虞銳鵬, 吳勝芳, 王利平, 宋啟軍
(1. 江南大學化學與材料工程學院,江蘇 無錫 214122;2. 江南大學食品科學與資源挖掘全國重點實驗室,江蘇 無錫 214122)
近年來,湖泊富營養(yǎng)化加重造成水體中藍藻過度生長,頻繁引發(fā)藍藻水華[1]。 藻類死亡時將細胞內(nèi)大量代謝物釋放到水中[2],使水質(zhì)嚴重惡化,散發(fā)的異味引起人們對水質(zhì)是否達標的恐慌[3],同時這些異味代謝物進入水產(chǎn)品也引起消費者的擔心。 由于其極低的氣味閾值,以及令人討厭的霉臭味[4-5]與水產(chǎn)品的腥味混在一起,極大地降低了人們的消費欲望,同時魚肉中的復雜基質(zhì)給分析檢測和食品安全工作提出了挑戰(zhàn)。 國家現(xiàn)行有效標準針對生活飲用水中臭味物質(zhì)土臭素和2-甲基異莰醇制定了檢測方法[6],但對于水產(chǎn)品中各類異味物質(zhì)檢測缺少合適的分析方法。 因此,開發(fā)研究藍藻異味代謝物的篩查方法具有重要意義。
微波蒸餾和固相微萃取相結(jié)合,作為水蒸氣蒸餾的替代和補充方法,其微波加熱提供的熱量可以快速對復雜樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進行提取[7],SPME可以有效地富集、 凈化揮發(fā)性有機化合物(VOCs),具有省時、富集效率高、再現(xiàn)性好、不需要使用溶劑,并具有一定的特異性吸附等優(yōu)點[8-9]。 全自動進樣系統(tǒng)可減少轉(zhuǎn)移過程中分析物的損失,大大提高了工作效率,已經(jīng)成為環(huán)境、食品和臨床分析中廣泛使用的萃取技術之一。 Dias 等采用SPME 富集、GCMS 結(jié)合嗅覺測定鑒定出2-乙酰-1-吡咯啉是影響香米香氣的揮發(fā)性化合物[10]。 Deng 等采用MD 和SPME,結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜定量分析,得到薄荷腦中精油和揮發(fā)物的化學特征[11]。Ternelli 等采用微波輔助蒸餾, 結(jié)合SPME 和氣相色譜-質(zhì)譜對藥用橄欖油中的大麻素和萜烯進行表征并定量分析[12]。
全二維氣相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜(comprehensive two-dimensional gas chromatographyhigh resolution time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-HR-TOFMS) 通過全二維氣相色譜分離克服了傳統(tǒng)一維色譜分析過程中組分共流出的困擾,其高速率的采集數(shù)據(jù)能力和高靈敏度保證了分析信息的高密度和高通量[13],廣泛應用于代謝組學、食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)藥等復雜基質(zhì)中痕量化合物的定性定量分析。李楠等應用GC×GC-HR-TOFMS精確質(zhì)量數(shù)及保留指數(shù), 鑒定出熟制中華絨螯蟹122 種揮發(fā)性風味成分[14]。黃玲等結(jié)合SPME 和GC×GC-TOFMS 對威代爾冰葡萄酒中揮發(fā)性成分進行檢測分析[15]。
藍藻中揮發(fā)性物質(zhì)種類豐富并含有獨特成分,主要為醇類、萜烯類、脂肪族烴、烷基硫化物和鹵化物等。 萜烯類物質(zhì)因具有化感抑制作用,利于藻細胞在逆境脅迫中生存和繁殖,并抑制其他水生生物生長;大量存在于藻體中的脂肪族烴主要來自脂肪酸脫羧反應;烷基硫化物與藻體死亡相關[16]。根據(jù)其揮發(fā)性代謝物的消長變化規(guī)律[17],對其中8 種顯著性差異大、閾值低的異味代謝物進行定量分析。 本研究中對夏秋季節(jié)的湖泊水產(chǎn)品進行采集, 采用GC×GC-HR-TOFMS 分析檢測揮發(fā)性異味代謝物,建立了藍藻主要代謝物的高靈敏度定量分析方法,為評價水產(chǎn)品質(zhì)量和監(jiān)測環(huán)境提供了一種可靠手段并積累了基礎數(shù)據(jù)。
