葉菁華，李慧慧，柯遠程，秦宏濤，馬穎蕓，肖夢莎，冼毅盈，侯冬枝

（廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院/廣東省局部精準遞藥制劑工程技術(shù)研究中心/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006）

青光眼是我國常見眼部疾病，同時亦是我國三大后天致盲因素之一[1-2]，隨著病情發(fā)展，其病理性的眼壓增高壓迫視覺神經(jīng)對患者造成不可逆的視覺損傷[3-4]。為防止病情惡化，臨床上患者需長期使用倍他洛爾等降眼壓藥物，以防止視覺神經(jīng)的損傷。鹽酸倍他洛爾（betaxolol hydrochloride, BH）為一種β受體阻滯劑，目前市場上常被制成滴眼液給藥。但由于傳統(tǒng)滴眼液生物利用度低，患者需通過1 日5 次反復(fù)給藥以達到治療藥效，給藥次數(shù)多，導(dǎo)致患者依從性差，制備緩釋制劑可有效改善該情況。BH 作為親水性小分子藥物，制備緩釋制劑更具挑戰(zhàn)性。為保證其緩釋性能，本課題組研制鑲嵌載體的離子交換微球，并尋找適合的藥物載體。

蒙脫石（montmorillonite，MMT）具有天然納米片層結(jié)構(gòu)，由于同構(gòu)取代，片層晶格結(jié)構(gòu)中的高價鋁離子、硅離子被低價的金屬離子取代，使蒙脫石的片層具有永久的負電性，堆疊的片層間隙通過吸附各種陽離子以補償電荷的損失，具有良好的吸附性能，應(yīng)而常作為吸附劑用于污水處理[5-8]。蒙脫石片層間吸附的金屬陽離子可交換的特性，表明蒙脫石可能具有通過離子交換的方式吸附陽離子型親水性藥物BH 的潛力[9]。離子交換藥物載體釋藥依賴離子交換作用，不受崩解或溶蝕過程影響，故可以恒定速率釋藥。

近年來，MMT 作為藥物輔料的相關(guān)研究已有文獻報道[10-13]，但對MMT的載藥性能和釋藥性能影響因素的研究尚少。為優(yōu)化MMT 對親水性小分子藥物BH 的載藥條件，本文探討影響B(tài)H-MMT 載藥量的因素，并進一步考察MMT對BH 的載藥性能與緩釋性能。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA124S-CW 萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Basic 磁力攪拌器（德國IKA 公司）；JY 92-II 超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；PHS-3F pH 計（上海雷磁儀器有限公司）；THZ-82氣浴恒溫振蕩器（上海宵漢實業(yè)發(fā)展有限公司）；激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；LGJ-10C 冷凍干燥機（北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司）；UV-1800PC 紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸倍他洛爾（質(zhì)量分數(shù)99.5%，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司）；蒙脫石（浙江三鼎科技有限公司）；NaH2PO4、H2SO4、H3PO4（分析純，天津致遠化學(xué)試劑有限公司）；Na2HPO4、HCl（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 BH-MMT的制備

精密稱取適量的MMT和BH 置于燒杯中，加入適量去離子水或磷酸鹽緩沖液，磁力攪拌初步分散后，水浴超聲30 min，再于50 ℃水浴條件下磁力攪拌2 h 載藥，期間每間隔0.5 h 開啟磁力攪拌5 min，使絮凝的蒙脫石分散開。載藥結(jié)束后，將MMT 混懸液離心，棄去上清液，收集沉淀的BH-MMT，凍干后，研磨粉碎，過200目篩，即得粉末狀BH-MMT。

按上述BH-MMT的制備方法，載藥結(jié)束后取上清液，過0.22 μm 的微孔濾膜，使用紫外分光光度計測定載藥平衡時游離的BH 濃度，根據(jù)以下公式計算載藥平衡時MMT的載藥量（DL）和包封率（EE）：

式中：Qe為吸附平衡時每克MMT 吸附藥物的質(zhì)量（mg/g）；M1為MMT 的投藥量（g）；M2為BH 的投藥量（mg）；Ce為載藥平衡時上清液的游離藥物濃度（mg/mL）：V為上清液的體積（mL）。

