張 也， 馬 亮， 李亞蕾， 王松磊

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

亞硝酸鹽是指含有亞硝酸根陰離子（NO2-）的一類鹽，被用作食品添加劑廣泛應(yīng)用于腌制肉類罐頭及肉制品中，具有護(hù)色、增進(jìn)風(fēng)味和防腐等作用[1-3]。人體攝入過(guò)量亞硝酸鹽，可使血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力造成機(jī)體缺氧[2，4-5]。 此外，亞硝酸鹽還可與體內(nèi)的胺類結(jié)合成具有致癌作用的亞硝胺，嚴(yán)重危害人體健康[1，4]。 因此，建立準(zhǔn)確、快速檢測(cè)食品中亞硝酸鹽的方法具有重要的研究意義。

檢測(cè)食品中亞硝酸鹽的方法主要有分光光度法[6-8]、離子色譜法[9-11]、毛細(xì)管電泳法[12]、熒光光譜法[13-14]和電化學(xué)法[5，15-17]等。 對(duì)比傳統(tǒng)方法，電化學(xué)方法具有操作簡(jiǎn)單、 響應(yīng)迅速和靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，在亞硝酸鹽檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景[18]。 電化學(xué)傳感器的原理是電極敏感材料與目標(biāo)物的相互作用和識(shí)別，對(duì)電極進(jìn)行納米材料的修飾，從而降低電極電勢(shì)，提高電極催化性能，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的準(zhǔn)確和靈敏測(cè)定[2-3，19]。

過(guò)渡金屬氧化物（如氧化銅[20-21]、氧化鈷[22]和氧化鎳[23]等）由于成本低、來(lái)源廣和催化性出色等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。 各種鈷基催化劑被發(fā)現(xiàn)具有類似酶催化作用，其中鈷氧化物被研究最多，與生物酶相比具備許多優(yōu)勢(shì)，如不易失活、成本低廉、易保存、催化性能穩(wěn)定等[24]。 泡沫鎳因具有三維立體結(jié)構(gòu)、大的表面積、低成本、優(yōu)良導(dǎo)電性等優(yōu)點(diǎn)而常被用作支撐材料[25-26]，通過(guò)水熱合成法可以在金屬泡沫鎳上生長(zhǎng)出納米材料，從而用于構(gòu)建電化學(xué)傳感器。

通過(guò)水熱合成法在泡沫鎳上生成鈷基氫氧化物前驅(qū)體，然后將其放置管式爐中于空氣中高溫煅燒，制備泡沫鎳基負(fù)載Co3O4納米復(fù)合材料，構(gòu)建電化學(xué)傳感器，用于食品中亞硝酸鹽的檢測(cè)。 通過(guò)電化學(xué)工作站研究該傳感器的電催化機(jī)理和電化學(xué)性能，表明該修飾電極對(duì)亞硝酸鹽的檢測(cè)具有大的檢測(cè)范圍和高靈敏度。 并進(jìn)行了實(shí)際樣品檢測(cè)，所得結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，表明該傳感器可用于快速檢測(cè)食品中的亞硝酸鹽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硝酸鈷（Co（NO3）2·6H2O）、氟化銨（NH4F）、脲（尿素，CH4N2O）、無(wú)水乙醇、丙酮、 鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、亞硝酸鈉、濃鹽酸等（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；泡沫鎳：天津艾維信化工科技有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)中清洗、配制溶液等均使用超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E 電化學(xué)工作站、飽和甘汞電極、鉑絲電極：上海辰華儀器有限公司產(chǎn)品；電熱真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；管式爐：合肥科晶技術(shù)有限公司產(chǎn)品；電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器：深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；磁力攪拌器：上海弗魯克儀器有限公司產(chǎn)品；微量移液器：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 電化學(xué)傳感器制備 泡沫鎳預(yù)處理[27]：用剪刀將泡沫鎳裁剪為1.0 cm×1.0 cm 的薄塊， 置于3 mol/L 鹽酸溶液中超聲浸泡30 min， 然后依次用丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水分別超聲清洗8 min，以便除去泡沫鎳表面的油污和氧化層等雜質(zhì)，最后將清洗后的泡沫鎳片放入電熱真空干燥箱中， 于60 ℃下真空干燥6 h 備用。