50/30 μm Divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane(SP DVB/CAR/PDMS)、85 μm SP CAR/PDMS、100 μm SP PDMS: 美國Supelco 公司產(chǎn)品;85 μm XT DVB/Carbon/PDMS:上海新拓儀器公司產(chǎn)品;20 mL 頂空瓶:德國Gerstel 公司產(chǎn)品;甲醇(色譜純):美國天地公司產(chǎn)品;二甲基二硫、二甲基三硫、2-甲基異莰醇、 β-環(huán)檸檬醛、 β-紫羅蘭酮、土臭素、吲哚、3-甲基吲哚及其他化學品(純度≥98%):上海安譜實驗公司產(chǎn)品。
混合標準溶液: 配制質(zhì)量濃度為10 mg/L 混合標準儲備液, 用甲醇逐級稀釋至0.20 mg/L 標準溶液。 內(nèi)標溶液:100 mg/L 的2-異丁基-3-甲氧基吡嗪用甲醇逐級稀釋至20.0 μg/L 的標準溶液。 工作溶液:用不含目標化合物的空白魚肉提取液逐級稀釋至合適濃度,即用即配。
實驗中所用NaCl 為優(yōu)級純,在450 ℃烘干6 h后使用。
Pegasus GC-HRT 4D+全二維氣相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜儀(配有固相微萃取自動進樣系統(tǒng)):美國LECO 公司產(chǎn)品;Mili-Q Direct 8 型超純水儀:美國Millipore 公司產(chǎn)品;Explorer 12 全自動微波組合化學合成工作站:美國PYNN 公司產(chǎn)品。
1.3.1 微波蒸餾提取方法 取水產(chǎn)品可食用組織勻漿,凍干,稱約2 g 左右于150 mL 微波萃取燒瓶中,加入20 mL 純水充分浸泡。 在微波功率150 W、冷凝水溫8 ℃、提取時間15 min 條件下,收集蒸餾液,并用水定容,冷藏保存。
1.3.2 固相微萃取方法 于20 mL 萃取瓶內(nèi)加入8 mL 蒸餾餾分及2.0 g NaCl。 在平衡時間10 min、萃取溫度60 ℃、吸附萃取時間30 min、不分流進樣、解析時間5 min、解析溫度250 ℃條件下進行萃取。
1.3.3 GC×GC-HR-TOFMS 分析條件及數(shù)據(jù)分析GC×GC 條件: 一維色譜柱TR-FFAP (30 m×0.25 mm,0.25 μm),二維色譜柱Rxi-17sil MS(2 m×0.25 mm,0.25 μm);進樣口溫度250 ℃,不分流進樣;起始溫度40 ℃,保持2 min,以5 ℃/min 的速率升溫至230 ℃, 保持7 min; 調(diào)制器調(diào)制周期4 s,500 s 前冷卻時間1.2 s, 加熱時間0.8 s,500 s 后冷卻時間0.8 s,加熱時間1.2 s;二維色譜柱柱溫箱的溫度全程比一維色譜柱柱溫箱高5 ℃;以高純氦氣作為載氣,恒流模式,流量1 mL/min。
TOFMS 條件:采用EI+離子源,溫度210 ℃,電離能量70 eV,傳輸線溫度280 ℃,檢測器電壓1 800 V,采集質(zhì)量數(shù)范圍(m/z)33~450。
代謝物分析:經(jīng)LECO 軟件自動解卷積處理總離子流圖,通過NIST2017 和Wiley9 譜庫匹配,與標準樣品對比定性,采用標準曲線法對其中目標化合物進行定量分析,8 種異味代謝物的信息如表1所示。
表1 異味代謝物的名稱、分子式、CAS 號、定量離子和定性離子Table 1 Name, formula, CAS number, quantitative and qualitative ions of odor metabolites
