李旺,顧曉明,安冬,朱偉云,潘龍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心/江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點實驗室/動物科技學(xué)院消化道微生物研究室,江蘇 南京 210095)

玉米是我國飼料工業(yè)的主要能量飼料原料。隨著畜牧業(yè)的高速發(fā)展,我國玉米資源需求陡然增加,但玉米產(chǎn)量的增幅較小,導(dǎo)致玉米供不應(yīng)求。此外,在中美貿(mào)易摩擦、非洲豬瘟流行和新冠病毒疫情等因素的影響下,玉米價格也急劇攀升,進一步導(dǎo)致我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)成本增高。因此,可替代的能量飼料原料的開發(fā)與應(yīng)用迫在眉睫。

高粱(SorghumbicolorL.)是我國五大谷物之一,種植歷史悠久,種質(zhì)資源豐富。高粱因具有類似玉米的營養(yǎng)價值和種植優(yōu)勢而逐漸受到關(guān)注。目前,國內(nèi)種植的高粱主要用于釀造工業(yè),通常高粱含有較高的單寧含量,這降低了單胃動物尤其是豬對高粱的蛋白質(zhì)和淀粉等養(yǎng)分利用效率,從而限制了國產(chǎn)高單寧高粱這一非常規(guī)飼料原料在飼料工業(yè)中的應(yīng)用。因此,如何高效利用高粱養(yǎng)分成為研究的焦點之一。

聚乙二醇(PEG)是一種非離子型水溶性高分子聚合物,因其具有良好的生物相容性、無毒副作用且價格低廉等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品以及飼料等多個行業(yè)中。聚乙二醇因含有大量的氧原子,能夠與單寧中的羥基以氫鍵形式結(jié)合,形成穩(wěn)定的聚乙二醇-單寧復(fù)合物,因此常常被用來屏蔽飼料中單寧的抗營養(yǎng)特性。由于聚乙二醇是一種惰性、不可吸收的分子,聚乙二醇-單寧復(fù)合物在pH值2.0～8.5都很穩(wěn)定,并且在沸水、中酸性洗滌劑和其他有機溶劑中都不溶解[1],聚乙二醇-單寧復(fù)合物在動物腸道環(huán)境中不易被降解,會被排除體外。在富含單寧的飼料中添加聚乙二醇可以有效阻止單寧的抗營養(yǎng)特性,提高飼料的營養(yǎng)價值[2-3],尤其應(yīng)用于采食富含單寧草料的反芻動物飼料中[4]。Jones[1]和Waghorn[2]在綜述中相繼描述了聚乙二醇屏蔽單寧抗營養(yǎng)作用的特性和應(yīng)用,目前在豬、禽、鼠和羊等多種動物飼料中均有其研究及應(yīng)用的報道。此外,聚乙二醇緩解單寧抗營養(yǎng)特性的體外和體內(nèi)的試驗效果均很明顯[5-6]。因此,綜合安全性、穩(wěn)定性以及屏蔽單寧的效果,聚乙二醇具有提高高單寧高粱養(yǎng)分利用效率的巨大潛力。

本試驗主要通過體外仿生消化方法,模擬高粱原料在豬前腸道中化學(xué)酶消化作用和后腸道中微生物發(fā)酵過程,在高單寧高梁(單寧含量為50 mg·g-1兒茶素當量)原料中添加不同濃度的聚乙二醇探究其對高粱養(yǎng)分降解效率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料國產(chǎn)高單寧高粱,單寧含量50 mg·g-1(以兒茶素計),總能17.30 MJ·kg-1,粗蛋白含量8.41%,淀粉含量60.04%,粗脂肪含量1.73%,中性洗滌纖維含量12.42%,酸性洗滌纖維含量4.21%,粗灰分1.42%,總磷0.12%,鈣0.07%,以上均以風(fēng)干物質(zhì)為基礎(chǔ),以質(zhì)量分數(shù)表示。原料經(jīng)粉碎后過孔徑 380 μm 篩后備用。

1.1.2 試劑聚乙二醇(相對分子質(zhì)量6 000,PEG-6000)購自上海瑞永生物科技有限公司;胃蛋白酶(來源于豬胃黏膜,USP級,1∶30 000)、氯霉素(純度98%)、香蘭素和(+)/-兒茶素(AR級,99.5%)購自上海源葉生物科技有限公司;胰酶(來源于豬胰腺,USP級)購自上海晶純生化科技股份有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

采用單因素隨機試驗設(shè)計,在高單寧高梁原料中分別添加0、25、50、100和250 mg·g-1的聚乙二醇(PEG添加量/高粱單寧含量比值分別為0、0.5、1、2和5)為處理,每個處理設(shè)置5個重復(fù)。

1.3 高粱樣品的體外酶解

稱取4 g粉碎過篩后的國產(chǎn)高單寧高粱樣品于500 mL三角瓶中,加入280 mL胃緩沖液(pH2.0)、2 mL 的氯霉素(5 g·L-1,以防酶解過程中出現(xiàn)細菌污染)和8 mL 20 g·L-1的胃蛋白酶,然后置于39 ℃的搖床中以50 r·min-1轉(zhuǎn)速在體外條件下消化4 h。經(jīng)過4 h體外模擬胃蛋白酶酶解反應(yīng)后加入100 mL小腸緩沖液(pH7.15),再調(diào)整三角瓶內(nèi)溶液pH值為6.0～7.0,然后加入8 mL胰液素(400 g·L-1),酶解 16 h,用尼龍布過濾后收集殘渣,制樣,分別測定風(fēng)干物質(zhì)、能量和氮素的消失率。養(yǎng)分消失率=(原料養(yǎng)分-酶解后殘渣養(yǎng)分)/原料養(yǎng)分×100%。