2.2 蒙脫石載藥條件的篩選

2.2.1 分散方式對蒙脫石的影響 MMT 屬于超細粉體，在加入水中時，由于具有較強的親水性，固液界面的MMT 可吸附水分溶脹成為凝膠狀態(tài)，從而阻止水分進一步潤濕內(nèi)部未潤濕的MMT，因此其充分分散較為困難。本文使用機械的方法加速MMT 的分散過程，考察了磁力攪拌（400 r/min）、水浴超聲、細胞粉碎超聲法（477 W，間隔5 s，超聲10 min）對MMT在水中分散后的粒徑的影響。使用激光粒度儀測定以不同分散方式分散在水中后的粒徑及電位，溫度為（25±1）℃，結(jié)果見表1?？梢?，MMT 是帶有負電荷的微粒，水合粒徑在納米范圍；通過攪拌的方式使MMT 分散均勻需要約3 h 的磁力攪拌，分散均勻后，粒徑為475.33 nm，PDI 為0.376；使用水浴超聲可以加快MMT的分散速度，約30 min，分散后的粒徑為441.93 nm，PDI為0.382；細胞粉碎超聲儀超聲10 min 即可使MMT 均勻分散在水中，粒徑為284.50 nm，PDI 為0.414?？紤]粒徑與MMT 的結(jié)構(gòu)完整性，最終采用以磁力攪拌初步分散后，水浴超聲30 min促進MMT分散的方法。

表1 不同分散方法分散后的蒙脫石粒徑與電位Table 1 Particle size and potential of montmorillonite dispersed by different dispersion methods(±s,n=3)

表1 不同分散方法分散后的蒙脫石粒徑與電位Table 1 Particle size and potential of montmorillonite dispersed by different dispersion methods(±s,n=3)

分散方法攪拌分散超聲分散細胞粉碎超聲粒徑/nm 475.33±64.85 441.93±7.11 284.50±17.83 PDI 0.376±0.082 0.382±0.027 0.414±0.066 U/mV-36.33±0.46-36.90±1.47-40.77±0.12

2.2.2 載藥時間對蒙脫石載藥量的影響 以蒙脫石與BH 的質(zhì)量比為1∶3，BH 質(zhì)量濃度為3 mg/mL、載藥介質(zhì)為去離子水，載藥溫度為室溫，在超聲分散30 min后，考察蒙脫石的載藥平衡時間在5 min ～2 h范圍內(nèi)的載藥量，結(jié)果見圖1?？梢姡跀嚢? min及超聲分散30 min 后，幾乎已經(jīng)達到載藥平衡，MMT 對BH 的吸附是在較短的時間完成的，包括分散時間在內(nèi)，1 h基本可完成載藥過程。為確保達到載藥平衡，采用的載藥時間為2 h。

圖1 載藥時間對蒙脫石載藥量的影響Figure 1 Effect of loading time on drug loading of montmorillonite

2.2.3 介質(zhì)pH 值對蒙脫石載藥量的影響 通過以不同pH 值的磷酸鹽緩沖液為載藥介質(zhì)，考察pH 值對MMT載藥的影響。按照1 mg/mL MMT、3 mg/mL BH 的濃度，載藥介質(zhì)為0.2 mol/L的pH 值為2、4、6、8 的磷酸鹽緩沖液，在50 ℃水浴條件下載藥，測定不同pH 條件下載藥量，結(jié)果見圖2?？梢姡趐H=2.0時，蒙脫石的載藥量較低，與pH值4.0、6.0、8.0時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在pH＞2 時，pH 改變對蒙脫石載藥量的影響較小。在pH=2.0 時蒙脫石載藥量顯著降低，可能是因為在酸性環(huán)境下蒙脫石結(jié)構(gòu)被破壞[14]，或可能與低pH值時溶液中的高濃度氫離子與藥物競爭性吸附有關(guān)[6]。

圖2 pH值對載藥量的影響Figure 2 Effect of pH value on drug loading

2.2.4 介質(zhì)離子濃度對蒙脫石載藥量的影響 通過控制溶液中磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）的濃度，考察離子濃度對蒙脫石載藥量的影響。按照1 mg/mL MMT、3 mg/mL BH的濃度，載藥介質(zhì)為0.05、0.1、0.2、0.3 mol/L 的pH=4 的PBS，在50 ℃水浴條件下載藥，測定不同磷酸鹽濃度條件下的載藥量，結(jié)果見圖3?？梢姡傮w上蒙脫石的載藥量隨著PBS 濃度的增加逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），所以溶液中加入PBS 不利于MMT對BH的吸附。

圖3 介質(zhì)離子濃度對載藥量的影響Figure 3 Effect of ion concentration on drug loading

2.2.5 載藥溫度對蒙脫石載藥量的影響 通過控制載藥的水浴溫度，考察溫度對蒙脫石載藥量的影響。按照1 mg/mL MMT、3 mg/mL BH的濃度，載藥介質(zhì)為去離子水，在0、25、50、70 ℃水浴條件下載藥，測定不同載藥溫度條件下的載藥量，見圖4。可見，總體載藥量均值的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；隨著溫度的升高，蒙脫石的載藥量逐漸降低，所以較高的溫度不利于MMT對BH的裝載。

