馬林龍，羅正飛 ，劉艷麗，曹 丹，謝 飛，金孝芳,

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北武漢 430064；2.滇西科技師范學(xué)院，云南臨滄 677600；3.保山市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護監(jiān)測站，云南保山 678000）

普洱茶是云南省特有的地方名茶，是以地理標(biāo)志保護范圍內(nèi)的云南大葉種曬青毛茶為原料，經(jīng)特定的加工工藝加工而成的，具有獨特品質(zhì)特征[1-2]。茶葉香氣是評價茶葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)[3-4]，普洱茶產(chǎn)區(qū)多數(shù)地處高原山區(qū)，海拔、溫度、地形地貌等變化大，不同產(chǎn)區(qū)普洱茶在香氣品質(zhì)上存在較大的差異[5-6]。因此，全面系統(tǒng)了解普洱茶各個產(chǎn)區(qū)普洱茶香氣品質(zhì)對普洱茶的產(chǎn)地判定、標(biāo)準(zhǔn)建立及加工過程品質(zhì)調(diào)控等方面均有著積極意義。

臨滄市地處云南省西南部，是普洱茶原產(chǎn)地，有“天下普洱第一倉”的美譽，是普洱茶地理標(biāo)志產(chǎn)品重要保護區(qū)域[7-8]。臨滄市屬怒山山脈的南延部分，系滇西縱谷區(qū)，縱向上總體呈上游山地、中游丘陵、下游平原的地形地貌。地勢由東北向西南逐漸傾斜（海拔450～3429 m），通常海拔每升高100 m，年平均氣溫會降低0.5 ℃，晝夜溫差也隨著海拔升高而增加，垂直氣候帶譜明顯。復(fù)雜的地形地貌和多樣的立體氣候使得臨滄市境內(nèi)普洱茶在香氣品質(zhì)上存在一定的差異，但目前關(guān)于臨滄市普洱茶香氣品質(zhì)的研究較少且僅是選取了少數(shù)區(qū)域的樣本，很難全面系統(tǒng)的反應(yīng)臨滄市普洱茶的香氣品質(zhì)特征[9-10]。因此，本研究通過對16 份臨滄市（七縣一區(qū)）普洱生茶樣品的主要香氣成分含量進(jìn)行比較分析，并利用主成分分析（Principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal projections to latent structurediscriminant analysis，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計方法對主要香氣成分進(jìn)行綜合分析，以期客觀準(zhǔn)確地了解臨滄市普洱生茶的香氣品質(zhì)，進(jìn)而為臨滄市普洱生茶品質(zhì)、產(chǎn)地判定研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

當(dāng)年普洱生茶樣品 16 份，均來自臨滄市（七縣一區(qū)），其中臨翔區(qū)、鳳慶縣、云縣、雙江縣、鎮(zhèn)康縣、永德縣、滄源縣、耿馬縣等縣（區(qū)）各2 份。生產(chǎn)時間為2018 年5 月，品種均為當(dāng)?shù)厝后w，鮮葉規(guī)格為一芽二三葉，種按普洱生茶工藝“采摘—攤放—殺青—揉捻—曬干—蒸壓—干燥”加工而成，取樣后立即放入-20 ℃冰箱貯藏，于2019 年1 月進(jìn)行香氣成分檢測；癸酸乙酯（純度99%）美國Sigma-Aldrich公司。

手動SPME 進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supeclo 公司；7890A 氣相色譜儀、5975C 質(zhì)譜儀 美國Agilent 公司；HHS 型恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Milli-RO PLUS 30 純水機 法國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃?。℉S-SPME）采用頂空固相微萃取法（head-space solid-phase micro-extraction，HS-SPME）對茶葉樣品中的香氣進(jìn)行提取[11]。準(zhǔn)確稱取3.0 g 茶樣放入萃取瓶中，加入90.0 mL 沸水，加入2.00 μL 的內(nèi)標(biāo)（90 mg/L 癸酸乙酯），然后將裝有50/30 μm DVB/CAR/PDM 萃取頭（實驗前需250 ℃老化15 min）SPME 手持器通過瓶蓋的橡皮墊插入到萃取瓶中，在50 ℃水浴中平衡10 min，吸附50 min 后，取出并立即插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口中，240 ℃解吸附3 min，同時啟動儀器收集數(shù)據(jù)。

