王玲玲，侯天牧，李華明，項(xiàng)維，袁漢文，雷連成，4，張付賢*

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023；2.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434023；3.澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 荊州 434023；4.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)隸屬于弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，在水體、人類糞便、空氣和土壤環(huán)境中廣泛存在，該菌可引起人類出血病、介水傳染病、腹瀉、繼發(fā)感染和食物中毒等疾病，在公共衛(wèi)生中占有舉足輕重的地位[1]。嗜水氣單胞菌作為一種重要的人-畜-魚(yú)共患病病原，在魚(yú)類中除感染鯉科外，還可感染大鯢、烏鱧等，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害最大、最普遍的一類病原菌[2]。研究證實(shí)，嗜水氣單胞菌的致病力與其攜帶的毒力因子密切相關(guān)，其含有的相應(yīng)毒力基因的數(shù)量和類型可作為預(yù)測(cè)分離株致病性及判定其毒力強(qiáng)弱的重要依據(jù)。這些編碼毒力因子的基因已被廣泛應(yīng)用于從環(huán)境、食品、魚(yú)類和人類臨床樣本中分離的氣單胞菌潛在致病性檢測(cè)[3]。因此，研究嗜水氣單胞菌的流行性、致病性和耐藥性，探尋對(duì)該菌有效的治療方法對(duì)于嗜水氣單胞菌感染的防控和公共衛(wèi)生安全十分必要。

青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)雅羅魚(yú)亞科(Leuciscinae)青魚(yú)屬(Mylopharyngodon)，是中國(guó)傳統(tǒng)的四大淡水養(yǎng)殖魚(yú)類之一，主要分布在長(zhǎng)江以南的濱江區(qū)域，是湖泊和池塘中的主要養(yǎng)殖對(duì)象和重要水產(chǎn)品資源，也是中國(guó)淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)種類。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度的增加，青魚(yú)受大量病原微生物的影響，除病毒性病原外，嗜水氣單胞菌[4]、類志賀鄰單胞菌[5]、非霍亂弧菌[6]和熒光假單胞菌[7]等細(xì)菌性病害也在一定程度上嚴(yán)重危害青魚(yú)養(yǎng)殖，尤其是嗜水氣單胞菌會(huì)引起腸道出血和細(xì)菌性敗血癥，其危害大、波及范圍廣且致病性強(qiáng)，對(duì)青魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2021年8月，湖北省荊州市某養(yǎng)殖場(chǎng)的青魚(yú)在高溫條件下出現(xiàn)連續(xù)死亡情況，患病青魚(yú)主要的臨床癥狀表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、攝食減退、鰓絲有淤血、腹下體表彌漫性出血和肛門(mén)紅腫；解剖發(fā)現(xiàn)，患病魚(yú)腹腔有積液，臟器彌漫性出血，肝臟和脾臟腫大，腸道有出血現(xiàn)象，初步診斷為細(xì)菌性出血病。本研究中，以自然發(fā)病的青魚(yú)為試驗(yàn)材料，通過(guò)采集患病青魚(yú)病變組織進(jìn)行病原的分離和鑒定，分離純化得到一株優(yōu)勢(shì)菌QAB5，綜合其形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA測(cè)序，鑒定其為氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌，并通過(guò)對(duì)分離菌株進(jìn)行多序列位點(diǎn)分型、胞外酶活性和毒力基因檢測(cè)、人工感染試驗(yàn)、生物被膜形成能力測(cè)定和藥敏試驗(yàn)等，研究了該菌的致病機(jī)制，以期為嗜水氣單胞菌引起的出血病的有效預(yù)防和精準(zhǔn)治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

自然患病青魚(yú)樣品由湖北省荊州市某養(yǎng)殖場(chǎng)提供，病魚(yú)體質(zhì)量為1.0～1.5 kg。健康青魚(yú)體質(zhì)量10 g左右，經(jīng)7 d暫養(yǎng)觀察，對(duì)其進(jìn)行特定病原體檢測(cè)，選取不攜帶特定病毒和致病菌的健康青魚(yú)用于人工感染試驗(yàn)。

