王叢旭，潘曉藝，周可欣，穆雪嬌，姚嘉赟，藺凌云，趙建華，沈錦玉*

(1.湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313001；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室，浙江 湖州 313001)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)自20世紀(jì)80年代引入中國以后，養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已成為中國第十大淡水養(yǎng)殖魚類[1]。然而，在養(yǎng)殖過程中一些疾病也陸續(xù)出現(xiàn)，其中，大口黑鱸蛙虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus，LMBV)是影響較大的病毒性病害之一。該病毒于1996年被Plumb等[2]分離和鑒定，并被歸為虹彩病毒科，后來經(jīng)過遺傳分析證實該毒株為LMBV[3]。2009年鄧國成等[4]首次報道了由虹彩病毒引起的大口黑鱸潰瘍病，經(jīng)電鏡觀察和序列分析確定為LMBV。雖然LMBV已出現(xiàn)多年，但至今尚無有效的預(yù)防和治療藥物。

疫苗免疫是進(jìn)行病毒性疾病預(yù)防最具性價比的手段之一。LMBV相關(guān)疫苗，如滅活疫苗[5]、核酸疫苗[6]和亞單位疫苗[7]等已開展研究，并表現(xiàn)出了一定的免疫保護(hù)率。Yi等[6]構(gòu)建的基于MCP基因的大口黑鱸DNA疫苗免疫保護(hù)率為63%，Jia等[7]研制的甘露糖修飾MCP亞單位疫苗免疫保護(hù)率達(dá)到78.94%。然而，針對LMBV的弱毒疫苗目前尚未見報道。LMBV的致弱通常以傳代致弱或者毒力基因的敲除為主要手段。通過在培養(yǎng)細(xì)胞中連續(xù)傳代致弱，是進(jìn)行病毒減毒最常見的方法，病毒在培養(yǎng)細(xì)胞的多次傳代過程中，常導(dǎo)致病毒基因中一個或多個突變的積累，從而導(dǎo)致減毒[8]。

病毒傳代致弱已在水產(chǎn)和畜禽弱毒疫苗研究中被廣泛應(yīng)用。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)4個LMBV潛在的毒力基因，即E3、TNFR[9]、ICP18[10]和ICP46[11]，根據(jù)NCBI已公布的蛙虹彩病毒全基因組中毒力基因序列，LMBV ORF046與預(yù)測的E3泛素連接酶(predicted E3 ubiquitin ligase domai，E3)結(jié)構(gòu)域的同源性較高，LMBV ORF057與腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)結(jié)構(gòu)域的同源性較高，LMBV ORF018與蛙虹彩病毒的感染細(xì)胞多肽ICP18(infected cell polypeptides 18)的同源性較高，LMBV ORF087與預(yù)測的感染細(xì)胞多肽ICP46的同源性較高。本研究中，通過對LMBV分離株LMBV-ZJDSS進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，對不同代次的毒株進(jìn)行致病性比較、體外生長特性及組織分布研究，以期為LMBV弱毒疫苗研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康大口黑鱸體質(zhì)量為(14±2)g，取自浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店基地。暫養(yǎng)兩周，水溫為28 ℃，pH為7.65，每日投喂兩次商品鱸飼料，且攝食良好。試驗前隨機(jī)抽取10尾魚檢測其LMBV、傳染性脾腎壞死病毒和彈狀病毒，確保均為陰性。EPC細(xì)胞、大口黑鱸LMBV-ZJDSS毒株由浙江省淡水水產(chǎn)研究所魚病室保存。

新生牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司，M199 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司，青霉素、鏈霉素和 PBS 均購自北京索萊寶科技有限公司，2×Flash Hot Start MasterMix(Dye)購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，2×SuperReal PreMix(Probe)購自天根生化科技(北京)有限公司，磁珠法核酸提取試劑盒(AS214)購自洛陽愛森生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI登錄的LMBV Alleghany 12-343株(GenBank：MK681855.1)的全基因組，設(shè)計擴(kuò)增E3、TNFR、ICP18和ICP46基因的引物(表1)，并由浙江尚亞生物技術(shù)公司合成。