魚肉組織的揮發(fā)性化合物和基質(zhì)十分復雜,使用GC×GC-HR-TOFMS 在全掃描模式下采集樣品原始數(shù)據(jù),通過對譜庫檢索并結(jié)合保留指數(shù)比對發(fā)現(xiàn),根據(jù)正、反匹配因子得到類似度大于800 的揮發(fā)性化合物共430 個。 這些揮發(fā)性化合物形成的非主要碎片雖然量少,但可能會對痕量目標化合物特征碎片產(chǎn)生干擾,而傳統(tǒng)的一維氣相色譜技術進行分離檢測時存在峰容量不足、共流出、靈敏性低等問題,因此無法滿足目前肌肉組織中痕量異味代謝物的定量要求。 全二維氣相色譜的冷熱調(diào)制通過冷噴、熱噴時間的設定,使眾多化合物能得以更好分離。 在一個正交GC×GC 系統(tǒng)中,峰容量為其兩個色譜柱各自峰容量的乘積,分辨率為兩個色譜柱各自分辨率平方加和的平方根。 因此全二維氣相色譜具有分離能力強、峰容量大、選擇性高的特點。
由圖1(a)可知,樣品的一維總離子流色譜圖中存在大量化合物共流出的現(xiàn)象,即在同一個一維色譜保留時間點上,存在多個物質(zhì)。 經(jīng)過質(zhì)譜鑒定,主要的雜峰來自魚肉組織中醛、酯、酮、酸和烷烴等的干擾,相鄰峰或雜質(zhì)的共流出會對目標化合物的定性定量有一定干擾。 而經(jīng)二維色譜分離,這些共流出雜質(zhì)并未對目標峰造成干擾,即可在二維色譜上得到較好分離(見圖1(b))。二維色譜具有強大的分離能力, 可清晰地分辨出不同目標化合物的色譜峰,更好地進行復雜組分的分離鑒定。 通過兩個維度的分離避免了性質(zhì)相似VOCs 的彼此干擾, 提高了定量的準確性,避免假陽性的出現(xiàn)。
圖1 加標魚肉揮發(fā)性化合物GC×GC-HR-TOFMS 一維總離子流色譜圖及二維總離子流色譜圖Fig. 1 GC×GC-HR-TOFMS total 1D and 2D ion chromatogram of volatile compounds of odor metabolites in fish samples with added standards
藻類生長典型的代謝物β-環(huán)檸檬醛,其與魚肉基質(zhì)中的丁酸、2-(2-丙烯基)呋喃在一維色譜中難以達到基線分離, 但在二維色譜中保留時間分別為:1.210、0.665、0.880 s,即二維色譜能有效分離此3 種化合物;同樣,在一維色譜具有相同保留時間的土臭素、己酸、某一未知物在二維色譜中得以分離,出峰時間分別為1.170、0.735、1.280 s; 在一維色譜具有相同保留時間的3-甲基吲哚、 二苯甲酮、γ-十二內(nèi)酯在二維色譜中得以分離, 出峰時間分別為0.885、1.145、1.185 s。
實驗中于樣品組織中添加相同質(zhì)量目標化合物混合標準溶液,勻漿凍干,進行浸泡時間、料液質(zhì)量體積比、微波功率及提取時間等條件優(yōu)化,并以8種異味代謝物色譜峰的總峰面積衡量提取效率。
2.2.1 浸泡時間的影響 樣品被水浸濕的程度很大程度影響了微波加熱的效果。 在微波功率150 W、料液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL 的情況下, 考察浸泡時間分別為10、30、60、 90、180 min 時對異味代謝物提取效率的影響(見圖2)。 結(jié)果表明隨著浸泡時間的增長,樣品提取效率變大,由于浸泡會使組織中細胞間隙增大,使水分進一步進入,使得提取效率有所增加。 當浸泡時間達到60 min 時,基本穩(wěn)定不變,樣品已被水完全浸潤。 因此,選擇浸泡時間為60 min。
圖2 浸泡時間對魚肉中異味代謝物提取效率的影響Fig. 2 Effect of immersion time on the relative extraction efficiency of odor metabolites in fish samples