革蘭氏染色劑、瓊脂均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；藥敏紙片、細(xì)菌微量生化管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；2×PCR Mix酶、DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、病毒DNA/RNA基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物合成及測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 檢查記錄患病青魚(yú)的外觀癥狀，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇擦拭病魚(yú)體表后，無(wú)菌條件下解剖，取其病變組織腎、腸、肝、鰓和脾。經(jīng)無(wú)菌水沖洗、研磨后，在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，28 ℃下倒置培養(yǎng)18 h；挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形態(tài)特征，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原檢測(cè) 取患病青魚(yú)病變的腎、腸、肝、鰓和脾組織(約200 mg)，置入無(wú)酶的1.5 mL EP管中進(jìn)行研磨，使用病毒DNA/RNA基因組提取試劑盒提取基因組，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為病毒檢測(cè)的模板，以恒溫培養(yǎng)18 h后長(zhǎng)出的單菌落作為PCR檢測(cè)細(xì)菌的模板?；谑人畾鈫伟?登錄號(hào)：NZ.CP050851.1)的OmpA基因設(shè)計(jì)合成特異性引物，遲緩愛(ài)德華氏菌、類志賀鄰單胞菌和草魚(yú)呼腸孤病毒等病原的引物序列參考文獻(xiàn)[8-14]合成(表1)，使用相應(yīng)的體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表 1 病原檢測(cè)引物信息Tab.1 Primer information for pathogen detection

1.2.3 分離菌株QAB5的鑒定 從劃線的平板上分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為QAB5，對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢；使用細(xì)菌微量生理生化鑒定管，參照生理生化試劑盒說(shuō)明書(shū)分析分離菌株的生理生化特性；以提取的菌株QAB5基因組作為模板，采用通用引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1 492R：GGTTACCTTGTTACGACTT擴(kuò)增其16S rRNA片段。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：模板1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)；最后在 72 ℃下再延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析；選取弧菌科同源性較高的不同種屬，利用MEGA 11軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。綜合菌落特征、生理生化特性和分子進(jìn)化關(guān)系判定分離菌株QAB5的種屬關(guān)系。

1.2.4 多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增A.hydrophila的6個(gè)管家基因gltA(MH697729)、groL(MH697730)、gyrB(MH697731)、metG(MH697732)、ppsA(MH697733)和recA(MH697734)，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序[15]。將所得序列上傳至PubMLST(https：//pubmlst.org/aeromonas/)進(jìn)行比對(duì)，從而得到每個(gè)管家基因的等位基因型，按順序獲得相應(yīng)的ST型。

1.2.5 菌株QAB5致病性分析

1)溶血活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性檢測(cè)。制備濃度為1.5×108CFU/mL的菌液作為試驗(yàn)菌液，分別取1 μL試驗(yàn)菌液點(diǎn)種在含5%綿羊血平板、含1%脫脂牛奶的TSA平板和含1%(均為體積分?jǐn)?shù))吐溫-80的TSA平板，并設(shè)置3個(gè)平行，28 ℃下靜置培養(yǎng)36 h后，測(cè)定溶血圈、蛋白質(zhì)和脂肪水解圈的直徑[16]。

2)毒力基因檢測(cè)。選取嗜水氣單胞菌6個(gè)毒力基因，即溶血素(hemolysin，hly)、氣溶素(aerolysin，aer)、細(xì)胞興奮性腸毒素(heat-labile enterotoxin，alt)、熱穩(wěn)定性腸毒素(heat-stable enterotoxin，ast)、細(xì)胞毒性腸毒素(cytotoxic enterotoxin，act)和絲氨酸蛋白酶(serine protease，ahp)合成特異性引物[17](表2)，通過(guò)PCR檢測(cè)分離菌株的毒力基因。

表2 嗜水氣單胞菌毒力基因引物序列

3)人工感染試驗(yàn)?；罨辏羧尉浣臃N到LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 h，以4 000g離心5 min后收集菌體，用無(wú)菌PBS洗滌3次，再用PBS重懸菌體。試驗(yàn)用健康青魚(yú)經(jīng)特定病原檢測(cè)為陰性后，隨機(jī)分為6組，其中包括3.5×104、3.5×105、3.5×106、3.5×107、3.5×108CFU/mL 5個(gè)試驗(yàn)組，每組20尾，每尾注射0.1 mL菌懸液，以接種無(wú)菌PBS的青魚(yú)作為對(duì)照組。連續(xù)觀察7 d，記錄試驗(yàn)青魚(yú)感染后的發(fā)病癥狀與死亡情況；根據(jù)改良的寇氏法計(jì)算其半致死濃度(LD50)，并對(duì)發(fā)病死亡的試驗(yàn)青魚(yú)進(jìn)行病原菌的再次分離和鑒定。