1.2.2 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對茶葉香氣成分進(jìn)行測定[11]。GC 條件：安捷倫HB-5MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度240 ℃，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。柱溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min 升至180 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃保持3 min。MS 條件：電子電離能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍為50～600 amu；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；質(zhì)譜傳輸線溫度為280 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用NIST11.L 譜庫對得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行串聯(lián)檢索和人工解析，質(zhì)譜匹配度>80%作為物質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)[11]。香氣組分釆用峰面積歸一化法定量，組分峰面積除以總峰面積得到各香氣物質(zhì)組分的相對含量。利用WPS 對試驗數(shù)據(jù)的整理與分析，采用SIMCAP 14.1 軟件進(jìn)行PCA、HCA 和OPLS-DA 等多元統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨滄市普洱生茶主要香氣成分含量分析

由表1 可知，釆用HS-SPME-GC-MS 對16 份普洱生茶的香氣成分進(jìn)行分析鑒定，共檢測到48個主要香氣成分，占頂空揮發(fā)物總量的90.72%～95.65%，包括醇類13 種、醛類17 種、酮類8 種、酯類4 種和其他類6 種。在香氣成分上，芳樟醇、1-辛烯-3-醇、順-氧化芳樟醇、反-氧化芳樟醇、壬醛、己醛、β-環(huán)檸檬醛、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、β-紫羅蘭酮、異佛爾酮和檸檬烯等11 個香氣物質(zhì)平均含量大于2%。在香氣種類上，醇類物質(zhì)占香氣總量的比例最高，平均含量為46.55%；其次是醛類物質(zhì)，平均含量為26.81%；酮類、酯類和其他類占香氣總量的比例相對較小。

表1 臨滄市普洱生茶香氣成分（%）Table 1 Aroma contents of raw Pu-er tea in Lincang City (%)

在醇類香氣中，所測樣品以具有鈴蘭花香并伴有木香的芳樟醇含量最為豐富，平均含量高達(dá)24.68%；其次是具有蘑菇、肉味的1-辛烯-3-醇，平均含量為8.94%；具有花香并伴有木香的順-氧化芳樟醇、反-氧化芳樟醇含量也較為豐富。在醛類香氣中，所測樣品主要以大部分具有青味的低級脂肪醛為主，其中壬醛含量最高，平均含量為7.69%；其次是己醛，平均含量為4.98%；庚醛、癸醛以及β-環(huán)檸檬醛含量也相對較高。酮類、酯類以及其他類香氣物質(zhì)雖占香氣總量比例相對較小，但對普洱生茶的香氣形成同樣有著關(guān)鍵作用[12-13]。酮類化合物通常呈花果香，所測樣品酮類香氣以2,2,6-三甲基環(huán)己酮和β-紫羅蘭酮含量最高，其次異佛爾酮含量也相對較高。另外，在云縣2 份普洱生茶樣品中均檢測出含量相對較高的反式-3-辛烯-2-酮，含量分別為0.87%、1.15%。在酯類香氣中，以水楊酸甲酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯含量最為豐富，并在滄源縣2 份普洱生茶樣品中檢測到含量相對較高的異戊酸葉醇酯，含量分別為0.48%、0.56%。在其他類香氣中，以具有檸檬味的檸檬烯含量最高，其次二甲硫、茶香螺烷含量也較為豐富，這些香氣成分已在多篇文獻(xiàn)中被證實是構(gòu)成茶葉香氣的重要物質(zhì)[14-15]?？傮w來看，臨滄市普洱生茶的主要香氣種類、組成與前人研究的云南普洱生茶結(jié)果相一致，以清香型的醇類、醛類香氣物質(zhì)為主，但不同產(chǎn)地樣品在香氣物質(zhì)種類以及相對含量上存在一定的差異[2,16]。

2.2 臨滄市普洱生茶主要香氣成分多元統(tǒng)計分析

2.2.1 主成分分析（PCA）基于臨滄市16 份普洱生茶香氣成分、種類的含量，利用SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行PCA 分析。由圖1 可知，滄源縣、雙江縣、耿馬縣等臨滄市南部地區(qū)與云縣、鳳慶縣、永德縣、臨翔區(qū)、鎮(zhèn)康縣等臨滄市北部地區(qū)的普洱生茶樣品在PCA 得分圖中能夠明顯區(qū)分開，且南、北部地區(qū)的普洱生茶分別分布在PC1 的正向、負(fù)向區(qū)間，說明臨滄市南、北地區(qū)普洱生茶在主要香氣成分上存在較大差異。結(jié)合主要香氣成分PCA 載荷圖（圖2）分析發(fā)現(xiàn)，醇類、酯類物質(zhì)總量以及芳樟醇、反-氧化芳樟醇、橙花醇、水楊酸甲酯等平均含量較高的醇類、酯類物質(zhì)在PC1 上呈正向分布，而絕大多數(shù)的醛類、酮類以及其他類物質(zhì)及其總量在PC1 上呈負(fù)向分布。說明臨滄市南部地區(qū)普洱生茶中醇類、酯類物質(zhì)含量相對較高，而北部地區(qū)普洱生茶中醛類、酮類以及其他類物質(zhì)含量相對較高。普洱生茶加工工藝與綠茶較為類似，香氣成分主要源于糖苷前體水解、脂肪酸和類胡蘿卜素氧化或高溫下氨基酸的美拉德反應(yīng)[3,17]，臨滄市南、北部地區(qū)普洱生茶香氣成分、種類含量差異可能與加工鮮葉中香氣前體物質(zhì)有直接關(guān)系。

