卞泗善，蘇慶紅，滕加文，蓋 輝，孔 鵬

骨肉瘤（osteosarcoma, OS）是中青年患者最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤，其中位發(fā)病年齡僅為20 歲[1-2]。OS 因其早期癥狀不明顯且容易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移而有較高的病死率，且預(yù)后不佳[3]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，目前主流的針對(duì)OS 的治療方案是新輔助化療聯(lián)合手術(shù)的綜合治療方式，這已使患者的5 年生存率得到質(zhì)的飛躍[4]，但手術(shù)的創(chuàng)傷、化療的不良反應(yīng)對(duì)患者而言仍然是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)?；诖?，本研究擬尋找能抑制OS 的中藥，為其治療提供更科學(xué)的方案?！侗静菪戮帯酚涊d“蟾酥，去毒如神，以毒制毒也”。對(duì)蟾酥的現(xiàn)代研究也證實(shí)其有效成分具有廣譜抗癌活性且作用高效，對(duì)肝癌、胃癌、膀胱癌等均具有很好的治療效果[5-6]。還有研究證實(shí)蟾酥可以調(diào)控OS 細(xì)胞的遷移、侵襲及凋亡，但具體作用機(jī)制尚不明確[7-8]。本研究擬采用人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，觀(guān)察蟾酥對(duì)其抑制作用并深入探討作用機(jī)制，擬為骨肉瘤治療提供科學(xué)的中醫(yī)治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，特級(jí)胎牛血清購(gòu)于以色列BI 公司，胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)于中國(guó)Biosharp 公司。

1.1.2 主要儀器 LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀（德國(guó)Roche 公司），熱循環(huán)儀（美國(guó)ThermoFisher公司），醫(yī)用離心機(jī)（中國(guó)湘儀公司），凝膠成像系統(tǒng)（中國(guó)天能科技公司），研究級(jí)正置熒光顯微鏡（德國(guó)Zeiss 公司），超純水凈化儀（美國(guó)PALL 公司），電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）。

1.1.3 主要試劑及藥物 整合素α4 （美國(guó)proteintech 公司，貨號(hào)19676-1-AP），固定破膜劑（中國(guó)聯(lián)科生物公司，貨號(hào)GAS006），抗兔IgG 抗體（美國(guó)CST 公司，貨號(hào)4412S），抗熒光淬滅封片劑（中國(guó)Solarbio 公司，貨號(hào)S2100），PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)Roche 公司，貨號(hào)04379012001），RNA 提取試劑（中國(guó)vazyme 公司，貨號(hào)R401-01），MEK5抗體、Nur77 抗體、c-myc 抗體、caspase-9 抗體、整合素α4 抗體（中國(guó)servicebio 公司，貨號(hào)GB11894、GB113748、GB11053 -1、GB113749、GB11351），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（中國(guó)Solarbio 公司，貨號(hào)PC0020），XMD8-92（中國(guó)MCE 公司，貨號(hào)4418），MEK5 過(guò)表達(dá)腺病毒（中國(guó)吉滿(mǎn)公司，貨號(hào)1967）。

1.2 方法

1.2.1 MG-63 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將人骨肉瘤MG63細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí)，使用含0.02%EDTA 的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。收集處理后的MG-63 細(xì)胞，以每孔2×103的密度接種在96 孔培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，加入實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)24 h。

1.2.2 含藥血清制備 蟾酥（按照2015 版藥典，蟾酥含量6.8；貨號(hào)20170601）水溶液（1∶1），由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。選用20 只新西蘭大白兔（2.0～2.5 kg），隨機(jī)分為含藥血清組和無(wú)藥血清組，每組10 只。含藥血清組分別給予蟾酥水溶液（蟾酥濃度分別為2.5%、5%），每日6 mL/kg 體重劑量灌胃；無(wú)藥血清制備組給予等劑量的生理鹽水灌胃。每天2 次，連續(xù)3 d，并于最后一次灌胃1 h 后，穿刺心臟抽血。4 ℃冰箱過(guò)夜，離心，無(wú)菌分離血清，滅活后，-20 ℃保存?zhèn)溆?。兩組兔均自由進(jìn)食和飲水。

1.2.3 qPCR 法檢測(cè)c-myc、caspase-9 表達(dá)水平PBS 清洗一次后，每10 cm2培養(yǎng)面積的細(xì)胞加入1 mL RNA 提取試劑。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，用移液器反復(fù)吹打，冰上靜置5 min，使用Nanodrop 2000 檢測(cè)各組RNA 濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并使用LightCycler 480Ⅱ型PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。使用20 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)完成后采集數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)整合素α4 收集細(xì)胞懸液中的懸浮細(xì)胞，放入PBS 中清洗1～2 次，加入100 μL 4%多聚甲醛進(jìn)行固定，后加入100 μL 0.2% Triton-100 液進(jìn)行穿透，室溫孵育10 min。加入100 μL 5%BSA 封閉液，室溫孵育1 h。分別加入100 μL 的一抗和二抗，4 ℃孵育過(guò)夜，100 μL 的DAPI 及抗熒光淬滅封片劑，置于正置熒光顯微鏡下熒光檢測(cè)。