1.2.6 生物被膜形成能力測(cè)定 取菌株QAB5處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期的菌液，在96孔微量滴定板上加入100 μL的LB肉湯和1 μL的菌液，以未接種菌液的空白培養(yǎng)基孔作為對(duì)照，各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。28 ℃下孵育8～10 h，移除細(xì)菌后加入200 μL的甲醇分析純固定25 min；用無(wú)菌PBS洗凈晾干后，加入125 μL體積分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫染色10 min，再用PBS洗凈晾干后，加入150 μL冰醋酸作用10 min；550 nm下測(cè)定OD值，判定其生物被膜形成能力。判定標(biāo)準(zhǔn)[18]：若OD≤OD空白時(shí)，表明測(cè)試菌株無(wú)生物被膜形成能力；若OD空白4OD空白時(shí)，表明生物被膜形成能力較強(qiáng)。

1.2.7 藥敏試驗(yàn)

1)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。用無(wú)菌棉簽蘸取菌液，均勻涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基上，采用Kirb-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法，將19種抗生素紙片貼在培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)18 h后，測(cè)量藥敏片的抑菌圈直徑(mm)，參照藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)判定菌株QAB5的耐藥性。

2)中藥敏感性試驗(yàn)。依據(jù)前人有關(guān)中藥單方對(duì)嗜水單胞菌的抑制試驗(yàn)，選取黃芩、蘇子、獨(dú)活、款冬花、桑皮、川貝母、天竹黃、大黃、荊芥、半夏、黃連、白僵蠶、白附子、茯苓、羌活、桔梗、雄黃、朱砂、枳殼、連翹、板藍(lán)根、魚(yú)腥草、全蝎、野菊花、薄荷、五味子、金銀花、五倍子、秦皮、首烏藤、丁香、蒲公英、桑白皮、地榆、檳榔、大青葉、羅漢果、三七和烏梅39種中藥材，分別取1 g藥材，加入100 mL蒸餾水煎煮，過(guò)濾后取上清液濃縮至1 mL。將藥液高壓滅菌后，置于4 ℃下保存。使用無(wú)菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在LB平板上，培養(yǎng)基上放置4個(gè)牛津杯，其中1個(gè)孔加入100 μL的無(wú)菌水作為空白對(duì)照，其余3個(gè)孔加入100 μL制備好的中藥藥液，于28 ℃下培養(yǎng)16 h，測(cè)量每種中藥的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)病青魚(yú)臨床癥狀

自然發(fā)病青魚(yú)表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍，攝食減少，腹下體表彌漫性出血，伴有腹水等癥狀，尾部肌肉潰瘍(圖1A)，鰓蓋充血(圖1B)，眼球突出、充血(圖1C)，肛門(mén)紅腫(圖1D)。解剖可見(jiàn)，臟器彌漫性出血(圖2A)，鰓絲有淤血(圖2B)，肝臟腫大、出血(圖2C)，腸道有出血現(xiàn)象(圖2D)。

A—尾部潰瘍；B—鰓蓋充血；C—眼球出血；D—腹部充血、肛門(mén)紅腫。A—tail ulcer；B—congestion in operculum；C—hemophchalmos；D—abdominal congestion and anal redness.圖1 自然發(fā)病青魚(yú)的臨床病癥Fig.1 Clinical symptoms of naturally diseased Mylopharyngodon piceus

A—腹部臟器出血；B—鰓絲淤血；C—肝臟出血；D—腸道出血。A—abdominal visceral hemorrhage；B—gill filament congestion；C—liver bleeding；D—intestinal bleeding.圖2 自然發(fā)病青魚(yú)解剖圖Fig.2 Necropsy lesions of naturally diseased Mylopharyngodon piceus