圖4 載藥溫度對載藥量的影響Figure 4 Effect of temperature on drug loading

對實驗數(shù)據(jù)采用以下Gibbs 方程進行熱力學(xué)分析，結(jié)果見表2：

表2 蒙脫石吸附BH的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of BH adsorbed by montmorillonite

式中：Ke為熱力學(xué)平衡常數(shù)；ρ為水的密度，單位mg/（cm3）；ΔG為吸附劑吸附的吉布斯自由能，單位kJ/mol；ΔH為吸附劑的吸附熵變，單位kJ/（mol·K）；ΔS為吸附熵變，單位kJ/（mol·K）；R 為理想氣體常數(shù)，等于8.314 J/（mol·K）；T為熱力學(xué)溫度，單位K。

可見，ΔG＜0，說明MMT對BH吸附過程屬于自發(fā)性反應(yīng)；ΔH＜0，該過程屬于放熱反應(yīng)，低溫有助于蒙脫石載藥反應(yīng)正向進行；ΔS＞0，說明載藥過程中固液界面的混亂程度增加。

2.3 蒙脫石載藥的吸附機理

為繼續(xù)優(yōu)化BH-MMT的制備條件，進一步研究MMT 對BH 的吸附機理，分別按照以下Langmuir和Freundlich等溫方程進行線性擬合：

式中：Qm為每克蒙脫石吸附藥物的最大量，單位mg/g；a為與蒙脫石吸附性能有關(guān)的Langmuir 常數(shù)，單位L/mg；Kf和b 分別為與吸附容量和吸附強度有關(guān)的Freundlich常數(shù)。

精密配制40 mg/mL MMT，以其為母液分別配制0.5、1、1.5、2、3、5、7、9、15、18、21、24 mg/mL 的BH 溶液，進行水中載藥的吸附實驗，等溫吸附擬合的結(jié)果見圖5 和表3。由擬合計算結(jié)果可見，Langmuir 等溫吸附模型對MMT 吸附BH 的擬合效果更好，R2為0.999 8，F(xiàn)reundlich 等溫吸附模型的R2為0.973 9，擬合度劣于前者，證明MMT 對BH 的吸附符合Langmuir 吸附模型，表明BH 單層吸附于MMT，由Langmuir 吸附模型計算出最大吸附量Qm為441 mg/mL。

圖5 Langmuir等溫吸附模型（A）與Freundlich等溫吸附模型（B）Figure 5 Fittings of Langmuir model（A）and Freundlich model（B）

表3 蒙脫石等溫吸附擬合參數(shù)Table 3 Parameters of the isothermal adsorption models of montmorillonite

蒙脫石載藥符合Langmuir 模型，該模型表明蒙脫石屬于單層吸附，具有一個吸附限度，接近吸附的限度時，即使提高投藥量，蒙脫石的載藥量也不會顯著提高。最終制備的蒙脫石載藥量為（27.52±0.56）%，包封率為（54.26±1.51）%。

2.4 BH-MMT的緩釋性能

考察相同條件下制備的BH-MMT的體外釋放，評價MMT 作為緩釋藥物載體的緩釋性能。釋放介質(zhì)選用人工淚液，配制方法如下：量取1 L 的去離子水，分別加入6.78 g NaCl、1.38 g KCl、2.18 g NaHCO3、0.084 g 二水氯化鈣依次溶解，得到人工淚液。將處理好的透析袋剪成7 cm 的小段，在透析袋中加入50 mg BH-MMT，2 mL 去離子水，兩端用尼龍繩扎緊，放入250 mL燒杯中，加入100 mL人工淚液，34 ℃、120 r/min 氣浴恒溫振蕩，于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10 h，用5 mL移液管取5 mL 釋放介質(zhì)，并補充新鮮的釋放介質(zhì)5 mL。選用相當于BH-MMT 中藥物含量的BH 水溶液為對照，考察透析袋的緩釋效果。通過測定取出的釋放介質(zhì)中的藥物含量Cn，根據(jù)以下公式計算BH 在不同時間點的釋放度W，并繪制釋放曲線：

