切片（3 μm）。切片在60°C 下孵育2 h后，使用脫蠟劑脫蠟10 min，用100%、95%和75%酒精對(duì)切片進(jìn)行水合處理。組織切片HE 染色、漂洗、脫水、清理和封片，在顯微鏡下成像。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組和兩組以上的組間差異分別使用Student'st檢驗(yàn)和單因素方差分析（Bonferroni檢驗(yàn)）進(jìn)行比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NaHS對(duì)AV大鼠陰道炎癥反應(yīng)的作用

陰道組織HE 染色顯示，對(duì)照組大鼠的陰道組織呈現(xiàn)有序排列的分層鱗狀上皮和緊密的黏膜層，E.coli和S.aureus感染組大鼠的陰道組織黏膜層增生和上皮下炎癥細(xì)胞浸潤（如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞）。與感染組相比，NaHS 干預(yù)組大鼠的陰道組織黏膜層增生和上皮下炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少（圖1A）。與對(duì)照組相比，E.coli或S.aureus感染組大鼠陰道組織的IL-6（圖1B）和IL-1β（圖1C）mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與感染組相比，NaHS 干預(yù)組的IL-6 和IL-1βmRNA 表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 NaHS對(duì)E.coli或S.aureus感染大鼠陰道組織形態(tài)變化和促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響Figure 1 Effect of NaHS treatment on morphological changes and proinflammatory cytokine expression in vaginal tissues of rats infected with E.coli or S.aureus(n=3)

2.2 NaHS 對(duì)E.coli 或S.aureus 誘導(dǎo)的陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

CCK-8 結(jié)果顯示，NaHS 在濃度范圍1～200 μmol/L 時(shí)，與VK2/E6E7 細(xì)胞孵育24 h 對(duì)細(xì)胞活性沒有明顯影響，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2A）。當(dāng)孵育時(shí)間延長至48 h，細(xì)胞活性降低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇24 h作為NaHS處理的時(shí)間點(diǎn)。

圖2 NaHS對(duì)陰道上皮細(xì)胞活性的影響（n=3）Figure 2 Effect of NaHS on vaginal epithelial cell viability(n=3)

ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，E.coli或S.aureus感染24 h 顯著增加促炎細(xì)胞因子（IL-6 和IL-1β）的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3A—D）。與感染組相比，NaHS 干預(yù)組呈濃度依賴性地降低E.coli或S.aureus感染細(xì)胞中IL-6 和IL-1β的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3A-3D）?；谶@些結(jié)果，本研究選擇20 μmol/L NaHS作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)條件。

圖3 NaHS對(duì)E.coli或S.aureus感染VK2/E6E7細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響Figure 3 Effect of NaHS on proinflammatory cytokine expression in VK2/E6E7 cells stimulated with E.coli or S.aureus(n=3)

與ELISA 結(jié)果一致，qPCR 結(jié)果顯示，E. coli或S. aureus感染細(xì)胞的IL-6 mRNA 表達(dá)水平比對(duì)照組高，分別約為對(duì)照組的1.5 倍和1.6 倍。與感染組相比，NaHS（20 μmol/L）干預(yù)組細(xì)胞的IL-6（圖3E）和IL-1β（圖3F）mRNA 表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 NaHS 對(duì)E.coli和S.aureus感染陰道上皮細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路的影響

如圖4 所示，與對(duì)照組相比，E.coli或S.aureus感染組細(xì)胞的p-p65蛋白表達(dá)和p-p65/p65比值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與感染組相比，NaHS干預(yù)組細(xì)胞的p-p65蛋白表達(dá)和p-p65/p65比值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 NaHS 對(duì)E.coli 或S.aureus 感染陰道上皮細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)Cl-的影響

使用MQAE 作為細(xì)胞內(nèi)Cl-的熒光指示劑。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示（圖5），與對(duì)照組相比，E.coli感染組VK2/E6E7細(xì)胞胞內(nèi)Cl-增加了1.5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與感染組相比，NaHS干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)Cl-顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 NaHS對(duì)E.coli或S.aureus感染的VK2/E6E7細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度的影響Figure 5 Effect of NaHS on intracellular Cl- concentrations in VK2/E6E7 cells stimulated with E.coli or S.aureus(n=3)