2.2.2 料液質(zhì)量體積比的影響 水作為溶劑將異味代謝物共同蒸餾出來,水量的多少直接影響了提取效率。 在微波功率150 W、浸泡時間60 min 的情況下, 考察料液質(zhì)量體積比分別為1 g∶5 mL、1 g∶10 mL、1 g∶15 mL 時對異味代謝物提取效率的影響。結(jié)果如圖3 所示,隨著水量增大異味代謝物提取效率增大,當料液質(zhì)量體積比達到1 g∶10 mL 時,已基本蒸餾完全。 因此,選擇料液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL 進行后續(xù)實驗。
圖3 料液質(zhì)量體積比對魚肉中異味代謝物提取效率的影響Fig. 3 Effect of solid-liquid ratio on the relative extraction efficiency of odor metabolites in fish samples
2.2.3 微波功率及提取時間的影響 微波輻射的能量在水與提取物之間進行傳遞,以水分子為主的分子劇烈運動而產(chǎn)生高熱,使細胞破裂,在較短的時間內(nèi)釋放出提取物。 微波功率對于提取效率有較大的影響,在浸泡時間60 min、料液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL 的條件下, 考察微波功率分別為100、150、200 W 以及不同的提取時間(5、10、15、20 min)對異味代謝物提取效率的影響。 結(jié)果如圖4 所示,隨著微波功率逐漸提高,溫度上升,總峰面積也在逐漸升高,在150 W 時達到了最大值,之后其提取效率有所下降,這種現(xiàn)象可能由于功率過大也會使水蒸氣快速逸出,導致水蒸氣來不及將提取物分子完全帶出,有時會因為產(chǎn)生較大的氣流量將樣品沖出樣品管, 故后續(xù)實驗中選擇微波功率150 W 進行實驗。 實驗發(fā)現(xiàn),較難揮發(fā)化合物β-紫羅蘭酮及3-甲基吲哚需要更長的蒸餾時間,15 min 可以達到較完全的回收,收集液體積可達16 mL。 此外,在不同的蒸餾時間下會相應得到4~20 mL 的收集液。隨著收集液體積的逐漸增大, 異味代謝物峰面積不斷升高,當收集液體積為16 mL 或更多時,峰面積基本不變,說明已提取完全。 為了保證異味代謝物完全流出,選擇收集液體積為16 mL 及以上,即提取時間15 min 進行后續(xù)實驗。
圖4 微波功率和提取時間對魚肉中異味代謝物提取效率的影響Fig. 4 Effect of microwave power and irritation time on the relative extraction efficiency of odor metabolites in fish samples
纖維涂層選擇不同時萃取纖維頭對樣品的實際萃取能力是不同的。 實驗考查了4 種不同萃取纖維頭對魚肉樣品微波蒸餾餾分萃取能力,8 種目標化合物峰面積如圖5 所示。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),XT DVB/Carbon/PDMS 對目標化合物萃取效率最大, 總峰面積為1.26×1011,是另外3 種萃取纖維頭的1.18~5.12倍(SP DVB/CAR/PDMS 時總峰面積為1.07×1011、SP CAR/PDMS 時總峰面積為9.18×1010、SP PDMS 時總峰面積為2.46×1010)。 同樣是三合一模式,SP DVB/CAR/PDMS 是雙涂層模式[18],可能會對某些分子產(chǎn)生吸附障礙, 而XT DVB/Carbon/PDMS 采用更加粗糙的無定形顆粒物碳與球狀顆粒物DVB 均勻散布在PDMS 中,可以提高表面積,從而提高異味代謝物的吸附能力。 另外兩種SPME 涂層對分子的大小、極性強弱各有偏重,不適于性質(zhì)差異大的藍藻代謝物萃取。 因此, 后續(xù)實驗均采用XT DVB/Carbon/PDMS。