1.2.5 Western Blot 法檢測(cè)MEK5、Nur77、c-myc、caspase-9、整合素α4 棄掉培養(yǎng)基并用PBS 清洗，加入蛋白裂解液不斷吹打置于冰上裂解，提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。照比例加入5×蛋白上樣緩沖液后沸水加熱3 min 制作上樣液。加樣后行SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，脫脂奶粉溶液中室溫?fù)u床封閉1 h 后加入MEK5、Nur77、c-myc、caspase-9、整合素α4 一抗（1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶5 000），4 ℃過(guò)夜，再加入二抗（1∶10 000）室溫孵育后顯影，用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s 表示，先對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布且方差齊者采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蟾酥抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG-63 增殖、轉(zhuǎn)移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡 相較于空白對(duì)照組，蟾酥含藥血清干預(yù)后c-myc 的mRNA 表達(dá)下降而caspase-9 的mRNA 表達(dá)上升（P＜0.05），且蟾酥含藥血清濃度越高，c-myc 含量越低而caspase-9 含量越高，即蟾酥含藥血清濃度與c-myc 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與caspase-9 表達(dá)呈正相關(guān)（圖1）。免疫熒光法檢測(cè)各組整合素α4 的表達(dá)情況結(jié)果顯示，細(xì)胞被標(biāo)記為藍(lán)色，整合素α4 被標(biāo)記為綠色，與對(duì)照組相比，蟾酥含藥血清干預(yù)后細(xì)胞中整合素α4 表達(dá)顯著下降，且與含藥血清濃度呈負(fù)相關(guān)（圖2）。

圖1 不同濃度蟾酥含藥血清干預(yù)后c-myc 和caspase-9 的mRNA 表達(dá)量

圖2 不同濃度蟾酥含藥血清干預(yù)后整合素α4 的表達(dá)情況

2.2 蟾酥對(duì)ERK5 通路的作用效應(yīng) Western Blot 檢測(cè)各組MEK5、Nur77 的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，蟾酥含藥血清干預(yù)后各組ERK5 信號(hào)通路分子MEK5、Nur77 的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），且與蟾酥含藥血清濃度呈負(fù)相關(guān)（圖3）。

圖3 不同濃度蟾酥含藥血清干預(yù)后MEK5、Nur77 的表達(dá)情況

2.3 應(yīng)用XMD8-92 及過(guò)表達(dá)MEK5 腺病毒后對(duì)c-myc、caspase-9、整合素α4 表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，XMD8-92 組與5%含藥血清組的caspase-9 表達(dá)升高，整合素α4 及c-myc 表達(dá)下降（P＜0.05）；相較于5%含藥血清組，XMD8-92 聯(lián)用5%含藥血清組具有更高的caspase-9 表達(dá)水平及更低的整合素α4 及c-myc 表達(dá)水平，見(jiàn)表1。相較于5%含藥血清組，5%含藥血清+MEK5 過(guò)表達(dá)腺病毒組c-myc、整合素α4 表達(dá)上調(diào)，而caspase-9 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 XMD8-92 干預(yù)后c-myc、caspase-9、整合素α4 的表達(dá)情況

3 討論

OS 是以非典型性疼痛、腫脹為早期癥狀的原發(fā)惡性腫瘤，青少年人群中最為常見(jiàn)[2]。因其早期癥狀常與青少年的生長(zhǎng)痛相混淆而難以早期發(fā)現(xiàn)，延誤治療，且OS 具有局部復(fù)發(fā)率高，容易發(fā)生頻繁全身轉(zhuǎn)移（特別是肺部轉(zhuǎn)移）的特點(diǎn)，故長(zhǎng)期存活率較低[9-10]。目前對(duì)OS 的治療方案中截肢或保肢外科手術(shù)治療占有重要地位[11]；除手術(shù)外，新輔助化療也是常用的治療方式，研究證實(shí)新輔助化療對(duì)縮小腫瘤外科邊界、提高生存率具有重要意義[12]。但外科手術(shù)和化療的直接創(chuàng)傷和副作用往往令患者難以接受，所以在中醫(yī)藥這個(gè)瑰寶中搜尋有效的治療骨肉瘤的方案具有重要意義。