式中：W為累積釋放度；Cn為第n次取樣時介質(zhì)中的藥物濃度，單位mg/mL；Va為釋放介質(zhì)體積，單位mL；Ci為第i次取樣時介質(zhì)中的藥物濃度，單位mg/mL；Vi為第i次取樣體積，單位mL。圖6 為BH 溶液和BH-MMT 的體外釋放曲線。可見，BH 溶液在3 h達到完全釋放，釋放度達97.87%；BH-MMT在8 h釋放95.25%，藥物均完全釋放。根據(jù)2020 年《中國藥典》規(guī)定，緩釋制劑在前0.5 h 的釋放量應(yīng)小于40%，BH溶液在0.5 h釋放度達46.98%，而BH-MMT的釋放度為35.54%，符合緩釋制劑的要求。MMT作為藥物緩釋載體，可達到良好的緩釋效果。

圖6 BH、BH-MMT的體外釋放Figure 6 In vitro release of BH and BH-MMT

3 討論

離子交換過程是藥物分子競爭性置換離子交換材料上的同號離子，在水溶液中呈陽離子態(tài)的倍他洛爾與MMT 以離子鍵或復(fù)合物形式結(jié)合形成BH-MMT，完成載藥過程；當BH-MMT 遇水或體液時，外界離子（如鈉離子等陽離子）與BH-MMT上的藥物離子發(fā)生競爭性取代，從而釋放藥物。

由于MMT 屬于超細粉體，其在水中分散均勻較為困難，需要采用機械方式促進其均勻分散。本課題組發(fā)現(xiàn)超聲可以有效促進MMT在水中分散，分散均勻后粒徑為441.9 nm，使用細胞粉碎超聲可以將MMT的片層進一步剝離為更小的顆粒284.5 nm。

納米粒徑有利于MMT 單獨或與其他輔料結(jié)合后，作為納米緩釋藥物載體用于制備粒徑較小的納米粒及緩釋微球。超聲細胞粉碎儀處理后，蒙脫石的粒徑最小，但根據(jù)Chen 等[15-16]的研究報道，蒙脫石可通過物理過程自發(fā)分層，在細胞粉碎超聲中MMT 片層被剝離，破碎為更小的粒子，剝離片層的不均勻使其具有較大的PDI。同時，細胞粉碎超聲使蒙脫石微粒具有更低的電位，由于細胞粉碎超聲使蒙脫石產(chǎn)生的新生片層亦呈現(xiàn)出負電性，使系統(tǒng)擁有了更高的負電位，對與同樣荷負電的角膜黏蛋白具有靜電斥力，不利于MMT在眼表的黏附滯留。

磁力攪拌的分散方式耗時較久，細胞粉碎超聲又會使MMT 破碎，本課題組采用磁力攪拌初步分散后水浴超聲的方式促進MMT的分散。

在觀察MMT 在水溶液分散的過程中發(fā)現(xiàn)，由于MMT 顆粒表面帶有強負電荷，彼此靜電排斥，呈懸浮分散狀態(tài)。在加入藥物溶液后，陽離子藥物BH 吸附在MMT 表面，降低微粒表面的負電荷及雙電層厚度，使微粒之間的斥力減小，出現(xiàn)絮狀聚集，該現(xiàn)象有利于蒙脫石載藥后的離心收集。研究pH對MMT載藥量影響的過程中發(fā)現(xiàn)，在pH=4、6、8時對載藥量的影響較小，但當pH 值低至2 時，載藥量顯著降低。相較于MMT 分散在去離子水中形成較為穩(wěn)定的混懸液，MMT 在BH 溶液或酸溶液中會發(fā)生絮凝沉淀。而通過控制溶液中PBS 的濃度，發(fā)現(xiàn)隨著PBS 濃度的增加，蒙脫石的載藥量逐漸降低，本文認為溶液中加入PBS 不利于MMT 對BH 的吸附。因為當載藥體系中存在其他陽離子，可與陽離子藥物BH 發(fā)生競爭性吸附，降低了BH 在MMT 上的載藥量。低pH 值時載藥量的下降，亦可能是因為溶液中的高濃度氫離子與藥物競爭性吸附。因此實驗采用去離子水作為離子交換載藥介質(zhì)。

本文通過研究不同條件對BH-MMT 的載藥量的影響并探究MMT對BH 的吸附機理，據(jù)此優(yōu)化載藥條件后所制得的BH-MMT亞微米藥物緩釋載體，制備方法簡單易行，所需載藥時間短，相比其他納米制劑的制備更便捷。BH-MMT 載藥量較大（27.52±0.56）%，包封率較高（54.26±1.51）%，且可緩釋8 h，說明離子交換載體MMT 對親水性小分子模型藥物BH 具有良好的緩釋效果，有望解決青光眼患者因給藥次數(shù)過多而依從性較差的情況。后續(xù)將使用BH-MMT 制備眼部黏附滯留的離子交換型微球制劑，進一步開展其治療青光眼的毒理、藥效和藥動實驗。