武蓓琪，路建林，王閃，白志文，汪璐，田應(yīng)剛，王洪新,3*

1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.貴州貴茶（集團）有限公司，貴州 銅仁 554400；3.國家功能食品工程技術(shù)研究中心（江南大學），江蘇 無錫 214122

抹茶是采用覆蓋栽培的茶樹鮮葉經(jīng)蒸汽（或熱風）殺青后、干燥制成的葉片為原料，經(jīng)研磨工藝加工而成的微粉狀茶產(chǎn)品[1]。研究表明抹茶含有茶多酚、兒茶素、維生素[2]、氨基酸[3]、多糖[4]和咖啡堿（CAF）[5]等多種活性成分，具有抗氧化[6]、抗炎[2]、抗癌[7]等功能。從茶葉中提取出的多酚及兒茶素類物質(zhì)表現(xiàn)出突出的抗氧化活性，因為它們能夠中和自由基并提高酶的解毒活性，包括過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶[8]。Grzesik 等[9]發(fā)現(xiàn)兒茶素比維生素C 和類黃酮具有更強的抗氧化能力，證明了它們在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用。CAF 具有較好的抗焦慮功效，通過激活多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)及血清素能系統(tǒng)來實現(xiàn)[4]。多酚物質(zhì)和CAF是影響抹茶滋味和色澤的主要成分，而后者可以和抹茶中的其他物質(zhì)形成絡(luò)合物，表現(xiàn)出一定的鮮爽滋味[10]。抹茶與其他全日照下栽培的茶葉相比，呈苦澀味的兒茶素物質(zhì)較少，而不同含量的兒茶素類物質(zhì)和CAF 可能會造就抹茶不同的口感，使消費者體驗到不同滋味的抹茶產(chǎn)品[11]。

我國抹茶產(chǎn)業(yè)近年發(fā)展迅速，抹茶不僅僅可作為抹茶飲料被消費，更多作為一種天然添加劑被添加到餅干、巧克力、面包等產(chǎn)品中，尤其是貴州抹茶[12]。但是，抹茶原料的質(zhì)量優(yōu)劣很難把控，對銷售和出口產(chǎn)生了不利影響。對抹茶的質(zhì)量檢查，大多數(shù)仍以感官經(jīng)驗為主，現(xiàn)代分析技術(shù)仍未普遍應(yīng)用。因此，迫切需要制定有效、可靠的分析方法和質(zhì)量標準，以科學地評估抹茶及抹茶原料的質(zhì)量來優(yōu)化抹茶生產(chǎn)。

感官評審是一種直接評定抹茶質(zhì)量標準的方法，通過觀察抹茶的外形色澤、顆粒細膩度、內(nèi)在香氣、湯色、滋味來判斷抹茶品質(zhì)。雖然直接簡單，但由于人的主觀性限制，存在滋味的偏好及感覺器官的差異，需要儀器測定分析補充[13]。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)和化學計量學應(yīng)用的不斷進步，指紋圖譜被公認為是一種方便、高效的質(zhì)量檢驗技術(shù)[14]，并且已被應(yīng)用于茶葉領(lǐng)域的品質(zhì)評價和鑒定中。高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）具有分析速度快、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點[15]，已成為構(gòu)建指紋圖譜的首選方法。王麗等[16]采用HPLC建立了普洱茶等不同品種茶葉樣品的指紋圖譜，實現(xiàn)了不同茶葉樣品的準確分類和識別，為茶葉的品種分類和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。劉興勇等[17]應(yīng)用HPLC指紋圖譜結(jié)合聚類分析對不同陳化年限的普洱茶進行分析，實現(xiàn)了對普洱茶的品質(zhì)評價和陳化年份的判別。目前對于抹茶兒茶素類物質(zhì)的指紋圖譜還未見報道。

本研究以16 個貴州抹茶及6 個日本品牌抹茶為對象，通過HPLC 法測定其兒茶素組成和CAF含量，將得到的高分辨率的色譜數(shù)據(jù)經(jīng)專業(yè)軟件處理，用于建立標準指紋圖譜，并根據(jù)共有峰物質(zhì)的相對保留時間和共有峰面積的匹配數(shù)據(jù)進行相似性評估，從而揭示不同抹茶樣品的差異。同時利用化學計量學方法對數(shù)據(jù)進行降維處理，篩選出差異組分，結(jié)合感官評定的結(jié)果，對各種抹茶進行特征區(qū)分和對比評價，為貴州抹茶的質(zhì)量評價及加工提供理論基礎(chǔ)。