表1 LMBV引物探針序列信息

1.2.2 LMBV-ZJDSS傳代 EPC細(xì)胞采用含10%血清和1%雙抗(均為體積分?jǐn)?shù)，下同)的M199培養(yǎng)基于24 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鋪滿單層后，棄培養(yǎng)液，接入病毒液1 mL，24 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后，吸出病毒液，加入細(xì)胞維持液(含2%血清和1%雙抗的M199培養(yǎng)基)，于24 ℃培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng) (cytopathic effect，CPE)情況，待CPE達(dá)到80%時，收集病毒液，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

進(jìn)行病毒傳代時，將上一代次的病毒液凍融兩次后，4 ℃下以8 000 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm濾器過濾，接種EPC細(xì)胞進(jìn)行病毒培養(yǎng)和傳代，每隔5代保存在液氮中備用，對F5、F35和F65代毒株進(jìn)行特性與毒力測定。

1.2.3 不同代次毒株的生長動力學(xué)曲線 取濃度為108.5TCID50/mL LMBV-ZJDSS的F5、F35和F65代毒株，分別接種于12孔板鋪滿單層的EPC細(xì)胞中，150 μL/孔，24 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，吸出病毒液，接入細(xì)胞維持液(2 mL/孔)。定時用顯微鏡觀察細(xì)胞病變形態(tài)并拍照記錄，分別在1、6、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h取病毒培養(yǎng)上清液，每個時間點取3個平行樣，按照Reed-Muench法計算TCID50，并繪制生長動力學(xué)曲線。

1.2.4 不同代次毒株致病力的測定 取140尾健康大口黑鱸分為7組，包括6個試驗組和1個對照組，每組20尾。6個試驗組分別用3個代次毒株的兩種濃度進(jìn)行攻毒，兩種攻毒濃度分別為108.5、109.5TCID50/mL，攻毒劑量為0.1 mL/尾，對照組注射等量EPC細(xì)胞液，攻毒方式為腹腔注射。攻毒后每日早、晚觀察，共觀察15 d，并記錄大口黑鱸死亡率。

1.2.5 不同代次毒株在大口黑鱸器官組織中的分布 取50尾健康大口黑鱸分為兩組，分別用F5和F65代毒株進(jìn)行攻毒，濃度均為108.5TCID50/mL，攻毒劑量為0.1 mL/尾，且在攻毒后的4、8、12、24、48、72、96、120 h分別取兩個攻毒組魚的肝、脾、腎、鰓、腸、腦和心組織，每個組織大約取50 mg，每次隨機(jī)選取3尾魚，將各個組織加入無菌PBS中進(jìn)行研磨，采用磁珠法核酸提取試劑盒(AS214)提取DNA，測量DNA濃度，并將提取的DNA作為模板，用qPCR方法檢測病毒載量。

1.2.6 LMBV-ZJDSS不同代次全基因組測序 將LMBV-ZJDSS第5代和第65代毒株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集病毒液，凍融3次，以12 000 r/min離心45 min，取上清液，再將病毒液加入50 mL離心管中，離心管中提前加入配制好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的蔗糖溶液5 mL，配平后放入超速冷凍離心機(jī)中，4 ℃下以50 000 r/min離心3 h。離心完成后立即取出離心管，棄上清液，用150 μL無菌PBS沖洗管壁，懸浮病毒液，提取病毒DNA，送浙江尚亞生物技術(shù)公司進(jìn)行二代測序，并分析不同代次毒株基因組的差異性。

1.2.7 不同地區(qū)毒力基因序列分析 篩選4個蛙虹彩病毒毒力相關(guān)基因(E3、TNFR、ICP18和ICP46)，其中，ly20912-14、ly20918-23、ly20918-25和ly20918-15為本實驗室分離并保存，Pine 14-204(登錄號：MK681856)、Alleghany 12-343(登錄號：MK681856)和NH-1609(登錄號：MG941005)序列參考NCBI數(shù)據(jù)庫(表2)，通過設(shè)計引物(表1)，對來自不同地區(qū)的臨床LMBV陽性樣品進(jìn)行4個基因的擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，52 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸100 s，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min。 PCR產(chǎn)物送浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，并對4個毒力基因編碼蛋白采用MAGA 11軟件進(jìn)行比對分析。