圖1 臨滄市普洱生茶主要香氣成分PCA 得分圖Fig.1 PCA score plot derived from the main aroma compents of raw Pu'er tea in Lincang City

圖2 臨滄市普洱生茶主要香氣成分 PCA 載荷圖Fig.2 PCA corresponding loading plot derived from the main aroma compents of raw Pu'er tea in Lincang City

2.2.2 層次聚類分析（HCA）為了更好地觀測臨滄市16 份普洱生茶香氣組成的相似度，采用HCA 對整個香氣成分含量進(jìn)行分析。由圖3 可知，當(dāng)橫坐標(biāo)為100 時，16 份普洱生茶樣品分為2 類。第一類聚集了臨翔區(qū)、永德縣、鎮(zhèn)康縣、鳳慶縣和云縣等5 個縣（區(qū)）的普洱生茶樣品，說明這類樣品在香氣組成有一定的相似性，而該類樣品都集中在臨滄市北部地區(qū)，該類樣品中絕大多數(shù)醛類、酮類以及其他類香氣物質(zhì)含量相對較高。第二類聚集了滄源縣、耿馬縣和雙江縣等3 個臨滄市南部地區(qū)的普洱生茶樣品，該類樣品中醇類、酯類香氣物質(zhì)含量相對較高。以上研究結(jié)果與PCA 分析結(jié)果一致。

圖3 臨滄市普洱生茶主要香氣成分聚類分析Fig.3 HCA derived from the main aroma compents of raw Pu'er tea in Lincang City

2.2.3 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）為了進(jìn)一步明確臨翔區(qū)、永德縣、鎮(zhèn)康縣、鳳慶縣和云縣等10 個北部地區(qū)的普洱生茶樣品與滄源縣、耿馬縣和雙江縣等6 個臨滄市南部地區(qū)的普洱生茶樣品的差異香氣成分或種類，采用OPLS-DA 對整個香氣成分含量進(jìn)行分析。從OPLS-DA 模型下的得分圖（圖4）可以看出，臨滄市南、北部地區(qū)的普洱生茶樣品明顯地分開，其中R2Y（cum）=0.915、Q2（cum）=0.828，說明該模型具有良好的穩(wěn)定性和較好的預(yù)測能力。為了檢驗?zāi)Ｐ褪欠翊嬖谶^度擬合，建立200 次OPLS-DA 模型置換檢驗（圖5），置換檢驗驗證結(jié)果為R2Y（cum）=0.759、Q2（cum）=-0.940，說明模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過擬合現(xiàn)象?；谧兞客队爸匾裕╒ariable important for the projection,VIP）大于1，共篩選出23 個香氣成分或種類作為區(qū)分臨滄市南、北部地區(qū)普洱生茶香氣的重要標(biāo)志物（表2）。通常VIP 值越大，變量在臨滄市南、北部地區(qū)普洱生茶中的差異越顯著。由表2 可知，芳樟醇、異佛爾酮、酮類、醇類、醛類、β-環(huán)檸檬醛、α-環(huán)檸檬醛、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、橙花醇、β-紫羅蘭酮等VIP 值相對較大，對臨滄市南、北部地區(qū)普洱生茶分類貢獻(xiàn)較大。從香氣成分或種類含量上看，醇類物質(zhì)總量及含量較高的芳樟醇、橙花醇在南部地區(qū)普洱生茶樣品中的含量明顯要高于北部地區(qū)，而酮類物質(zhì)總量及含量較高的異佛爾酮、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、β-紫羅蘭酮的含量明顯要低于北部地區(qū)；醛類物質(zhì)總量及β-環(huán)檸檬醛、α-環(huán)檸檬醛在南部地區(qū)普洱生茶樣品中的含量要高于北部地區(qū)，而含量較高的壬醛、己醛在臨滄市南、北部地區(qū)的普洱生茶樣品中差異不顯著。

圖4 臨滄市普洱生茶主要香氣成分OPLS-DA 得分圖Fig.4 OPLS-DA score plots derived from the main aroma compents of raw Pu'er tea in Lincang City