水熱合成法制備鈷基氫氧化物/泡沫鎳[24]：分別稱取2 mmol 的Co（NO3）2·6H2O、8 mmol 的NH4F、1 mmol 的CH4N2O 溶于40 mL 超純水中，用磁力攪拌器以5 000 r/min 攪拌10 min 至為均勻溶液。 然后將上述處理好的泡沫鎳和混合溶液轉(zhuǎn)移至100 mL的水熱反應(yīng)釜中， 置于電熱真空干燥箱中于120 ℃條件下反應(yīng)10 h，待反應(yīng)結(jié)束后使反應(yīng)釜自然冷卻至室溫，然后用鑷子取出泡沫鎳，用超純水沖洗表面2～3 次， 再置于電熱真空干燥箱中于60 ℃下真空干燥6 h。

鈷基氫氧化物/泡沫鎳轉(zhuǎn)變?yōu)镃o3O4/Ni foam[24]：將干燥后的鈷基氫氧化物/泡沫鎳置于瓷舟中，再將瓷舟放入管式爐的石英管升溫區(qū)中心， 以5 ℃/min的升溫速率升溫至350 ℃，并在空氣的氛圍下煅燒2 h，自然冷卻至室溫得到Co3O4/Ni foam。

Co3O4/Ni foam 的制備流程如圖1 所示。

圖1 Co3O4/Ni foam 電極的制備過(guò)程Fig. 1 Preparation process of Co3O4/Ni foam nanomaterials

1.3.2 電化學(xué)檢測(cè)

所有電化學(xué)測(cè)量均在CHI660E 電化學(xué)工作站上進(jìn)行，將制備的Co3O4/Ni foam 納米復(fù)合材料用作工作電極，鉑絲電極用作對(duì)電極，飽和甘汞電極用作參比電極。 在室溫下進(jìn)行檢測(cè)，以0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（PBS 緩沖液，pH 6.0）作為電解液，實(shí)驗(yàn)前需通氮?dú)獬ト芤褐械难鯕狻?采用循環(huán)伏安法分別設(shè)置不同的掃描速率（50、100、150、200、250、300 mV/s）， 掃描電壓0～1.2 V， 研究NO2-在Co3O4/Ni foam 表面的電化學(xué)行為。 采用計(jì)時(shí)安培滴定法研究電化學(xué)傳感器的亞硝酸根（NO2-） 檢測(cè)范圍及檢測(cè)限，外加電壓為0.83 V。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Origin、Digital Micrograph、Jade 等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以及圖形處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 修飾電極材料的形貌表征

通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）和高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）對(duì)Co3O4/Ni foam 納米復(fù)合材料的形貌進(jìn)行了表征。 如圖2（a）所示，未生長(zhǎng)金屬氧化物的泡沫鎳骨架表面平滑，可為納米材料生長(zhǎng)提供大的表面。由圖2（c）中可以看到在金屬泡沫鎳架構(gòu)上均勻地嵌插生長(zhǎng)著許多梭狀顆粒；進(jìn)一步放大觀察倍數(shù)后（如圖2（e）所示)，可以看到Co3O4納米顆粒均勻地嵌插在泡沫鎳架構(gòu)上， 由3～5 μm 的針狀團(tuán)簇組成。 這種特殊的結(jié)構(gòu)能夠使材料充分接觸電解液，從而提高電子傳輸性能，利于電解液的滲透，使得催化劑能夠與電解質(zhì)有更多更大的接觸面積，能夠?yàn)榇呋磻?yīng)提供更多的反應(yīng)活性位點(diǎn)，有利于提高電催化性能。 結(jié)合HRTEM 圖可以清晰地觀察到晶格條紋，用Digital Micrograph 軟件測(cè)量晶格間距為0.224 nm，對(duì)應(yīng)立方晶相Co3O4的（311）晶面間距，與現(xiàn)有的研究結(jié)果一致[24]，表明成功地合成了Co3O4/Ni foam 納米復(fù)合材料。