表2 不同代次基因組差異Tab.2 Genomic differences among different generations

表2 蛙虹彩病毒毒株樣品編號及來源Tab.2 Sample numbering and origin of LMBV

2 結(jié)果與分析

2.1 不同代次毒株致細(xì)胞病變能力比較

將LMBV-ZJDSS毒株在EPC細(xì)胞中進(jìn)行傳代，圖1為F5、F35和F65代毒株接種EPC細(xì)胞后在48 h產(chǎn)生的CPE特征，隨著傳代次數(shù)的增加，出現(xiàn)CPE的時間變短。這表明，LMBV-ZJDSS毒株在相同病毒滴度下，F(xiàn)65和F35代毒株比F5代毒株表現(xiàn)出更強(qiáng)的致細(xì)胞病變能力。

圖1 不同代次毒株感染48 h后細(xì)胞的病變差異Fig.1 Difference in cytopathic effect caused by different generations of virus strains for 48 h infection in vitro

2.2 不同代次毒株的生長動力學(xué)曲線

通過病毒的復(fù)制動力學(xué)曲線來比較不同代次LMBV的增值特性。從圖2可見：3個代次毒株的復(fù)制趨勢基本一致；3個代次毒株均在48～72 h時達(dá)到病毒最高滴度，其中，F(xiàn)5代毒株在72 h時達(dá)到最高滴度，為109.5TCID50/mL，F(xiàn)35代和F65代均在36～72 h時達(dá)到最高滴度(分別為109.6、109.8TCID50/mL)；在病毒培養(yǎng)過程中，F(xiàn)5代在24 h時病毒滴度超過了F35和F65代，但在48 h時病毒滴度卻低于F35和F65代。

圖2 不同代次毒株的體外生長特性Fig.2 Growth curves of different generations of virus strains in vitro

2.3 不同代次毒株對大口黑鱸的致病力比較

從圖3可見：在相同攻毒濃度下，高代次毒株表現(xiàn)出更低的毒力；當(dāng)F5、F35和F65代毒株攻毒濃度為108.5TCID50/mL時，攻毒后15 d內(nèi)，大口黑鱸死亡率分別為60%、25%和5%，而當(dāng)F5、F35和F65攻毒濃度為109.5TCID50/mL時，大口黑鱸死亡率分別為90%、70%和10%。這表明，LMBV病毒傳代可引起病毒對宿主致病力的減弱。

圖3 不同代次毒株的致病性比較Fig.3 Comparison of pathogenicity among different generations of virus strains

2.4 不同代次毒株在大口黑鱸器官組織中的分布

F5和F65代毒株均以108.5TCID50/mL濃度感染大口黑鱸后，對不同感染時間不同組織中的病毒含量進(jìn)行測定(圖4(a)～(g))，結(jié)果顯示，F(xiàn)5代毒株在感染大口黑鱸后4 h時就可在各臟器中被檢出，而F65代毒株在感染后8 h時才被檢出，表明F5代毒株在體內(nèi)復(fù)制更為迅速。

大口黑鱸被感染后不同組織中，F(xiàn)5代毒株在24～48 h時達(dá)到最高病毒載量，而F65代毒株在72～96 h時出現(xiàn)病毒載量峰值，F(xiàn)5代和F65代病毒載量最高的組織均為腸道組織，病毒載量分別達(dá)到105.6copies/ng和106.3copies/ng；兩個代次毒株載量在達(dá)到最高值后均開始下降(圖4(h))。

2.5 LMBV-ZJDSS不同代次基因組差異分析

采用二代測序技術(shù)進(jìn)行病毒文庫序列測定，通過ORF預(yù)測與篩選，共獲得85個編碼框。F65相對于F5代毒株，變異點有8處，其中有3處可以引起氨基酸的改變，2處在ORF 069R區(qū)域，氨基酸由亮氨酸變?yōu)榧琢虬彼?，其編碼的蛋白為神經(jīng)絲三聯(lián)體h1樣蛋白(neurofilament triplet h1-like protein)；1處在ORF 102L區(qū)域，第37位氨基酸由天冬氨酸變?yōu)槔野彼幔渚幋a的蛋白為感染細(xì)胞多肽ICP46(表2)。