蛋白印跡結(jié)果顯示（圖6），對(duì)照組、感染組和NaHS 處理組間的CFTR 蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 NaHS對(duì)E.coli或S.aureus感染的VK2/E6E7細(xì)胞CFTR表達(dá)的影響Figure 6 Effect of NaHS on CFTR expression in VK2/E6E7 cells stimulated with E.coli or S.aureus(n=3)

3 討論

本研究結(jié)果表明NaHS 能抑制需氧菌陰道炎相關(guān)病原體E.coli或S.aureus感染引起的陰道炎癥反應(yīng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)NaHS 能抑制這些病原菌誘導(dǎo)的NFκB信號(hào)通路激活和細(xì)胞內(nèi)Cl-的聚集。

需氧菌性陰道炎的主要特點(diǎn)是炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，促炎細(xì)胞因子（如IL-1β和IL-6）水平升高[2]。本研究結(jié)果顯示，E. coli和S. aureus感染使VK2/E6E7 細(xì)胞釋放的IL-1β和IL-6 顯著增加，而NaHS干預(yù)呈濃度依賴性降低這些促炎細(xì)胞因子的水平。與ELISA結(jié)果一致，NaHS顯著降低E.coli和S.aureus感染VK2/E6E7細(xì)胞中IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)。NaHS 是一種快速釋放的H2S 供體[14]。本研究結(jié)果表明NaHS 抑制E.coli和S.aureus感染引起的陰道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，NaHS也顯著抑制E.coli和S.aureus感染引起的AV 大鼠陰道組織中IL-6 和IL-1βmRNA 的過度表達(dá)和陰道組織的病理改變。本研究結(jié)果與曾佳洪等[15]報(bào)道的一致，曾佳洪等的研究顯示在小鼠燒傷模型中，NaHS 通過降低包括IL-6 和IL-10 在內(nèi)的一系列促炎細(xì)胞因子水平，顯著抑制炎癥反應(yīng)。多項(xiàng)研究表明低濃度H2S（或H2S 供體）具有顯著抗炎效應(yīng)[9，16]。本研究揭示H2S對(duì)需氧菌性陰道炎相關(guān)病原菌感染引起的陰道炎癥具有抗炎效應(yīng)。

研究表明，滴蟲性陰道炎感染通過降低陰道上皮細(xì)胞中CFTR 的表達(dá)而阻斷細(xì)胞內(nèi)Cl-分泌，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Cl-聚集[17]。在脾細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞中，CFTR 表達(dá)減少或者活性降低可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Cl-堆積而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[18-20]。CFTR 功能缺陷的促炎作用與激活NF-κB 信號(hào)通路密切相關(guān)，而恢復(fù)CFTR 的表達(dá)則抑制NF-κB 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[19，21]。H2S 通過激活CFTR 調(diào)節(jié)陰道上皮細(xì)胞中的Cl-離子轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。本研究顯示，E. coli和S. aureus感染誘發(fā)陰道炎癥反應(yīng)和激活NF-κB 信號(hào)通路，導(dǎo)致陰道上皮細(xì)胞內(nèi)Cl-聚集，這些效應(yīng)顯著被NaHS抑制。研究結(jié)果表明H2S 抑制E.coli和S.aureus感染誘發(fā)的陰道炎癥反應(yīng)和NF-κB 信號(hào)通路，活化未通過調(diào)控CFTR 表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。H2S 是否通過調(diào)節(jié)CFTR 通道活性而發(fā)揮其抑制需氧性病原菌誘發(fā)的陰道炎癥還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明，H2S 可能是通過抑制陰道上皮細(xì)胞內(nèi)Cl-聚集而阻止NF-κB信號(hào)通路活化，從而抑制E. coli和S. aureus感染引發(fā)的陰道炎癥反應(yīng)。