2.2 Co3O4/Ni foam 電極對(duì)亞硝酸鹽的電化學(xué)行為

電化學(xué)阻抗譜 （electrochemical impedance spectroscopy，EIS）法可以表征電極材料的電子傳遞電阻，阻抗圖的直線部分表示電子轉(zhuǎn)移過(guò)程受擴(kuò)散控制，半圓部分表示受動(dòng)力學(xué)控制，圓弧半徑越大表明材料對(duì)電子阻礙作用越大[28]。 Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極在含0.1 mol/L KCl 的5 mmol/L Fe（CN）6）3-/4-溶液中的電化學(xué)阻抗譜圖如圖3 所示，設(shè)置電化學(xué)工作站參數(shù)，頻率在0.01～100.00 Hz，頻率數(shù)為50，振幅為0.2 V。從圖3 中可以看出，與Ni foam 電極相比，Co3O4/Ni foam 電極的半圓部分明顯減小， 表明Co3O4/Ni foam 納米復(fù)合材料導(dǎo)電性較好，利于電子傳遞，因此合成的Co3O4/Ni foam 具有良好的導(dǎo)電性，表明該納米復(fù)合材料適用于制備傳感器。

圖3 Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極的電化學(xué)阻抗譜圖Fig. 3 Electrochemical impedance spectra of Ni foam electrodes and Co3O4/Ni foam electrodes

以0.1 mol/L、pH 6.0 的磷酸鹽緩沖液 （PBS 緩沖液）為電解液，加入2 mmol/L NaNO2溶液，測(cè)得Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極的循環(huán)伏安曲線如圖4 所示。 在0～1.2 V 時(shí)，Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極在空白緩沖液中都沒(méi)有氧化峰。 當(dāng)NO2-存在時(shí)，Ni foam 電極沒(méi)有明顯響應(yīng)，Co3O4/Ni foam 電極在0.83 V 處有一個(gè)明顯的氧化峰，峰電流為480 μA，且反向掃描無(wú)還原峰出現(xiàn)，表明NO2-在電解液中發(fā)生了不可逆的氧化還原反應(yīng)，從而表明Co3O4/Ni foam 對(duì)亞硝酸鹽的氧化具有良好的催化能力，能夠增強(qiáng)電極的信號(hào)強(qiáng)度，有助于提高檢測(cè)的靈敏度， 對(duì)亞硝酸鹽的檢測(cè)有良好的電化學(xué)響應(yīng)。NO2-失去電子被氧化成NO3-，引起電流增大，形成電信號(hào)，從而被電化學(xué)工作站檢測(cè)到，NO2-的電化學(xué)電解的機(jī)理[29-30]如下：

圖4 Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極在不同緩沖液中的循環(huán)伏安曲線Fig. 4 Cyclical voltammetry of Ni foam and Co3O4/Ni foam in different solutions

2.3 掃描速率對(duì)Co3O4/Ni foam 電化學(xué)性能的影響

采用循環(huán)伏安法（CV）研究掃描速率（50、100、150、200、250、300 mV/s）對(duì)Co3O4/Ni foam 電催化氧化NO2-的影響，結(jié)果如圖5 所示，隨著掃描速率的增加， 氧化峰的峰電流逐漸增加， 在50～300 mV/s時(shí)，峰電流與掃描速率的平方根（V1/2）呈良好的線性關(guān)系， 所對(duì)應(yīng)的線性方程為y=3.990+0.102x （R2=0.998）， 說(shuō)明NO2-在電極表面的電化學(xué)氧化反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。

圖5 不同掃描速率對(duì)Co3O4/Ni foam 電催化氧化NO2-的影響Fig. 5 Effect of different scanning rates on the catelytic oxidation of NO2-by Co3O4/Ni foam