2.6 不同地區(qū)毒力基因的序列分析

通過對不同地區(qū)的7個LMBV陽性組織樣品進(jìn)行4個毒力基因的擴(kuò)增與測序，結(jié)果表明，E3基因編碼區(qū)在所有臨床毒株中序列完全相同(圖5(a))，與LMBV中國鱖分離株NH-1609(MG941005)完全一致，與LMBV美國分離株P(guān)ine 14-204(MK681856)和Alleghany 12-343(MK681856)僅相差一個堿基。

圖5 E3、TNFR和ICP18氨基酸序列的比對Fig.5 Amino acid sequence alignment of E3，TNFR and ICP18

ICP18基因編碼區(qū)序列比較發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)的毒株序列完全一致(圖5(b))，與美國株P(guān)ine 14-204株和Alleghany 12-343株相比，有7個位點的差異，其中2個位點是非同義變異，出現(xiàn)在第84位和103位，國內(nèi)流行株分別為丙氨酸和亮氨酸，美國株為蘇氨酸和苯丙氨酸。而ICP46基因編碼區(qū)國內(nèi)外的毒株序列完全相同(氨基酸序列圖略)。

TNFR基因編碼區(qū)表現(xiàn)出了較多的變異位點(圖5(c))，共有13個變異位點，13處變異位點均出現(xiàn)在不同的中國分離株中，其中，5處為同義變異，8處變異可引起氨基酸的改變，NH-1609株第168、180、184、188、199、220、222和232位氨基酸分別為絲氨酸、蘇氨酸、蘇氨酸、組氨酸、組氨酸、絲氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，ly20912-14株第178、180、184、188、199、220、222和232位氨基酸分別為苯丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、脯氨酸、亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸，ly20918-23株第168、180、184、222和232位氨基酸分別為苯丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸，ly20918-15株和ly20918-25株第222和232位氨基酸分別為脯氨酸和苯丙氨酸。

3 討論

3.1 病毒在體外的連續(xù)傳代

蛙病毒是屬于虹彩病毒科的一種DNA病毒，虹彩病毒科包括7個屬，分別為蛙病毒屬(Ranavirus)、細(xì)胞腫大病毒屬(Megalocytivirus)、淋巴囊腫病毒屬 (Lymphocystivirus)、水蚤虹彩病毒屬(Daphniairidovirus)、虹彩病毒屬(Iridovirus)和綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)，以及近年發(fā)現(xiàn)的十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)[12]。蛙虹彩病毒的感染范圍非常廣泛，可以感染魚類，如鱸和褐籃子魚[13]，還可以感染兩棲類，如蠑螈和牛蛙。其中，LMBV自2009年在國內(nèi)首次出現(xiàn)之后，在國內(nèi)各地均有發(fā)現(xiàn)，對養(yǎng)殖戶造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。本實驗室分離了一株LMBV，將該毒株在EPC細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代致弱，目前已經(jīng)傳到第65代，并將其與第5代和第35代毒株進(jìn)行體外生長特性比較，結(jié)果表明，在連續(xù)傳代的過程中，增加了病毒的細(xì)胞適應(yīng)性，導(dǎo)致細(xì)胞病變的速度變快，當(dāng)病毒培養(yǎng)液達(dá)到最高病毒滴度時，被感染細(xì)胞釋放到上清液中的病毒粒子與上清液中失活的病毒粒子數(shù)量達(dá)到平衡，上清液中具有感染性病毒的數(shù)量達(dá)到最高值，此刻為最佳收獲病毒時間，而不同代次病毒的最高滴度并不會出現(xiàn)較大差異。本試驗中，通過腹腔注射的方式用3個代次的毒株感染大口黑鱸，每個代次分為兩個攻毒濃度，對其感染的大口黑鱸進(jìn)行為期15 d的觀察，發(fā)現(xiàn)F65代毒株感染的大口黑鱸死亡率要低于F5和F35代，這說明在連續(xù)傳代過程中，病毒的毒力有所減弱，也為病毒的減毒活疫苗開發(fā)提供了有益參考。

