王婧妍,黃彬濤,高大,李慧娉,韓東海

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是最常見的一種侵襲性惡性血液腫瘤,起源于產(chǎn)生血細胞的骨髓細胞異常增殖,盡管AML的治療技術(shù)不斷改進,但隨著疾病的發(fā)展AML細胞迅速進入血液甚至轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)和脾臟、肝臟、腦等人體重要器官,導(dǎo)致預(yù)后不良,長期生存率偏低[1]。微小核糖核酸(microRNAs)和長鏈非編碼核糖核酸(long noncoding RNA,LncRNAs)可影響蛋白質(zhì)合成,調(diào)節(jié)抑癌或致癌基因表達,在AML癌癥生物學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。長鏈非編碼RNA X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄因子(LncRNA XIST)是一種致癌基因,在非小細胞肺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中過表達,促使癌細胞增殖侵襲和對化療耐藥[3-4]。miR-196b也是一種致癌基因,在非小細胞肺癌、卵巢癌等實體腫瘤中高表達,可增強癌細胞的遷移和浸潤,與預(yù)后不良顯著相關(guān)[5-6]?，F(xiàn)分析血清LncRNA XIST、miR-196b表達與AML患者臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系,旨在為臨床病情分析和預(yù)后評估提供參考,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年3月—2020年3月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科收治的AML患者88例為AML組,男59例,女29例;年齡:<50歲55例,≥50歲33例;AML分型:M2、M3 62例,M4、M5 26例;NCCN分級:低中危46例,高危42例;髓外浸潤21例;骨髓原始細胞比≥50% 63例,<50%25例;白細胞計數(shù)≥10×109/L 31例,<10×109/L 57例。另選擇同期于醫(yī)院體檢中心體檢的健康志愿者41例為健康對照組,男23例,女18例,年齡<50歲26例,≥50歲15例。2組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,具有可比性(P>0.05)。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(S.2016029),受試者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分型確診為AML;②臨床資料完整;③定期接受隨訪。(2)排除標準:①其他類型白血病或血液腫瘤,比如急性淋巴細胞白血病、骨髓增生異常綜合征、真性紅細胞增多癥等;②入組前接受抗腫瘤治療;③合并嚴重肝腎功能障礙和心肺疾病;④合并自身免疫性疾病、感染性疾病。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 LncRNA XIST、miR-196b表達檢測:AML患者入組次日(健康對照組體檢當日)采集空腹外周靜脈血3 ml注入干燥試管,取血液凝固后上層液離心,取上層液-80℃保存待檢。取血清樣本采用血液RNA分離試劑盒(美國賽默飛公司)按照說明書提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳選取吸光值260/280在1.8～2.0的總RNA,采用RT-qPCR試劑盒(美國Promega公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-Time qPCR試劑盒(德國QIAGEN公司),7500 實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)定量檢測LncRNA XIST、miR-196b表達。引物序列:LncRNA XIST,正向,5′-AATGACTGCCACTGCTGGG-3′,反向,5′-GTGTAGGTGGTTCCCCAAGG-3′;miR-196b,正向,5′-TAGGTACCACTTTATCCCGTTCACCA-3′,反向,5′-ATCTCGAGGCAGGGAGAGAGGAATAA-3′;U6,正向,5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向,5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件:95℃15 min、94℃15 s、55℃30 s、70℃30 s,共40個循環(huán)。反應(yīng)體系:Power SYBR?Green PCR Master Mix 2.5 μl,cDNA 2 μl(12.5 ng)特異引物,RNase-Free ddH2O 21 μl。以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法檢測LncRNA-XIST、miR-196b相對表達量。

1.3.2 隨訪:AML患者出院后均定期電話隨訪以及門診復(fù)查,第1年每3個月復(fù)查1次,之后每6個月復(fù)查1次,隨訪截至2023年3月。記錄患者生存情況,總生存期(OS)定義為自診斷到因任何原因死亡或最后一次隨訪的時間。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清LncRNA XIST、miR-196b表達比較 AML組血清LncRNA XIST、miR-196b表達高于健康對照組(P<0.01),見表1。

表1 AML組和健康對照組血清LncRNA XIST、miR-196b表達比較

2.2 不同病理特征AML患者血清LncRNA XIST、miR-196b表達比較 NCCN分級高危、髓外浸潤、白細胞計數(shù)≥10×109/L的AML患者血清LncRNA XIST、miR-196b表達高于NCCN分級低中危、無髓外浸潤、白細胞計數(shù)<10×109/L的AML患者(P<0.01),不同性別、年齡、AML分型、骨髓原始細胞比例AML患者血清LncRNA XIST、miR-196b表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 不同病理特征AML患者血清LncRNA XIST、miR-196b表達比較

2.3 LncRNA XIST與miR-196b的相關(guān)性分析 AML患者血清LncRNA XIST與miR-196b表達呈正相關(guān)(r=0.423,P<0.001)。

2.4 不同LncRNA XIST、miR-196b表達AML患者生存分析 中位隨訪51(36～72)個月,隨訪期間死亡55例,存活33例。高LncRNA XIST表達(≥5.23,45例)、高miR-196b表達(≥3.65,46例)AML患者OS率分別為24.44%、28.26%,分別低于低LncRNA XIST表達(<5.23,43例)、低miR-196b表達(<3.65,42例)的51.16%、47.62%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-Rankχ2/P=12.290/<0.001,5.413/0.012),見圖1。

圖1 不同LncRNA XIST、miR-196b表達AML患者生存曲線

2.5 影響AML患者預(yù)后的多因素COX回歸分析 以AML患者預(yù)后為因變量(賦值:0=存活,1=死亡),以上述結(jié)果中P<0.05項目為自變量,進行AML患者預(yù)后的多因素COX回歸分析,結(jié)果顯示:NCCN分級高危、髓外浸潤、白細胞計數(shù)≥10×109/L、高LncRNA XIST表達、高miR-196b表達是影響AML患者預(yù)后不良的危險因素(P<0.01),見表3。