2.4 電解液pH 對(duì)Co3O4/Ni foam 電化學(xué)性能的影響

亞硝酸鹽的電化學(xué)氧化反應(yīng)過(guò)程中有氫離子（H+）參與，溶液的pH 是氫離子物質(zhì)的量濃度的負(fù)對(duì)數(shù)， 因此溶液的pH 對(duì)亞硝酸鹽的測(cè)定有重要影響。 緩沖液pH 對(duì)電極檢測(cè)NO2-的氧化峰電流的影響如圖6 所示， 在pH 從5.0 增加到6.0 過(guò)程中，氧化峰電流逐漸增大，這可能是由于亞硝酸鈉在酸性條件下易于分解成NO 和NO3-[5]。 當(dāng)pH 為6.0～8.0時(shí)，氧化峰電流逐漸減小，這可能是由于伴隨pH 逐漸增大，氫質(zhì)子不斷減少，導(dǎo)致電催化氧化NO2-變得相對(duì)困難，電信號(hào)減小。 因此，本實(shí)驗(yàn)選用pH 6.0作為后續(xù)研究的最優(yōu)pH。

圖6 緩沖液pH 對(duì)亞硝酸鹽循環(huán)伏安響應(yīng)的影響Fig. 6 Effect of buffer pH on cyclic voltammetry response of nitrite

2.5 Co3O4/Ni foam 的工作曲線和檢測(cè)限

采用計(jì)時(shí)安培滴定法對(duì)不同濃度NaNO2進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖7 所示。在磁力攪拌器均勻攪拌下，恒電壓為0.83 V，100 s 為間隔連續(xù)向0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0） 中滴加10 μL 不同濃度的NaNO2溶液， 得到電流-時(shí)間曲線和峰電流與NO2-濃度的線性關(guān)系圖。 從圖7（a）中可以明顯看出，當(dāng)向PBS 緩沖液中滴加了一定量的NaNO2時(shí)，響應(yīng)電流迅速上升并在3 s 左右達(dá)到穩(wěn)定電流值， 表明該傳感器對(duì)NO2-響應(yīng)靈敏。隨著NaNO2濃度的不斷增加，響應(yīng)電流逐漸增大，在NO2-濃度5～2 100 μmol/L時(shí)，呈良好的線性關(guān)系，線性擬合方程分別為y=6.29+0.001 42x（R2=0.998），y=4.59+0.007 21x（R2=0.999），Co3O4/Ni foam 對(duì)NO2-的檢測(cè)限為3.14 μmol/L，低于已報(bào)道與泡沫鎳相關(guān)的修飾電極的NO2-電化學(xué)傳感器[31-32]，說(shuō)明制備用于檢測(cè)NaNO2的Co3O4/Ni foam 傳感器具有靈敏度高、檢測(cè)限低、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)。

圖7 Co3O4/Ni foam 在0.1 mol/L PBS（ pH 6.0） 緩沖液中對(duì)不同濃度的亞硝酸鹽的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)Fig. 7 Chronoamperometry response of Co3O4/Ni foam to nitrite of different concentrations in 0.1 mol /L PBS solution(pH 6.0)

2.6 電極的選擇性和穩(wěn)定性研究

為了研究Co3O4/Ni foam 電極對(duì)NO2-的選擇性和抗干擾性，選擇食品中常見(jiàn)存在的離子（包括K+、Na+、NO3-、S2-、Cl-、CO32-、苯甲酸根、山梨酸根）作為干擾物質(zhì)代表，干擾離子濃度為0.2 mol/L（NO2-濃度的100 倍）。 在磁力攪拌器均勻攪拌的條件下，分別取上述離子加入到2 mmol/L NaNO2溶液中，通過(guò)計(jì)時(shí)安培滴定法獲得電流-時(shí)間曲線， 從圖8 中可以明顯看出NO2-的氧化峰電流沒(méi)有明顯變化，是因?yàn)橹苽涞腃o3O4/Ni foam 電極對(duì)NO2-具有特異性，當(dāng)干擾離子存在時(shí)只對(duì)NO2-有催化氧化的作用，表明該傳感器有良好的選擇性，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

圖8 Co3O4/Ni foam 在不同離子存在下對(duì)2 mmol/L NO2-檢測(cè)的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)Fig. 8 Chronoamperometry response of Co3O4/Ni foam to 2 mmol/L NO2- detection in the presence of different ions