1. 材料與方法

1.1 材料

16 個貴州抹茶樣品均來自于貴州貴茶集團，原料品種均為福鼎大白茶，原料產(chǎn)地和遮陰時間見表1。6 個日本抹茶樣品購自日本，生產(chǎn)日期均為2021年6月，產(chǎn)地和品名見表2。

表1 貴州抹茶樣品

表2 日本商品抹茶樣品

1.2 儀器與設(shè)備

AR224CN 分析型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯攪拌水浴鍋，常州賽普試驗儀器廠；XW-80A旋渦混合器，上海馳唐電子有限公司；DL-5-B離心機，上海安亭科學儀器廠；YQ型超聲波清洗機，上海易凈超聲波儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；waters e2695 高效液相色譜儀，美國waters公司。

1.3 試驗試劑

乙腈、甲醇均為色譜級（國藥集團化學試劑有限公司），沒食子酸（GA）標準品（純度＞95%，無錫太陽綠寶科技有限公司），沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、CAF、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）標品（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司），超純水（屈臣氏集團香港有限公司），無水甲醇、冰乙酸均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.4 試驗方法

抹茶中兒茶素類物質(zhì)的含量按照《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018）進行。CAF 的測定按照《茶咖啡堿測定》（GB/T 8312—2013）進行。

1.4.1 供試樣品溶液制備

精確稱取0.2 g 試樣于10 mL 離心管中，加入70%甲醇水溶液5 mL，渦旋30 s，立即移入70 ℃水浴中，浸提10 min（隔5 min渦旋1次），浸提后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入離心機在3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶。殘渣再用5 mL 的70%甲醇水溶液提取1 次，重復以上操作。合并提取液定容至10 mL，吸取1 mL 上清液以0.22 μm 有機濾膜過濾，低溫避光保存?zhèn)溆?，待上機測定。

1.4.2 標準品溶液制備

分別精確稱量GA、 GC、 EGC、 EGCG、ECG、GCG 及CAF 標準品于容量瓶內(nèi)，配制成1 mg/mL的單一標準品儲備溶液，再分別吸取上述溶液1 mL 于容量瓶中并用甲醇定容，得到混合標準品溶液，低溫避光保存?zhèn)溆?，待上機測定。

1.4.3 試劑配置及色譜條件

HPLC測定條件如下：色譜柱采用Zorbax分析型SB-C18色譜柱（150.0 mm ×4.6 mm，5.0 μm），柱溫為25 ℃，流速為0.6 mL/min，進樣量為10 μL，流動相A為2%乙酸，流動相B為100%乙腈，檢測波長為280 nm。洗脫程序見表3。

表3 HPLC法測定洗脫梯度

1.4.4 兒茶素指紋圖譜的構(gòu)建與分析

每個樣品重復測定3次，得到樣品液相色譜圖及相關(guān)數(shù)據(jù)，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件進行處理，生成相應(yīng)的抹茶兒茶素高效液相色譜指紋圖譜。數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理后，進行相似度評價。以共有峰面積作為分析數(shù)據(jù)，導入SPSS 26.0 軟件對樣品進行聚類分析。

1.4.5 主成分分析

利用Graphpad prism 9 軟件進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。將測定數(shù)據(jù)進行標準化處理后提取因子，計算各抹茶樣品理化數(shù)據(jù)的特征值以及方差貢獻率。之后將因子所對應(yīng)的方差貢獻率作為權(quán)重，將因子得分和對應(yīng)的權(quán)重系數(shù)進行加權(quán)求和，得到各個抹茶樣品的綜合得分。

1.4.6 感官審評

根據(jù)《抹茶》（GB/T 34778—2017）中的感官品質(zhì)審評方法進行評定。邀請10 名感官評審員組成專業(yè)評審小組，對22 個抹茶樣品進行外形和內(nèi)質(zhì)評判并打分，去掉1個最高分和1個最低分，其余分數(shù)求平均即為最后得分，評分標準見表4。對外形色澤、顆粒細膩度和開湯后的香氣、湯色和滋味5項因子分別打分，滿分為100分。

表4 抹茶感官品質(zhì)評分標準

2 結(jié)果與分析

2.1 抹茶兒茶素物質(zhì)及CAF含量測定結(jié)果

2.1.1 抹茶樣品及標準品的HPLC色譜圖

取22 個抹茶樣品及混合標品試樣，在1.4.3 條件下測定，平行測定3次，以峰形較好的貴州抹茶1 號樣和日本抹茶19 號樣為例繪圖（圖1），與標準品HPLC色譜圖對照（圖2），日本抹茶和貴州抹茶都檢測出7 個峰，且這7 個峰的出峰順序一致，僅僅是含量有差異。

