張少平, 鞠玉棟, 李洲, 練冬梅, 吳松海, 賴正鋒, 洪建基

遮陰對(duì)檸檬香茅類黃酮及其合成酶基因差異表達(dá)研究

張少平, 鞠玉棟*, 李洲, 練冬梅, 吳松海, 賴正鋒, 洪建基

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建 漳州 363005)

為了解檸檬香茅()中類黃酮及其合成酶基因信息，以陽(yáng)光直射及遮陰環(huán)境下生長(zhǎng)的檸檬香茅嫩葉為材料，進(jìn)行代謝組、轉(zhuǎn)錄組結(jié)合qRT-PCR驗(yàn)證分析。結(jié)果表明，檸檬香茅中含有11類共69種黃酮化合物，其中蘆丁、去甲基托羅沙黃酮、紫云英苷及葡萄糖醇等類黃酮化合物在遮陰環(huán)境下相對(duì)含量顯著降低；類黃酮生物合成涉及10類酶54個(gè)基因，其中類黃酮3′羥化酶(c99177.1)等4個(gè)酶基因在遮陰環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而異黃酮合成酶(c51975.0)等6個(gè)酶基因相對(duì)表達(dá)量正好相反；其中5個(gè)類黃酮合成酶基因在光照及遮陰檸檬香茅中的上下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中FPKM值變化一致，而二者檢測(cè)結(jié)果中差異表達(dá)倍數(shù)存在差異。遮陰使檸檬香茅中大多黃酮類化合物相對(duì)含量降低，而其合成酶基因上下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)規(guī)律不明顯。

檸檬香茅；類黃酮；代謝產(chǎn)物；合成酶；代謝組；轉(zhuǎn)錄組

檸檬香茅()為禾本科(Poaceae)香茅屬多年生具香味草本植物，廣泛種植于非洲東部及西印度群島等熱帶地區(qū)，中國(guó)福建、臺(tái)灣、廣東、廣西及海南有栽培[1]。檸檬香茅具有特殊檸檬香氣，傳統(tǒng)常用來(lái)烹飪調(diào)味、提取香茅精油及園林造景等[2–3]。近年來(lái)，由于檸檬香茅含有類黃酮等天然抗菌物質(zhì)，在飼料防腐、改善禽畜品質(zhì)、抑菌防病、調(diào)節(jié)機(jī)體功能及提高免疫力等起重要作用, 因此，使用檸檬香茅作為抗生素飼料添加劑，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中展示了很好的應(yīng)用前景[4–6]。類黃酮也叫黃酮類化合物，其母核為2-苯基色原酮的一類重要的多酚類次生代謝產(chǎn)物，具有C6-C3-C6的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)[7]，其所含的多個(gè)酚羥基可清除自由基及抗機(jī)體氧化，是其具有多種生理功能的基本生物學(xué)基礎(chǔ)[8]。類黃酮根據(jù)C環(huán)部分的成環(huán)、氧化、取代等方式差異，可分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮、查爾酮、花青素、橙酮類等以及上述各類的二氫衍生物[9–10]。類黃酮廣泛存在于從苔蘚到種子等各種植物體內(nèi)，參與到植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)中，并對(duì)植物抵抗逆境脅迫起到重要作用[11–12]。類黃酮對(duì)人體具有強(qiáng)大的生物活性，如抗菌消炎、抗氧化延緩衰老、清熱解毒、抗癌防癌、治療心腦血管疾病及保持健康方面等多種功效[13–15]。類黃酮合成途徑大致分為前期和后期兩個(gè)階段[16]，前期合成包括了查爾酮合酶()、查爾酮異構(gòu)酶()和黃烷酮3-羥化酶()，它們是參與所有下游類黃酮生物合成途徑的共有基因[17]。類黃酮合成途徑中原花青素和花青素的后期合成基因則包括了類黃酮3′-羥化酶()、類黃酮3′5′-羥化酶()、二氫黃酮醇還原酶()、花青素合酶()和類黃酮-3--葡糖基轉(zhuǎn)移酶()[18]；無(wú)色花青素還原酶()和花青素還原酶()分別催化無(wú)色花青素形成黃烷-3-醇(如兒茶素)和催化花青素形成表-黃烷-3-醇(如表兒茶素)[19]；此外，黃酮合酶()控制著黃烷酮向黃酮的轉(zhuǎn)化，而黃酮醇合酶()則將二氫黃酮醇催化為黃酮醇[20]。