為了考察Co3O4/Ni foam 電極的穩(wěn)定性，在含有2 mmol/L NaNO2的0.1 mol/L PBS 緩沖液中連續(xù)循環(huán)掃描30 圈，氧化峰電流基本不變，說(shuō)明該傳感器穩(wěn)定性好。 將制備的Co3O4/Ni foam 電極放置于自封袋中，在室溫、干燥的條件下保存，并使用該Co3O4/Ni foam 電極作為工作電極，對(duì)NO2-進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)記錄每天獲得的循環(huán)伏安曲線，20 d 后電流信號(hào)為最初響應(yīng)電流信號(hào)的96.5%（見(jiàn)圖9），表明Co3O4/Ni foam 電極長(zhǎng)期儲(chǔ)藏后也是穩(wěn)定的。 以上結(jié)果表明Co3O4/Ni foam 電極具有良好的穩(wěn)定性。

圖9 連續(xù)記錄存放20 d 的Co3O4/Ni foam 在含有2 mmol/L NO2-的緩沖液中的循環(huán)伏安曲線Fig. 9 Continuous record of the cyclic voltammetry curves of Co3O4/Ni foam stored for 20 days in buffer solution containing 2 mmol/L NO2-

2.7 對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)

購(gòu)買醬牛肉作為待測(cè)樣品， 進(jìn)行加標(biāo)回收檢測(cè)。各取2 g 上述樣品搗碎置于50 mL 離心管中，加入25 mL 緩沖液， 渦旋振蕩混勻2 min， 再超聲10 min， 保證固相分散均勻， 加入硫酸鋅使蛋白質(zhì)沉淀，然后置于75 ℃水浴20 min，取出冷卻至室溫過(guò)濾，保留濾液待用，然后加入亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次平行檢測(cè)（n=3）。 Co3O4/Ni foam 傳感器檢測(cè)濾液中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.8 mg/kg， 低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014 規(guī)定的最大殘留量30 mg/kg， 如表1 所示， 根據(jù)研究結(jié)果計(jì)算可得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為3.82%～4.74%， 加標(biāo)回收率為97.9%～101.2%。 研究結(jié)果表明，基于Co3O4/Ni foam 構(gòu)建亞硝酸鹽電化學(xué)傳感器成功應(yīng)用于實(shí)際食品中亞硝酸鹽的檢測(cè)。采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.33—2016 規(guī)定的分光光度法（鹽酸萘乙二胺法）測(cè)得樣品中的亞硝酸鹽含量[33]，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果基本一致，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，說(shuō)明基于Co3O4/Ni foam 構(gòu)建的電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)肉制品亞硝酸鹽具有準(zhǔn)確性好和穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。

表1 Co3O4/Ni foam 電極對(duì)醬牛肉中亞硝酸鹽的檢測(cè)Table 1 Detection of nitrite in soy sauce beef with Co3O4/Ni foam electrode

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)水熱合成法和高溫煅燒法成功地制備了泡沫鎳基負(fù)載Co3O4納米復(fù)合材料， 構(gòu)建高靈敏度亞硝酸鹽電化學(xué)傳感器。利用SEM 和HRTEM 對(duì)材料的結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行表征， 發(fā)現(xiàn)Co3O4納米顆粒呈針狀均勻覆蓋在泡沫鎳上，能夠加快反應(yīng)時(shí)的電子傳輸速率，增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)。 通過(guò)循環(huán)伏安法、計(jì)時(shí)安培滴定法等電化學(xué)方法研究了Co3O4/Ni foam 傳感器對(duì)NO2-檢測(cè)性能。 Co3O4與泡沫鎳有協(xié)同作用，能提高對(duì)NO2-電催化活性，同時(shí)提高電信號(hào)傳輸速率，傳感器的線性響應(yīng)范圍為5～2 100 μmol/L，最低檢測(cè)限為3.14 μmol/L，該修飾電極制備的亞硝酸鹽電化學(xué)傳感器具有靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性高和可以長(zhǎng)期存放等優(yōu)點(diǎn)，可用于肉制品中亞硝酸鹽快速檢測(cè)。 本研究中基于三維多孔材料與過(guò)渡金屬氧化物結(jié)合制備的Co3O4/Ni foam 傳感器，為食品中亞硝酸鹽的快速檢測(cè)提供了新思路。