2.2 特定病原檢測(cè)

從圖3可見(jiàn)，用嗜水氣單胞菌的引物擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小相符合的特異性條帶，大小為202 bp，其余細(xì)菌和病毒引物均未擴(kuò)增出特異性條帶，初步表明患病青魚(yú)疑似為嗜水氣單胞菌感染。

M—DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2～9—陰性對(duì)照；11～16—陽(yáng)性對(duì)照；18～25—樣品；2、11、18—Ah；3、12、19—PS；4、13、20—Et；5、21—VP；6、22—Ei；7、14、23—GBS；8、15、24—GCRV；9、16、25—CyHV。M—DNA marker；2-9—negative controls；11-16—positive controls；18-25—test samples.2，11 and 18—Ah；3，12 and 19—PS；4，13 and 20—Et；5 and 21—VP；6 and 22—Ei；7，14 and 23—GBS；8，15 and 24—GCRV；9，16 and 25—CyHV.圖3 病原的PCR鑒定Fig.3 Identification of the pathogens by PCR

2.3 嗜水氣單胞菌的分離鑒定

2.3.1 嗜水氣單胞菌在器官組織中的分布 從圖4(a)可見(jiàn)，在患病魚(yú)的腸、鰓和肝中均能擴(kuò)增出嗜水氣單胞菌的特異性條帶，腎和脾組織中未檢出，表明嗜水氣單胞菌存在于患病青魚(yú)的腸道、鰓和肝臟組織中，具有一定的嗜性。

2.3.2 形態(tài)觀察及生理生化鑒定 菌株QAB5在LB瓊脂平板上可形成邊緣光滑、中央凸起和肉色有光澤的圓形菌落(圖4(b))；革蘭氏染色顯示，其為陰性桿菌，兩端鈍圓，有的聚集成鏈狀，符合嗜水氣單胞菌的形態(tài)特征(圖4(c))。

生理生化鑒定結(jié)果顯示，菌株QAB5氧化酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，能發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、七葉苷和蔗糖等，硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽(yáng)性，不發(fā)酵肌醇，能夠使明膠液化(表3)，與《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中嗜水氣單胞菌的生化特性一致。

表3 分離株QAB5的生理生化特征

2.3.3 16S rRNA序列鑒定 利用通用引物擴(kuò)增分離菌株QAB5的16S rRNA片段，大小約為1 443 bp(圖4(d))。將該菌株的16S RNA測(cè)序結(jié)果與GenBank中細(xì)菌的16S rRNA進(jìn)行同源序列比對(duì)，結(jié)果顯示，菌株QAB5與嗜水氣單胞菌 (GenBank登錄號(hào)：JN400042.1)基因序列的一致性為99.71%。

選擇同源性較高的不同種屬構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，菌株QAB5與嗜水氣單胞菌的親緣關(guān)系最近，與氣單胞菌屬的親緣關(guān)系較近，與鄰單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬和弧菌屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。綜合生理生化特性和分子鑒定結(jié)果，確定分離菌株QAB5為嗜水氣單胞菌。

圖5 基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on 16S rRNA sequences

2.4 MLST分析結(jié)果

擴(kuò)增分離菌株QAB5的管家基因(gyrB、groL、gltA、metG、ppsA和recA)，并將序列上傳至PubMLST，與數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，菌株QAB5為嗜水氣單胞菌ST251型菌株(表4)，與中國(guó)流行強(qiáng)毒株J-1和NJ-35同屬一種等位基因型菌株。

表4 分離株QAB5的MLST分型Tab.4 MLST typing of strain QAB5

2.5 菌株QAB5致病性分析結(jié)果

2.5.1 溶血活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性 菌株QAB5在3種平板上28 ℃下培養(yǎng)36 h后，分別出現(xiàn)明顯的溶血圈、蛋白圈和脂肪水解圈(圖6)，直徑分別為0.75、2.30、1.30 cm，表明分離菌株QAB5具有溶血活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性。

圖6 分離株QAB5毒力因子表型特征Fig.6 Phenotypic characteristics of virulence factors for strain QAB5

2.5.2 毒力基因檢測(cè) PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，菌株QAB5攜帶aer、ahp、hly、ast、alt和act6種毒力基因(圖7)，其毒力基因型為aer+hly+ahp+ast+alt+act+。