香茅的研究主要集中在精油(揮發(fā)性單萜)的提取及應(yīng)用等方面[21–23]。目前，并未見(jiàn)香茅類黃酮相關(guān)研究報(bào)道，而植物類黃酮成分鑒定、功效評(píng)價(jià)以及類黃酮代謝過(guò)程中相關(guān)基因的遺傳調(diào)控等一直為研究熱點(diǎn)[24–26]。然而，隨著香茅種植面積擴(kuò)大及所需土地利用率的提高，香茅種植常出現(xiàn)間作及套種等栽培模式，因此香茅常在光線不夠充足環(huán)境下種植生長(zhǎng)。本研究以光照和遮陰下的檸檬香茅為材料，通過(guò)代謝組檢測(cè)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析檸檬香茅類黃酮差異成分及合成代謝相關(guān)差異表達(dá)酶基因信息，為進(jìn)一步完善香茅種植模式及進(jìn)行香茅類黃酮具體成分功效評(píng)價(jià)、生物合成相關(guān)基因工程等研究打下良好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為福建漳州當(dāng)?shù)胤N植的檸檬香茅()，初夏分株繁殖種植于試驗(yàn)盆中，其中3盆放置大田陽(yáng)光照射充足處，另3盆放置大田覆蓋遮光率為60%的遮陽(yáng)網(wǎng)。分株種植3個(gè)月后，取光照及遮陰環(huán)境下生長(zhǎng)的兩組檸檬香茅嫩葉各6份，每組3份嫩葉進(jìn)行代謝組學(xué)比較分析, 另3份進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較分析，同時(shí)在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究的光照及遮陰兩組檸檬香茅嫩葉中，各取1份進(jìn)行目的基因qRT-PCR驗(yàn)證，3次重復(fù)。

1.2 代謝組學(xué)測(cè)定及類黃酮成分篩選

分別取光照及遮陰環(huán)境下生長(zhǎng)的檸檬香茅嫩葉，各3次重復(fù)共6份材料。每份樣品依次通過(guò)冷凍干燥機(jī)(Scientz-100 F)干燥，研磨儀(MM 400, Retsch)研磨，甲醇提取液提取，取上清及微孔濾膜過(guò)濾, 濾液存放進(jìn)樣瓶中進(jìn)行超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析[27]?；诎龠~客公司所建的采用化學(xué)標(biāo)品結(jié)合同公共庫(kù)的二級(jí)譜圖進(jìn)行比對(duì)建立的數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB (metware database), 通過(guò)二級(jí)譜信息進(jìn)行檸檬香茅代謝物的定性定量, 進(jìn)一步進(jìn)行類黃酮代謝物的篩選，相對(duì)含量取平均值。

1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)定及類黃酮合成酶篩選

分別取光照及遮陰環(huán)境下生長(zhǎng)的檸檬香茅嫩葉，各3次重復(fù)共6份材料。每份樣品依次進(jìn)行RNA提取，等量混合組成RNA池，磁珠富集mRNA, 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，連接測(cè)序接頭，制備測(cè)序文庫(kù)，PCR富集測(cè)序樣本，Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析[28]。進(jìn)一步進(jìn)行類黃酮合成代謝相關(guān)酶基因篩選，相關(guān)合成酶基因相對(duì)表達(dá)量取3次重復(fù)的平均值。

1.4 差異基因qRT-PCR分析

從用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的檸檬香茅嫩葉中，挑選光照(標(biāo)號(hào)：陽(yáng)1-1)和遮陰(標(biāo)號(hào)：陰1-1)各1個(gè)樣本的總RNA進(jìn)行OD值測(cè)定，質(zhì)量合格的檸檬香茅總RNA采用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書中的反應(yīng)體系及條件，合成兩種環(huán)境下生長(zhǎng)的檸檬香茅嫩葉cDNA，以其為模板，進(jìn)行其中5個(gè)類黃酮合成酶基因的qRT-PCR檢測(cè)(相關(guān)合成酶基因及其引物序列見(jiàn)表1)，每個(gè)合成酶基因檢測(cè)3次，結(jié)果取平均值。