圖1 貴州抹茶1號樣品（左）與日本抹茶19號樣品（右）HPLC色譜圖

圖2 混合標準品HPLC色譜圖

2.1.2 抹茶樣品測定結(jié)果

根據(jù)1.4.1 中的方法制備樣品溶液，在1.4.3 條件下測定，平行測定3 次，測定22 個抹茶樣品中的兒茶素類物質(zhì)和CAF 的含量（表5）。貴州抹茶樣品總兒茶素含量均顯著高于日本抹茶樣品。貴州抹茶樣品的平均總兒茶素含量為15.71%，明顯高于日本抹茶樣品的平均總兒茶素含量（9.79%）。貴州抹茶樣品的平均CAF 含量4.48%，略低于日本抹茶樣品的平均CAF 含量（4.50%）。這可能與茶樹品種、茶園地理環(huán)境、遮陰條件[12]、抹茶加工過程[18]有關(guān)。CAF的含量與茶葉的成熟度和采摘時間有關(guān)，葉片越老，CAF含量越低[4]。但和其他綠茶對比，抹茶的CAF 含量較高，因此具有獨特的香氣和風味[6]。地理環(huán)境對茶樹的生化品質(zhì)有很大的影響[19]。隨著海拔的升高，綠茶中的茶多酚表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，而CAF 含量呈減少的趨勢[20]。這是因為高海拔茶區(qū)氣溫較低，光照強度相對弱而漫射光增多，不利于CAF 的合成[21]。貴州引種福鼎大白茶作為抹茶原料，同時貴州茶園海拔高、緯度低，茶葉中茶多酚含量相對較高，CAF 含量較低。而日本抹茶原料多為藪北種，且茶樹生長在低海拔、高緯度地區(qū)，茶葉中茶多酚含量較低，CAF含量較高[22]。此外，日本抹茶中的GC 和GCG 的含量相對較低，其中20～22號樣品的含量均為零。這說明日本抹茶在加工中，兒茶素異構(gòu)化和降解較貴州抹茶輕[23]。

表5 22個抹茶樣品中不同兒茶素類物質(zhì)及CAF含量 %

2.2 貴州抹茶HPLC指紋圖譜的構(gòu)建

將16 個貴州抹茶樣品在280 nm 處得到的色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，選擇峰分離度較好、峰面積占比高且穩(wěn)定、相對保留時間居中的11號樣品的色譜圖為參照圖譜，應(yīng)用中位數(shù)法，時間窗寬度為9 s，進行色譜峰匹配，經(jīng)多點校正后生成16個貴州抹茶樣品的兒茶素類物質(zhì)及CAF的HPLC指紋圖譜疊加圖和對照圖譜R（圖3）。

圖3 貴州抹茶指紋圖譜

在貴州抹茶中共檢出14 個峰，與標準品色譜圖（圖2）比對后，在8 個共有峰中確定了5 個成分，1 號峰為GA，2 號峰為EGC，3 號峰為CAF，4 號峰為EGCG，8 號峰為ECG。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對16 個貴州抹茶樣品進行相似度分析，結(jié)果表明，16 個貴州抹茶樣品與標準品色譜圖相似度在0.987～1.000之間，說明指紋圖譜的共有模式可以良好地反映出抹茶提取物的共有特征性成分。同時，相似度較高可以反映出這16 個貴州抹茶的化學成分組成差異小，這是因為16 個抹茶樣品均來自于貴州地區(qū)，該地區(qū)的抹茶原料有較高的相似度，整體質(zhì)量較為穩(wěn)定[26]。其中13、14 和16 號樣品的相似度相對偏低，與其他樣品表現(xiàn)出差異性，這可能是因為這3個樣品屬于單一產(chǎn)地，來自于貴州的銅仁和遵義地區(qū)，遮陰時間均不超過6 d，明顯少于其他樣品。因此，地理環(huán)境和遮陰時間的不同可能是造成抹茶化學成分差異的原因[12,25]。

2.3 貴州抹茶聚類分析

為進一步分析比較16 個貴州抹茶在兒茶素、CAF 含量指標上的異同，選取貴州抹茶指紋圖譜上的5個已知共有峰的峰面積作為聚類變量，以歐式距離作為度量標準，采用組間連接聚類法，對16個抹茶樣品進行聚類分析（圖4）。