Y—陰性對(duì)照；Ah—嗜水氣單胞菌特異性引物。Y—negative control；Ah—specific primer of Aeromonas hydrophila.圖7 毒力基因檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Results of virulence gene testing

2.5.3 人工感染試驗(yàn) 用分離菌株QAB5人工感染健康青魚(yú)，最高菌液濃度組(3.5×108CFU/mL)的青魚(yú)在腹腔注射后4 h開(kāi)始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、攝食減少的現(xiàn)象，在感染后8 h出現(xiàn)暴發(fā)性死亡現(xiàn)象，并在2 d內(nèi)全部死亡；最低菌液濃度組(3.5×104CFU/mL)和PBS對(duì)照組青魚(yú)在整個(gè)試驗(yàn)期間均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；隨著攻毒菌液濃度的增加，試驗(yàn)青魚(yú)的死亡率逐漸上升(圖8)。

圖8 青魚(yú)感染菌株QAB5后生存曲線Fig.8 Survival curve of Mylopharyngdon piceus challenged with strain QAB5 infection

分離菌株QAB5感染的患病青魚(yú)出現(xiàn)體表和腸道出血等與自然發(fā)病青魚(yú)類似的臨床癥狀，試驗(yàn)組死亡青魚(yú)臟器中均能檢測(cè)和分離到嗜水氣單胞菌，分離菌株的形態(tài)、生理生化特征和測(cè)序結(jié)果與菌株QAB5一致。計(jì)算得到QAB5的LD50為4.4×106CFU/mL，具有高致病性。這表明，嗜水氣單胞菌QAB5為高致病性的強(qiáng)毒株，確定其為此次青魚(yú)出血病的致病病原。

2.6 生物被膜形成能力的測(cè)定

從圖9可見(jiàn)，分離菌株QAB5的OD550 nm值為0.300 7，空白對(duì)照組OD550 nm值為0.075，且二者間有極顯著性差異(P<0.001)，參照標(biāo)準(zhǔn)判定菌株QAB5具有較強(qiáng)的產(chǎn)生物膜能力。

***表示與對(duì)照組有極顯著性差異(P<0.01)。***means very significant difference compared with the control(P<0.01).圖9 菌株QAB5生物被膜形成能力Fig.9 Biofilm forming ability of strain QAB5

2.7 藥敏試驗(yàn)

2.7.1 抗菌藥物篩選 藥物敏感性試驗(yàn)顯示，嗜水氣單胞菌QAB5對(duì)阿莫西林、氨芐西林、頭孢氨芐、利福平耐藥，對(duì)卡那霉素、丁胺卡那、頭孢哌酮、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、新霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢曲松、米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星和四環(huán)素敏感，對(duì)青霉素中度敏感(表5)。

表5 分離菌株QAB5藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.7.2 中藥篩選 采用藥敏紙片瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)菌株QAB5進(jìn)行中藥藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，全蝎、烏梅和丁香對(duì)菌株QAB5有明顯的體外抑制效果，黃芩和荊芥有一定的抑菌效果，黃連、大黃對(duì)菌株QAB5的體外抑制效果較弱，其余32種中藥對(duì)菌株QAB5無(wú)抑制作用(表6)。

表6 中藥藥敏試驗(yàn)

3 討論

3.1 致病性嗜水氣單胞菌的鑒定

嗜水氣單胞菌屬于弧菌科氣單胞菌屬，是氣單胞菌的模式種。氣單胞菌屬根據(jù)有無(wú)運(yùn)動(dòng)力可分為兩類：一類是嗜冷性、非運(yùn)動(dòng)性的氣單胞菌，另一類為嗜溫性、運(yùn)動(dòng)性的氣單胞菌，嗜水氣單胞菌屬于第二類[19]。根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法》可知，嗜水氣單胞菌在普通瓊脂平板上生長(zhǎng)出的菌落為光滑、微凸、圓整、無(wú)色或淡黃色，有特殊芳香氣味；氧化酶反應(yīng)為陽(yáng)性；可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和七葉苷；脫脂奶平板試驗(yàn)菌落周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)清晰、透明的溶蛋白圈，符合以上特征可判定菌株為致病性嗜水氣單胞菌。本研究中，從青魚(yú)分離的菌株QAB5同時(shí)符合上述特征。分子生物學(xué)鑒定可以在核酸水平上快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)菌種屬進(jìn)行鑒定，而高度保守的16S rRNA序列是鑒定細(xì)菌的理想靶基因。本研究中，通過(guò)對(duì)16S rRNA序列鑒定發(fā)現(xiàn)，分離菌株QAB5與嗜水氣單胞菌親緣關(guān)系最近。綜合生理生化特性和分子鑒定結(jié)果，確定分離菌株QAB5為氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌。