表1 熒光定量PCR分析的5個(gè)基因及所合成的引物

2 結(jié)果和分析

2.1 代謝組檢測(cè)類黃酮化合物

代謝組分析光照及遮陰環(huán)境下生長(zhǎng)的檸檬香茅嫩葉，進(jìn)一步進(jìn)行類黃酮具體成分及其相對(duì)含量比較分析。結(jié)果表明，檸檬香茅所含類黃酮化合物共69種(表2)，具體包括黃酮化合物24種、黃酮醇13種、黃烷酮7種、黃烷醇2種、異黃酮10種、查爾酮7種、花青素2種以及紫檀素、原花青素、黃酮聚合物和橙酮類各1種。絕大多數(shù)類黃酮化合物在光照環(huán)境下相對(duì)含量偏高，尤其黃酮中蘆丁、去甲基托羅沙黃酮、葒草素阿拉伯呋喃糖苷和鼠李糖基人參素，黃酮醇中紫云英苷，異黃酮中葡萄糖醇等代謝物在光照環(huán)境下相對(duì)含量顯著提高。然而黃酮中芹菜素鼠李糖苷，黃酮醇中淫羊藿屬苷C和槲皮素二甲醚異戊酸，異黃酮中刺芒柄花素昆布苷和刺芒柄花苷等少量代謝物在光照環(huán)境下相對(duì)含量更低。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲類黃酮合成酶基因信息

轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析光照及遮陰環(huán)境下生長(zhǎng)的檸檬香茅嫩葉，進(jìn)一步進(jìn)行類黃酮合成酶基因及其相對(duì)表達(dá)量比較分析。結(jié)果表明，檸檬香茅所含類黃酮生物合成中編碼10類酶的54個(gè)家族基因(表3)，具體包括9個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、12個(gè)、2個(gè)、4個(gè)、1個(gè)、4個(gè)、7個(gè)和4個(gè)。光照和遮陰環(huán)境下的類黃酮合成酶基因相對(duì)表達(dá)量極低且差異表達(dá)不明顯，只有(c99177.1、c102417.0)、(c98575.0)、(c99741.0)等4個(gè)基因在光照環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量更高;而(c103029.3)、(c97610.0)、(c64180.0)、(c51975.0)、(c99356.0、c102638.1)等6個(gè)基因在遮陰環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量更高。

2.3 差異表達(dá)基因qRT-PCR檢測(cè)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，選擇光照和遮陰環(huán)境下生長(zhǎng)的檸檬香茅中FPKM值差異明顯的5個(gè)類黃酮合成酶相關(guān)基因(表4)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，該5個(gè)參與類黃酮合成酶基因中的3個(gè)下調(diào)、2個(gè)上調(diào)與轉(zhuǎn)錄組中FPKM值變化一致(圖1)，而二者檢測(cè)結(jié)果中的差異表達(dá)倍數(shù)存在一定差異。

3 結(jié)論和討論

香茅研究主要集中在精油提取、功效評(píng)價(jià)及利用等，目前并未見(jiàn)香茅類黃酮相關(guān)成分研究報(bào)道, 而植物類黃酮成分鑒定、功效評(píng)價(jià)以及類黃酮代謝過(guò)程中相關(guān)基因資源克隆及轉(zhuǎn)基因利用等一直為研究熱點(diǎn)[29–31]。同時(shí)，隨著香茅種植面積擴(kuò)大及所需土地利用率的提高，香茅種植出現(xiàn)間作及套種等栽培模式，因此香茅常在光線不夠充足環(huán)境下生長(zhǎng)。本研究以光照和遮陰兩組檸檬香茅為材料進(jìn)行代謝組檢測(cè)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，代謝組學(xué)研究獲得檸檬香茅中11類共69種類黃酮化合物，絕大多數(shù)類黃酮化合物在光照環(huán)境下相對(duì)含量偏高，尤其黃酮中葒草素阿拉伯呋喃糖苷、鼠李糖基人參素和蘆丁, 黃酮醇中紫云英苷，異黃酮中葡萄糖醇等代謝物在光照環(huán)境下相對(duì)含量顯著提高。光線不足會(huì)影響檸檬香茅生長(zhǎng)期的生物產(chǎn)量[1]，本研究表明，遮陰極大地降低檸檬香茅類黃酮的整體含量，這與前人[32]報(bào)道提高光照強(qiáng)度能顯著提高植物類黃酮含量相吻合。本研究表明黃酮中芹菜素鼠李糖苷，黃酮醇中淫羊藿屬苷和槲皮素二甲醚異戊酸, 異黃酮中刺芒柄花素昆布苷和刺芒柄花苷等少量類黃酮代謝物在光照環(huán)境下相對(duì)含量更低。

同行數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。下同

Data followed different letters in the same line indicate significant differences at 0.05 level. The same below