圖4 基于貴州抹茶指紋圖譜的聚類分析

結(jié)果表明，這16 個貴州抹茶樣品被分成了3類。13、14 號為第一類；16 號為第二類；1～12、15 號為第三類，該結(jié)果與相似度分析相同。16 號茶葉樣品單獨分為一類，其CAF（5.20%）、EGCG（11.05%）和GCG（0.35%）的含量明顯高于其他貴州抹茶樣品，抹茶原料來自于貴州遵義，遮陰天數(shù)與其他樣品相比明顯較少。而13和14號樣品均來自于貴州銅仁，且遮陰天數(shù)相近，被分為一類。

2.4 貴州與日本抹茶HPLC指紋圖譜的構(gòu)建及對比分析

基于貴州抹茶的聚類分析，從三大類中各挑選出兒茶素類物質(zhì)檢出多且含量高的11、14 和16號樣品作為代表和6種日本抹茶作對比。將9種抹茶樣品的色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，選擇峰分離度較好、峰面積占比高且穩(wěn)定、相對保留時間居中的22 號樣品的色譜圖為參照圖譜，應(yīng)用中位數(shù)法，時間窗寬度為9 s，繪制貴州與日本9種抹茶樣品的兒茶素類物質(zhì)及CAF的HPLC指紋圖譜疊加圖和對照圖譜R（圖5）。

圖5 貴州及日本抹茶指紋圖譜

在日本抹茶樣品中一共檢出13 個峰，與標準品色譜圖（圖2）比對后，在8 個共有峰中確定了5 個成分。圖5 中1 號峰為GA，2 號峰為EGC，4號峰為CAF，5 號峰為EGCG，8 號峰為ECG。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”對9個抹茶樣品進行相似度分析，結(jié)果表明，9個抹茶樣品與標準品色譜圖相似度在0.949～1.000之間。11號樣品和21 號樣品的相似度明顯低，說明貴州抹茶與日本存在明顯差異。

2.5 抹茶樣品感官審評結(jié)果

對22 個抹茶樣品進行感官審評，結(jié)果如表6所示。整體來看，22 個抹茶的感官評分在70～95之間，差距較大，差異的最大來源是湯色和滋味，這與不同抹茶兒茶素組成和CAF 含量差異有關(guān)。貴州抹茶的感官得分平均分為77 分，而日本抹茶的平均得分為94分。貴州抹茶10號、11號的得分高于80 分，各方面的感官得分相對與日本抹茶接近。

結(jié)合表5 和表6 可以看出，日本抹茶的兒茶素含量偏低，而在外形色澤和顆粒細膩度方面得分高于貴州抹茶。一般抹茶的顆粒越細膩，茶粉的顏色更艷綠。這是因為抹茶細胞破碎率增加，內(nèi)部呈色物質(zhì)暴露于茶粉表面，使茶粉綠色占比增加，綠度提升[26]。同時，隨著顆粒細膩度的增加，使得兒茶素類物質(zhì)的氧化加劇，含量減少[27]。

抹茶的香氣主要是在加工過程中形成。通過氨基酸的脫氨作用和脫羧作用轉(zhuǎn)化成芳香物質(zhì)，同時氨基酸還可以與多酚中的兒茶素偶聯(lián)氧化形成香氣物質(zhì)。日本抹茶樣品的香氣得分高于貴州抹茶，可能是因為日本抹茶的顆粒細膩度高，香氣物質(zhì)溶出較多。

茶多酚是抹茶的主要呈味物質(zhì)，抹茶的澀味主要由茶葉中的兒茶素產(chǎn)生，尤其是酯型兒茶素具有較強的澀味和收斂性。如果兒茶素含量過高，會降低抹茶的鮮度和醇度，影響抹茶的滋味[28]。適量的CAF 通過與茶湯中的茶多酚、氨基酸等物質(zhì)反應(yīng)形成絡(luò)合物，增強茶湯的鮮爽滋味[22]。葉綠素是抹茶湯色的主要色素成分，不僅影響抹茶干茶和茶湯的色澤，同時對滋味也有一定影響，此外抹茶的湯色還和茶多酚的含量有關(guān)[29]。感官審評結(jié)果顯示，兒茶素和CAF 含量較低的日本抹茶的湯色和滋味評分較高，貴州抹茶中7號和15 號的兒茶素含量較低，滋味和湯色評分與日本抹茶更接近。