圖5 不同萃取纖維頭對魚肉中8 種異味代謝物萃取效果的比較Fig. 5 Comparison of different extracted fibers for the extraction of odor metabolites in fish samples
參照作者所在課題組建立的優(yōu)化SPME 萃取條件的方法[17]確定萃取溫度60 ℃、吸附萃取時間30 min、 質(zhì)量分數(shù)20% NaCl 溶液作為水產(chǎn)品異味代謝物分析條件。
配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.20、1.00、10.00、100.00 μg/L 的混合校準溶液建立標準曲線,用所建立的GC×GC-HR-TOFMS 方法分別進樣分析。 方法線性方程、相關系數(shù)及檢出限如表2 所示。 以各化合物的峰面積為縱坐標, 對應質(zhì)量濃度為橫坐標,繪制標準曲線。 異味代謝物在質(zhì)量濃度0.01~100.00 μg/L 時呈良好線性,分別以3 倍和10 倍信噪比方法計算得到檢出限為0.07~3.30 μg/kg,定量限為0.2~10.0 μg/kg, 在加標質(zhì)量分數(shù)10 μg/kg 添加水平下, 日內(nèi)相對標準偏差為2.26%~8.04%(見表3)。
表2 目標化合物的保留時間、線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限(3S/N,n=6)Table 2 Retention time,linear ranges,linear equations,correlation coefficient,limit of detection and limit of quantitation of the target compound(3S/N,n=6)
表3 異味代謝物的加標回收率及相對標準偏差Table 3 Spiked recovery rate and relative standard deviation of odor metabolites
采用本方法收集藍藻水華暴發(fā)期間(2020 年4月—2021 年9 月)太湖水域12 批次淡水魚樣,包括鯉魚、鯽魚、梅鱭魚、鰱魚、銀魚等常見的水產(chǎn)品進行分析。 結(jié)果表明魚樣中8 種異味代謝物檢出率達11.2%以上, 其中二甲基三硫、 土臭素、 β-環(huán)檸檬醛、 β-紫羅蘭酮、 吲哚質(zhì)量分數(shù)最高分別可達:7.21×102、3.18、1.85×102、94.6、4.69×102μg/kg。 鄒劍敏等發(fā)現(xiàn)羅非魚肉中土臭素達到0.64~0.97 μg/kg[19],Deng 等檢測到不同魚組織中β-環(huán)檸檬醛達到6.0~9.0 μg/kg、β-紫羅蘭酮達到17~35 μg/kg[20]。 由此可見,淡水魚在春夏季藍藻暴發(fā)時期,確實受到藍藻異味代謝物影響。
全二維氣相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜法靈敏度高、采集數(shù)據(jù)能力強,能夠克服復雜基質(zhì)的共流出問題。 利用高分辨特征離子的精確質(zhì)量數(shù)來準確測定目標化合物,作者應用GC×GC-HR-TOFMS 方法檢測8 種藍藻異味代謝物,所有檢測目標化合物分離良好、重現(xiàn)性好,并且采用微波蒸餾將目標化合物從魚肉組織中快速提取, 通過固相微萃取富集,該前處理方法簡便快捷,消除復雜基質(zhì)的干擾,使檢測效率提高。 8 種異味代謝物檢出限可達到0.07~3.30 μg/kg,低、中、高3 個質(zhì)量分數(shù)水平的加標回收率為72.5%~103.7%,RSD≤14.30%。 該方法具有良好的準確度和精密度,在實際應用中,檢測效果良好,提高了樣品篩查、定性和定量檢測的準確性,可用于魚肉樣品中多種藍藻異味代謝物的篩查及確證,并為食品安全和環(huán)境監(jiān)測提供研究方法與數(shù)據(jù)支持。