蟾酥，味甘、辛、性溫，具有開(kāi)竅醒神、清熱解毒的功效，《本草新編》記載“蟾酥，去毒如神，以毒制毒也。消堅(jiān)破塊，解瘀化癰。雖皆外治之功，而藥籠中斷不可缺”。現(xiàn)代中醫(yī)腫瘤理論體系認(rèn)為OS 的發(fā)生發(fā)展與“癌毒”關(guān)系密切，即“癌毒”入經(jīng)絡(luò)、血脈向遠(yuǎn)處播散，故導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移[13]。正是基于“癌毒”理論，中醫(yī)大家多從“清熱解毒、化瘀消腫”的角度治療OS，療效頗佳[14]。在“解毒抗癌”理念的指導(dǎo)下，從“解毒類(lèi)”中藥中挖掘抑制OS 的有效成分已成為研究熱點(diǎn)。

蟾酥中化學(xué)成分除外蟾蜍內(nèi)脂類(lèi)、蟾蜍色胺類(lèi)和甾醇類(lèi)三大類(lèi)，尚含有氨基酸、有機(jī)酸、腎上腺素、嗎啡、多肽、多糖等化合物[15]，蟾蜍色胺類(lèi)化合物含有吲哚環(huán)的吲哚堿類(lèi)，具有抗腫瘤和血管收縮作用[16]。蟾毒靈、脂蟾毒配基和華蟾毒精是蟾酥抗腫瘤作用的主要活性成分。蟾毒靈已被證實(shí)具有廣譜抗癌、作用高效的特點(diǎn)[6]。華蟾毒精可治療如肝癌、乳腺癌等多種腫瘤疾病[17-19]。其他學(xué)者已對(duì)蟾酥的有效成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其具有抑制OS 的遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用效果，但其作用機(jī)制研究尚不深入[20]。

基于此，本研究采用蟾酥含藥血清干預(yù)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，研究蟾酥的作用效應(yīng)并探索其深層作用機(jī)制。細(xì)胞增殖受到各種分子信號(hào)調(diào)控，研究證實(shí)癌基因c-myc 對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞分化具有誘導(dǎo)作用[21]。此外，細(xì)胞凋亡是機(jī)體為調(diào)控自身的生長(zhǎng)發(fā)育，維護(hù)其內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定，由自身基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程。細(xì)胞凋亡是藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制。caspase-9 在促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起到了重要作用，其表達(dá)具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。劉國(guó)雄等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)人成骨肉瘤MG-63 細(xì)胞的凋亡作用和caspase-9 有關(guān)。骨肉瘤極易轉(zhuǎn)移，這與一些促進(jìn)轉(zhuǎn)移的分子被啟動(dòng)有關(guān)。國(guó)內(nèi)研究者早就通過(guò)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明整合素α4 對(duì)MG-63 細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移能力有明顯的誘導(dǎo)作用，抑制整合素α4 有助于控制MG-63 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移功能[23]。研究結(jié)果顯示，蟾酥含藥血清干預(yù)后，c-myc、整合素α4 表達(dá)下調(diào)而caspase-9 表達(dá)升高，且在一定范圍內(nèi)，蟾酥含藥血清濃度越高，作用效果越好。本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)蟾酥含藥血清能夠顯著抑制OS 的作用，且隨著濃度的提高，這種作用效應(yīng)也在增強(qiáng)。但蟾酥含藥血清濃度高于5%時(shí)，這種作用是否也會(huì)隨著濃度的升高而強(qiáng)化，是下一步研究的重心。以上數(shù)據(jù)表明蟾酥可以發(fā)揮抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG-63 增殖、轉(zhuǎn)移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用效應(yīng)。

對(duì)ERK5 信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蟾酥含藥血清干預(yù)后MEK5、Nur77 含量下調(diào)，與濃度呈負(fù)相關(guān)性，這表明蟾酥的作用效應(yīng)可能與抑制ERK5 通路相關(guān)。為進(jìn)一步證實(shí)蟾酥調(diào)控ERK5 發(fā)揮相應(yīng)作用機(jī)制，本研究采用ERK5 的抑制劑XMD8-92 及MEK5 過(guò)表達(dá)腺病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示XMD8-92 的作用效應(yīng)與蟾酥相同，而MEK5過(guò)表達(dá)后蟾酥的作用效應(yīng)被拮抗，過(guò)表達(dá)MEK5 腺病毒的空載體不具備作用效應(yīng)，這證明了蟾酥通過(guò)抑制ERK5 信號(hào)通路發(fā)揮相關(guān)作用。

綜上，蟾酥具有抑制OS 的作用效應(yīng)，并且其通過(guò)阻斷ERK5 信號(hào)通路發(fā)揮抑制MG-63 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用效果，隨著對(duì)蟾酥抑制OS 研究的不斷深入，能為OS 的防治提供更好的方案。