表4 熒光定量PCR分析檸檬香茅中5個(gè)差異表達(dá)基因

圖1 5個(gè)差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證。*: P<0.05

轉(zhuǎn)錄組研究檸檬香茅所含類黃酮生物合成中編碼10類酶的54個(gè)基因中，、、等4個(gè)基因在光照環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量更高；而、、等6個(gè)基因在遮陰環(huán)境下相對(duì)表達(dá)量更高。雖然檸檬香茅中存在大量類黃酮合成相關(guān)家族酶基因，但在光照和遮陰環(huán)境下差異表達(dá)明顯的只有少數(shù)，這少數(shù)差異表達(dá)的類黃酮合成酶基因與類黃酮總體含量趨勢(shì)相關(guān)性不明顯，這主要是因?yàn)轭慄S酮化合物種類繁多，其生物合成路線復(fù)雜，不同合成酶基因只與其中某類(或某幾類)黃酮化合物關(guān)聯(lián)性密切[14]，如、、、、和等催化花青素及黃酮醇和原花青素的合成,這些酶基因中的和催化二氫黃酮醇轉(zhuǎn)換成不穩(wěn)定的花色素，然后催化這些不穩(wěn)定的花色素發(fā)生糖基化反應(yīng)，形成有色的相對(duì)比較穩(wěn)定的花色素苷；原花青素的合成從無(wú)色花青素和花色素經(jīng)過(guò)或催化形成兒茶素或表兒茶素；多酚氧化酶催化無(wú)色花青素分子加入到兒茶素或表兒茶素形成原花青素多聚體；原花青素和花青素的合成過(guò)程中使用共同的底物，因此這些平行途徑之間存在的競(jìng)爭(zhēng)可能是決定花青素或原花青素合成的重要調(diào)控機(jī)制。此外，類黃酮合成受內(nèi)部因素相關(guān)合成酶基因影響外，還與其轉(zhuǎn)錄因子如、和等密切相關(guān)，同時(shí)類黃酮合成還與外部因素如光照、溫度、水分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等外部因素有關(guān)，因此，在遮陰和光照環(huán)境下，檸檬香茅中少數(shù)差異表達(dá)的類黃酮合成酶基因與類黃酮總體含量趨勢(shì)相關(guān)性不明顯。

綜上，檸檬香茅富含類黃酮化合物，其合成酶基因種類繁多且含有大量家族基因。遮陰不僅會(huì)抑制檸檬香茅的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而且同時(shí)降低了檸檬香茅中大多數(shù)類黃酮化合物的相對(duì)含量，但類黃酮合成代謝相關(guān)酶基因上下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)規(guī)律不明顯。

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Effects of Shading on Secondary Metabolites and Their Synthase Genes of Flavonoid in

ZHANG Shaoping, JU Yudong*, LI Zhou, LIAN Dongmei, WU Songhai, LAI Zhengfeng, HONG Jianji

(Subtropical Agriculture Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou 363005, Fujian, China)

In order to understand the gene information of flavonoids and their synthase in, the metabolome, transcriptome and qRT-PCR were studied by using young leaves ofgrowing in sunlight and shade. The results showed thatcontained 69 flavonoids belonging to 11 kinds. The contents of flavonoids, such as rutin, demethyltorosaflavone, astragalin and glucosylorobol etc., decreased under shade environment. The flavonoid biosynthesis involved 10 kinds of enzymes encoded by 54 genes. The expressions of 4 genes, such as(c99177.1), decreased significantly under shade environment, while those of 6 genes, such as(c51975.0) etc., were opposite. The up- or down-regulation expression trend of 5 flavonoid synthase genes under light and shading was consistent with the change ofFPKM in transcriptome sequencing, however, there was difference in the differential expression multiples between the two methods. Therefore, Shading could decrease the relative content of flavonoid in, but the relative expression of synthetase genes was irregular whether up or down regulation.

; Flavonoid; Metabolite; Synthase; Transcriptome; Metabolome

10.11926/jtsb.4658

2022-04-21

2022-06-17

福建省公益類科研院所專項(xiàng)(2020R1030001)；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CXTD2021006-3)；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新平臺(tái)專項(xiàng)(CXPT202103)資助

This work was supported by the Special Project for Public Welfare Research Institutes in Fujian (Grant No. 2020R1030001), the Project for Youth Innovation Team of FAAS (Grant No. CXTD2021006-3), the Special Project for Platform for Science and Technology Innovation of FAAS (Grant No.CXPT202103).

張少平(1975年生)，男，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事功能植物次生代謝產(chǎn)物研究。E-mail: zspnc@163.com

. E-mail: 303443553@.qq.com