表3 影響AML患者預(yù)后的多因素COX回歸分析

3 討 論

AML是一種遺傳、表觀遺傳和臨床異質(zhì)性疾病,其特征是骨髓和外周血中未成熟髓系細胞的積累和擴增,導(dǎo)致正常造血功能的失敗。AML的發(fā)生與復(fù)雜多變的基因突變有關(guān),使其在分子特征、發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)等方面具有很大的異質(zhì)性[7]。LncRNA是長度超過200個核苷酸且缺乏有意義的開放閱讀框的非編碼RNA,參與基因表達的表觀遺傳調(diào)控,在骨髓細胞分化和成熟中發(fā)揮重要作用,參與正常造血和AML的發(fā)生[8]。miRNAs是一種約有22個核苷酸的小RNA,通過調(diào)控表觀遺傳改變、轉(zhuǎn)錄因子或癌蛋白改變等參與AML的發(fā)病過程[9]。

本研究發(fā)現(xiàn),AML患者血清中LncRNA XIST表達較健康對照組顯著上調(diào),且LncRNA XIST過表達與NCCN分級高危、髓外浸潤、白細胞計數(shù)增加、低生存率有關(guān),可見LncRNA XIST在AML中發(fā)揮促癌基因作用。Wang等[10]也發(fā)現(xiàn)AML骨髓細胞中LncRNA XIST表達上調(diào),沉默LncRNA XIST可抑制細胞活性和對化療耐藥。LncRNA XIST是最早被發(fā)現(xiàn)的LncRNA之一,主要負責X染色體失活,雄性和雌性性染色體之間劑量補償?shù)倪M化過程,LncRNA XIST可招募染色質(zhì)修飾酶參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控,從而導(dǎo)致LncRNA XIST調(diào)控的致癌或抑癌基因的表達發(fā)生變化,參與癌癥發(fā)生過程[11]。研究顯示LncRNA XIST在結(jié)直腸癌、肺癌、口腔癌中表達增高[12-14],下調(diào)LncRNA XIST表達可顯著抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)其凋亡。分析LncRNA XIST參與AML的機制:首先,LncRNA XIST通過靶向抑制其下游基因miR-29a表達上調(diào)髓細胞增生原癌基因,增加AML細胞活力,促進其增殖[14]。其次,組蛋白去乙?；?HDAC1)作為表觀遺傳調(diào)控因子,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,HDAC1表達上調(diào)可導(dǎo)致AML癌細胞侵襲和遷移,LncRNA XIST可通過海綿化miR-34a在AML細胞中上調(diào)HDAC1表達,促使AML細胞增殖[15]。可見LncRNA XIST過表達有助于AML細胞增殖,導(dǎo)致AML病情惡性進展和不良預(yù)后的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn),miR-196b在AML患者中表達上調(diào),miR-196b高表達與NCCN分級高危、髓外浸潤、白細胞計數(shù)增加、低生存率有關(guān),miR-196b高表達可能促使AML惡性進展和預(yù)后不良。Xu等[16]研究也顯示miR-196b過表達與兒童AML總生存率較低之間存在顯著關(guān)聯(lián)。miR-196b屬于miR-196家族,位于染色體7p15.2上,在食管癌、非小細胞肺癌中過表達[17-18],可促進癌細胞增殖、細胞侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并阻斷癌細胞凋亡,導(dǎo)致癌細胞對化療和放療耐藥。分析miR-196b參與AML的機制:首先,CDKN1B(p27kip1)是miR-196b的直接靶點,miR-196b通過靶向抑制p27Kip1的表達減少白血病潛伏期和白血病干細胞數(shù)量增加,拮抗miR-196b活性則增加p27Kip1表達抑制AML細胞增殖和生長[19]。其次,TLR信號通路激活可誘導(dǎo)免疫刺激反應(yīng),抑制造血干細胞的惡性克隆和增殖[20],miR-196b直接靶向TLR先天免疫信號通路及其通路中的細胞因子等抑制TLR信號傳導(dǎo),維持AML細胞未成熟狀態(tài),惡性增殖和存活[21-22]。由此可見miR-196b在AML可能發(fā)揮促癌基因作用,導(dǎo)致AML惡性進展。

在惡性腫瘤發(fā)生和進展過程中,LncRNAs可通過靶向microRNAs調(diào)控抑癌或促癌基因表達,影響細胞增殖和凋亡,本研究相關(guān)性分析表明LncRNA XIST與miR-196b表達呈正相關(guān),研究顯示miR-196b是LncRNA XIST的下游靶點,LncRNA XIST調(diào)控miR-196b的表達[23],因此推測LncRNA XIST與miR-196b之間可能存在相互作用機制,兩者過表達協(xié)同促使AML細胞惡性增殖,導(dǎo)致AML預(yù)后不良的發(fā)生。

綜上,AML患者血清LncRNA XIST、miR-196b表達均增高,高LncRNA XIST、miR-196b表達與AML惡性生物學(xué)行為以及不良預(yù)后的發(fā)生有關(guān)。LncRNA XIST可能通過調(diào)控miR-196b表達促使AML惡性進展。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王婧妍:設(shè)計研究方案、研究流程,數(shù)據(jù)收集,實施研究過程,撰寫論文;黃彬濤:提出研究方向、研究思路、研究選題,分析試驗數(shù)據(jù);高大:提出研究思路,論文審核;李慧娉:數(shù)據(jù)收集,分析整理;韓東海:數(shù)據(jù)收集,修訂論文,論文終審