2.6 抹茶主成分分析

主成分分析法（PCA）是通過降維的方法將多個變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個重要綜合變量的多元統(tǒng)計方法，可以去除眾多信息中相互重疊的信息[30]。以22 個抹茶樣品的共有峰峰面積為變量，通過Graphpad prism 9 軟件進行主成分分析，可以將GA、EGC、CAF、EGCG、ECG歸類成PC1、PC2和PC3 3個主成分，得到PCA得分。從圖6可以看出，貴州抹茶與日本抹茶被明顯區(qū)分為兩類，1～16 為貴州抹茶，17～22 為日本抹茶，其中10、14和15號樣品的主成分和日本抹茶比較接近。說明主成分分析可以表征貴州抹茶與日本抹茶的差異，同時前3個主成分可以實現(xiàn)不同抹茶產(chǎn)地區(qū)分。

圖6 22個抹茶PCA得分圖

經(jīng)過PCA標準化數(shù)據(jù)處理后，計算得到主成分特征值、方差貢獻率（表7）和主成分綜合得分等。

表7 22個抹茶樣品主成分分析特征值及方差貢獻率

表7 中主成分分析自動擬合3 個主成分：PC1、PC2 和PC3，特征值均大于1，累積方差貢獻率80.28%，即3 個主成分可以解釋原有變量80.28%的信息，表明可以用這3個主成分代替指紋圖譜共有峰來評價不同批次、不同產(chǎn)地抹茶的質(zhì)量。因此，提取3 個主成分，分別為y1、y2和y3。根據(jù)SPSS 計算得到的成分系數(shù)和表7 中對應(yīng)的主成分特征值計算得到成分矩陣（表8），根據(jù)表8得到y(tǒng)1、y2和y3的回歸方程。

表8 成分矩陣

從表8 可以看出，ECG、EGCG、EGC、GCG和GC 具有較大的正載荷量，所以對PC1 貢獻較大，綜合反映了抹茶的兒茶素含量（y1），其回歸方程為：

對PC2 貢獻較大的是CAF，CAF 是茶湯呈現(xiàn)苦味的主要物質(zhì)[22]，該主成分綜合反映了抹茶的呈味特征（y2），其回歸方程為：

對PC3 貢獻較大的是GA，GA 對CAF 的苦味有增強作用[31]，是對PC2 呈味特征的補充（y3），其回歸方程為：

根據(jù)不同主成分的特征值和方差貢獻率，綜合主成分得分y的計算公式如下：

從22個抹茶樣品綜合得分（表9）可見，日本抹茶樣品品質(zhì)綜合得分優(yōu)于貴州抹茶。貴州抹茶中的11 號和14 號的PC1 得分較高（2.82 和2.59），說明他們的兒茶素含量最高，與實際測定結(jié)果相符；在PC2 的指標中，6 號和16 號樣品位列前茅，說明它們的CAF 含量較高，口感較其他抹茶苦澀味更明顯，與實際測定結(jié)果相符。綜合來看，貴州抹茶中得分最高的是14號樣抹茶，其次是10號和15 號抹茶。雖然14 號的兒茶素含量得分高（2.59），但是CAF 含量得分低（-2.63），所以抹茶口感整體的苦澀味較低，得分較優(yōu)（-0.63）；10 號和15 號抹茶的兒茶素含量均低于貴州抹茶的兒茶素平均含量且CAF 含量也較低，所以苦澀味較輕微，滋味較好，得分優(yōu)（-0.20和-0.12）。

表9 22個抹茶樣品品質(zhì)綜合得分和排名

3 小結(jié)與討論

貴州抹茶樣品的兒茶素含量均高于日本抹茶，滋味評分低于日本抹茶。建立的指紋圖譜確定了5 個共有成分（GA、EGC、CAF、EGCG 和ECG），相似度分析表明貴州的16個抹茶成分相似度較高，而貴州和日本抹茶的相似度相對較低。同時，通過主成分分析，構(gòu)建了主成分PC1、PC2、PC3向量及方差貢獻率的綜合評價模型，貴州10 號、14 號和15 號抹茶得分與日本抹茶接近，貴州6號、11號樣與日本抹茶得分相差較大。兒茶素類物質(zhì)的組成和含量以及CAF 對抹茶的品質(zhì)有著顯著影響。本研究中感官審評結(jié)果和主成分分析結(jié)果存在差異，差異來源于感官審評的主觀因素影響較大，需要和儀器分析相結(jié)合。研究結(jié)果對評價貴州抹茶的質(zhì)量、原料選擇以及完善國內(nèi)抹茶質(zhì)量標準具較好的指導、參考價值。

2023年7月世界主要產(chǎn)茶國家和地區(qū)茶葉產(chǎn)量 t