圖5 臨滄市普洱生茶主要香氣成分OPLS-DA 置換檢驗圖Fig.5 OPLS-DA permutations plots derived from the main aroma compents of raw Pu'er tea in Lincang City

表2 基于OPLS-DA 的VIP 值大于1.0 的香氣成分Table 2 Aroma components with VIP values of more than 1.0 as determined by OPLS-DA

3 討論與結(jié)論

普洱生茶中主要香氣成分及其呈香特性已基本明確。其中，不經(jīng)貯藏的普洱生茶在香氣品質(zhì)上與曬青毛茶相似，香氣組成以醇類香氣為主，其次為醛類和酮類物質(zhì)[18-19]。而隨著貯藏時間的延長，醇類、酮類以及含氮類物質(zhì)呈下降趨勢，而甲氧基苯類物質(zhì)則呈增加趨勢，呈現(xiàn)獨特陳香的品質(zhì)特點[20-21]。本文從16 份臨滄市普洱生茶中共檢測到48 個主要香氣成分，包括醇類13 種、醛類17 種、酮類8 種、酯類4 種和其他類6 種。醇類物質(zhì)占香氣總量的比例最高，平均含量為46.55%；其次是醛類物質(zhì)，平均含量為26.81%；酮類、酯類以及其他類香氣物質(zhì)占香氣總量比例相對較小。由于本試驗的16 份樣品為當(dāng)年普洱生茶，均未經(jīng)過自然貯藏發(fā)酵，香氣成分中均未檢測到甲氧基苯類香氣成分。田小軍等[22]研究發(fā)現(xiàn)甲氧基苯類香氣成分在普洱茶自然發(fā)酵第7 年才檢測到，甲氧基苯類香氣的增加是導(dǎo)致普洱生茶香型逐漸呈現(xiàn)陳香的品質(zhì)特征重要因素。總體來看，臨滄市普洱生茶的主要香氣種類、組成與前人研究的云南普洱生茶結(jié)果相一致。

利用多元統(tǒng)計方法對臨滄市普洱生茶主要香氣成分進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，滄源縣、雙江縣、耿馬縣等臨滄市南部地區(qū)與云縣、鳳慶縣、永德縣、臨翔區(qū)、鎮(zhèn)康縣等臨滄市北部地區(qū)的普洱生茶樣品能夠明顯區(qū)分開。南部地區(qū)普洱生茶醇類、酯類香氣物質(zhì)含量相對較高，而北部地區(qū)醛類、酮類以及其他類香氣物質(zhì)含量相對較高。共篩選出23 個香氣成分或種類作為區(qū)分臨滄市南、北部地區(qū)普洱生茶香氣的重要標(biāo)志物，其中芳樟醇、異佛爾酮、酮類、醇類、醛類、β-環(huán)檸檬醛、α-環(huán)檸檬醛、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、橙花醇、β-紫羅蘭酮對臨滄市南、北部地區(qū)普洱生茶分類貢獻(xiàn)較大。不同產(chǎn)地因溫度、濕度、光照以及地形地貌等環(huán)境因素的影響，鮮葉原料在香氣前體物質(zhì)的含量、組成比例以及內(nèi)含糖苷水解酶特性等方面存在較大差異，香氣品質(zhì)呈現(xiàn)明顯的產(chǎn)地特征[23-24]。高海拔茶園具有相對低溫、高濕和多云霧的氣候特征，有利于茶樹含氮化合物和芳香物質(zhì)的合成和積累，茶葉酮類和醛類含量所占比例升高，玫瑰香氣和花果香味更加濃郁[25-26]。茶葉香氣中大量存在的醇類、醛類及內(nèi)酯類化合物等往往是由飽和或不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化而來，較低的海拔條件更有利于脂肪酸和不飽和脂肪酸的生成在，醇類、醛類及內(nèi)酯類香氣物質(zhì)相對豐富[23,27]。因此，推測海拔高度是形成臨滄市南、北部地區(qū)普洱生茶香氣成分含量差異一個重要原因。

本研究通過對臨滄市16 份普洱生茶樣品的主要香氣成分含量進(jìn)行比較分析，并利用多元統(tǒng)計方法綜合分析臨滄市普洱生茶主要香氣成分，一定程度上了解了臨滄市普洱生茶的香氣品質(zhì)。然而，普洱生茶的香氣成分受茶樹品種、采摘季節(jié)、加工工藝和儲藏條件等因素的影響，今后還需擴大臨滄市不同季節(jié)、不同品種、不同生產(chǎn)廠家及不同儲藏時間的普洱生茶樣本量，進(jìn)而為臨滄市普洱生茶品質(zhì)與產(chǎn)地判定等研究提供理論依據(jù)。