3.2 嗜水氣單胞菌的毒力基因與致病力

嗜水氣單胞菌由于血清型眾多，又含有多種毒力因子，這些因子單個(gè)作用或多個(gè)共同作用，所以該菌的致病機(jī)制復(fù)雜，而胞外酶的分泌是氣單胞菌致病過(guò)程中的一個(gè)重要特征。羅志飛等[20]研究證實(shí)，嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株具有溶血活性和蛋白酶活性，而弱毒株沒(méi)有。與此研究結(jié)果一致，本研究中，分離菌株QAB5具有溶血活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性，表現(xiàn)出強(qiáng)毒株特征。

此外，嗜水氣單胞菌的毒力強(qiáng)弱與其所攜帶的毒力基因型和數(shù)量密切相關(guān)。劉杰等[21]研究證實(shí)，可將攜帶hly和act基因并同時(shí)攜帶aer、alt、ahal、ahp中的2種或2種以上毒力基因作為強(qiáng)毒株的鑒定標(biāo)準(zhǔn)；朱大玲等[22]研究證實(shí)，ahpA陰性菌株為無(wú)毒株，強(qiáng)毒株呈aerA+hlyA+ahpA+基因型。本研究中，菌株QAB5同時(shí)攜帶aer、ahp、hly、ast、alt、act6個(gè)毒力基因，判定其為強(qiáng)毒株。對(duì)菌株QAB5進(jìn)行MLST分析，鑒定其為ST251型菌株，為中國(guó)和美國(guó)流行菌株，主要分布在中國(guó)的江蘇、河南、湖北、湖南、廣東及浙江等省份，感染的魚(yú)類有中國(guó)的草魚(yú)、巖原鯉、團(tuán)頭魴，以及美國(guó)的斑點(diǎn)叉尾鮰等。龐茂達(dá)[23]分析了ST251型菌株的致病特性，發(fā)現(xiàn)其含有某些代謝途徑，可能會(huì)幫助細(xì)菌在宿主體內(nèi)獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)其生存增殖能力，從而使該型菌株能夠成為強(qiáng)毒力菌株并廣泛流行，提示同為ST251型的青魚(yú)源嗜水氣單胞菌分離株QAB5也具有較強(qiáng)的毒力。本研究中，通過(guò)人工感染健康青魚(yú)，發(fā)現(xiàn)高濃度組在短時(shí)間內(nèi)可使試驗(yàn)魚(yú)出現(xiàn)暴發(fā)性死亡，其LD50為4.4×106CFU/mL，與團(tuán)頭魴源嗜水氣單胞菌的LD50為1.55×105CFU/mL[24]、巖原鯉源LD50約為7.308×105CFU/mL[25]較為接近，表明ST251型嗜水氣單胞菌有較強(qiáng)的致病力。綜上，可判定此次青魚(yú)出血病所分離的ST251型嗜水氣單胞菌QAB5為高致病性的強(qiáng)毒株，也進(jìn)一步證實(shí)了溶血活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性在嗜水氣單胞菌的致病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，為后續(xù)深入研究嗜水氣單胞菌的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