3.2 LMBV在大口黑鱸各器官組織中的分布

為比較LMBV不同代次毒株的感染性，筆者在對大口黑鱸攻毒試驗過程中，通過熒光定量檢測出LMBV在大口黑鱸各個器官組織中均存在，其中，腸的病毒載量最高，肝臟和脾臟的病毒載量也較高。F5代毒株攻毒后，在48 h內(nèi)各組織中病毒載量達(dá)到高峰期，之后病毒載量逐漸降低，而F65代毒株攻毒后，在96 h內(nèi)各組織中病毒載量達(dá)到高峰期。楊展展等[14]對LMBV在大口黑鱸體內(nèi)的動態(tài)分布研究表明，心臟在攻毒后4 h檢測出病毒，而腸、腦和鰓在攻毒24 h后才檢測出病毒，心臟的病毒載量最高。此結(jié)果與本試驗結(jié)果存在一定的差異，可能與攻毒時魚體大小、病毒的濃度及攻毒劑量有關(guān)。劉丹等[15]對大鯢蛙病毒(CGSRV)在體內(nèi)組織分布的研究表明，在各個組織中均能檢測到病毒，其中，肝臟中的病毒載量最高。彭超等[16]運(yùn)用原位雜交和熒光定量方法，對人工感染蛙病毒(FV3)后鞍帶石斑魚體內(nèi)不同組織中的分布進(jìn)行分析，原位雜交結(jié)果表明，脾臟和肝臟都有信號，而腦組織中無信號；熒光定量結(jié)果表明，脾臟、腎臟和心臟的病毒載量最多。Cunningham等[17]研究表明，林蛙感染FV3后，肝臟和腎臟中的病毒載量較高。綜上所述，蛙病毒的感染性較強(qiáng)，可以侵染到宿主的各個器官組織且感染范圍廣，對很多物種都具有感染性。同時，通過病毒的連續(xù)傳代，病毒侵染大口黑鱸的速度逐漸變慢。

3.3 不同代次毒力基因差異比較

為比較不同地區(qū)LMBV毒力基因的差異及其遺傳穩(wěn)定性，本研究中，對不同地區(qū)毒力基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，E3與NCBI上的中國株序列一致，與美國株僅有一個堿基差異；ICP18與美國株相比，僅有2處變異；TNFR與美國株相比，有1處變異點，但在國內(nèi)株之間出現(xiàn)了8個變異點；ICP46與國內(nèi)外毒株則無任何變異點。TNFR變異點較多的原因，可能是病毒宿主所處的地域不同所致，E3與ICP18出現(xiàn)的變異點可能是國內(nèi)外毒株的差異[18]。至于變異點突變前后的氨基酸，表達(dá)出的蛋白質(zhì)功能是否相同，還有待進(jìn)一步研究。TNFR樣病毒因子在淋巴囊腫病毒中被認(rèn)為是一種病毒感受器，其可以與魚類細(xì)胞因子TNF結(jié)合，并中和其作用[19]。ICP18與ICP46是虹彩病毒科蛙病毒屬的核心基因之一，都屬于立即早期基因(immediate early gene，IE)，IE基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的病毒蛋白對病毒復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)程具有重要影響[20]。本研究中，對不同代次毒株全基因組序列分析結(jié)果表明，F(xiàn)65代毒株與F35代毒株相比，編碼ICP46的一個氨基酸發(fā)生突變，此突變可能導(dǎo)致ICP46的功能發(fā)生改變，使毒株毒力減弱。夏立群等[21]對SGIV ICP46中一段富含亮氨酸的潛在核輸出信號進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NES對ICP46輸出細(xì)胞核具有決定性作用。隨著對LMBV的不斷研究，也發(fā)現(xiàn)了一些新的問題，毒力減弱后的毒株是否還保留免疫原性，是否可以作為減毒活疫苗候選毒株，本研究中選擇的4個毒力基因是否為LMBV的必需毒力基因，這些問題將在后續(xù)試驗中進(jìn)行驗證。

4 結(jié)論

1)通過對LMBV的連續(xù)傳代，并將不同代次毒株進(jìn)行體外生長特性、致病性、感染大口黑鱸后病毒在組織內(nèi)的載量變化及全基因組測序分析，表明隨著病毒代次的增高，病毒的毒力下降，致病性降低，病毒載量在組織內(nèi)達(dá)到峰值的時間變慢。

2)通過對LMBV傳代致弱進(jìn)行研究，表明高代次基因組氨基酸的改變可能是毒株毒力下降的原因，而不同地區(qū)毒株毒力基因的差異主要集中在TNFR基因上。