3.3 嗜水氣單胞菌的藥物敏感性與病害防控

針對(duì)嗜水氣單胞菌的主要治療方式以抗生素藥物為主，因此，高效、精準(zhǔn)地使用抗生素及應(yīng)用中藥可以有效控制疾病傳播，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。孫浩然等[26]對(duì)黃顙魚(yú)源嗜水氣單胞菌HSY202005的藥敏試驗(yàn)顯示，其對(duì)四環(huán)素藥物敏感，對(duì)新霉素中度敏感；對(duì)卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素和米諾環(huán)素等7種藥物耐藥。王藝等[27]對(duì)草魚(yú)源嗜水氣單胞菌菌株的藥敏試驗(yàn)顯示，分離菌株對(duì)青霉素、氨芐西林和頭孢氨芐等7種藥物耐受，對(duì)卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那和頭孢曲松等5種藥物敏感。本研究中藥敏試驗(yàn)顯示，分離菌株QAB5與其他來(lái)源嗜水氣單胞菌的藥物敏感性有一定差異，但分別對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物和氨基糖苷類藥物均有不同程度的耐藥和敏感，這可能是由于時(shí)間、地區(qū)間用藥習(xí)慣及抗生素使用史有關(guān)。細(xì)菌的生物被膜具有抗吞噬、趨化和抗菌作用，以抵抗外界環(huán)境條件的改變和逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除[28]。本研究中證實(shí)，分離菌株QAB5具有較強(qiáng)的形成生物被膜的能力，易產(chǎn)生致病力增強(qiáng)和耐藥性傳播的風(fēng)險(xiǎn)，提示其在臨床治療中可能面臨一定困難和考驗(yàn)，表明要正確合理地選用敏感藥物和生物被膜清除劑進(jìn)行治療。

張浩然等[29]研究發(fā)現(xiàn)，中藥對(duì)鯽源嗜水氣單胞菌的抑菌能力依次為五倍子>五味子>大黃>烏梅>訶子>山茱萸，6種中藥均可抑制嗜水氣單胞菌；夏與晴等[30]分析了25種中藥對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)其中20種中藥能夠抑制嗜水氣單胞菌，石榴皮、烏梅和黃連效果最佳；蘇振霞等[31]研究證實(shí)，五倍子、黃連、訶子和大黃對(duì)嗜水氣單胞菌具有較好的抑菌效果，抑菌能力為大黃>訶子>黃連>五倍子；彭金菊等[32]使用32種中藥對(duì)嗜水氣單胞菌進(jìn)行抑制試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五倍子、梔子、訶子、五味子、黃芩、石榴皮、烏梅、川黃連、青蒿、魚(yú)腥草、甘草、大黃、白頭翁和虎杖對(duì)其有較好的抑菌效果。本研究中發(fā)現(xiàn)，全蝎、烏梅、丁香、黃芩、荊芥、黃連和大黃7種中藥對(duì)青魚(yú)源嗜水氣單胞菌分離菌株均有抑菌效果，且抑菌能力依次為全蝎=烏梅>丁香>黃芩=荊芥>黃連=大黃。以上試驗(yàn)結(jié)果存在差異可能與試驗(yàn)方法、所試菌株毒力的強(qiáng)弱，以及藥物的采集區(qū)、采集季節(jié)和貯藏炮制方法等不一致有關(guān)。因此，在青魚(yú)等淡水魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中要選擇嗜水氣單胞菌的高敏感藥物，并遵循使用小劑量原則進(jìn)行聯(lián)合用藥和精準(zhǔn)防控，確保治療效果，預(yù)防和減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

1)本研究中從患病青魚(yú)中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌QAB5，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析和16S rRNA基因序列分析鑒定為嗜水氣單胞菌，其LD50為4.4×106CFU/mL，MLST分型為ST251型，具有較強(qiáng)致病性。

2)青魚(yú)源嗜水氣單胞菌分離菌株QAB5攜帶aer、ahp、hly、ast、alt和act6個(gè)毒力基因，具有溶血活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性，屬于強(qiáng)毒株。

3)分離菌株QAB5具有較強(qiáng)生物被膜形成能力，含多重耐藥特征，在臨床用藥中，推薦使用環(huán)丙沙星、四環(huán)素等高敏感抗菌藥物，并結(jié)合生物被膜清除劑進(jìn)行小劑量精準(zhǔn)施治。

4)全蝎、烏梅和丁香等中藥對(duì)嗜水氣單胞菌QAB5具有良好的體外抑制效果，可為后續(xù)研發(fā)低抗無(wú)毒的水產(chǎn)類中藥制品提供科學(xué)參考。