1.4 高粱樣品酶解殘渣的體外發(fā)酵

1.4.1 培養(yǎng)基配制量取910 mL蒸餾水于細頸瓶中,依次加入0.6 g氯化鉀、0.6 g氯化鈉、0.2 g氯化鈣、0.5 g硫酸鎂、1.46 g磷酸二氫鉀、3.55 g磷酸氫二鈉,再加入微量元素、氯化血紅素和脂肪酸溶液各10 mL以及1 mL刃天青和50 mL碳酸氫鹽溶液。放入微波爐中加熱至沸騰,通二氧化碳至常溫(形成無氧環(huán)境),配成微生物培養(yǎng)液。分裝前加入1 g半胱氨酸鹽酸鹽,并用0.2 mol·L-1鹽酸或0.2 mol·L-1氫氧化鈉將pH調(diào)至6.8左右。

1.4.2 菌群接種液制備稱取100 g來自2頭育肥豬(約120 kg)的盲腸-結(jié)腸混合食糜于滅菌錐形瓶中,與 1 L滅菌的PBS充分混合,用4層滅菌紗布過濾。在接種物的制備過程中,用二氧化碳氣體充氣保持厭氧狀態(tài)。

1.4.3 體外發(fā)酵過程準確稱取0.5 g胃蛋白酶-胰液素酶解殘渣置于250 mL發(fā)酵瓶中,每個發(fā)酵瓶中添加微生物培養(yǎng)液85 mL,加入1 mL還原劑和1 mL維生素磷酸鹽溶液,通入二氧化碳后迅速用橡膠塞封閉,再迅速揭開橡膠塞,依次在每個發(fā)酵瓶中加入菌群接種液10 mL,繼續(xù)通入二氧化碳數(shù)秒,然后迅速將發(fā)酵瓶用橡膠塞塞緊并用鋁蓋密封,放入已經(jīng)預(yù)熱至39 ℃的搖床中進行體外發(fā)酵。同時取3個發(fā)酵瓶,只加入微生物培養(yǎng)液,作為空白對照,用于后期數(shù)據(jù)校正。發(fā)酵48 h后用冰袋終止發(fā)酵,用尼龍布過濾收集殘渣,用去離子水洗滌殘渣。將殘渣放入65 ℃烘箱中烘干、回潮、稱重后用于樣品分析。

1.5 縮合單寧的檢測

在50 mL離心管中加入1 g高粱原料樣品和10 mL甲醇,在室溫(25 ℃)下,在磁吸攪拌器上以 450 r·min-1攪拌離心管24 h(避光),然后在4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min。離心后的液體在4 ℃保存[7]。將200 μL酸化香蘭素試劑加入50 μL的甲醇提取液中,置于96孔板,使用酶標儀測定吸光值(A492),以相同條件處理的香蘭素試劑樣品作為空白對照,以兒茶素標準品制作標準曲線[7]。單寧含量以每克樣品中兒茶素當量表示。

1.6 測定方法

干物質(zhì)量、能量和氮素含量均按照張麗英[8]的方法進行測定;能量采用微機全自動量熱儀(SJLRY-502T,河南鶴壁三杰儀器儀表有限公司)測定;氮素含量采用凱氏定氮儀(SKD-1800,上海沛歐分析儀器有限公司)進行測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019處理后,使用SAS(Version 9.2)軟件中GLM模型進行方差分析,用Tukey’s test進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚乙二醇添加量對單寧含量的影響

如圖1所示:隨著聚乙二醇(PEG-6000)添加量的增加,可檢測的高粱單寧含量顯著降低(P<0.05),但是各聚乙二醇添加組之間差異不顯著。

圖1 聚乙二醇添加對單寧含量的影響Fig.1 Effect of polyethylene glycol(PEG)on tannin content不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different lower cases mean significant differences at 0.05 level. The same below.

2.2 在胃蛋白酶作用下聚乙二醇對高粱養(yǎng)分消失率的影響

在胃蛋白酶的作用下(圖2),隨著聚乙二醇添加量的增加,高粱的干物質(zhì)、氮素和總能的消失率線性升高(P<0.05)。25 mg·g-1聚乙二醇處理組的高粱干物質(zhì)和氮素的消失率顯著高于對照組(P<0.05),但是顯著低于50、100、250 mg·g-1聚乙二醇處理組(P<0.05);50、100、250 mg·g-1聚乙二醇處理組的高粱總能消失率顯著高于對照組(P<0.05);除氮素消失率外,50、100和250 mg·g-1的聚乙二醇處理組之間(聚乙二醇添加量/單寧含量比值為1、2和5)的高粱養(yǎng)分消失率無顯著差異(P>0.05)。

圖2 聚乙二醇對高粱養(yǎng)分的體外胃蛋白酶酶解效率的影響Fig.2 Effects of PEG on pepsin enzymatic hydrolysis efficiency of sorghum nutrients in vitro

2.3 在胃蛋白酶-胰液素作用下聚乙二醇對高粱養(yǎng)分消失率的影響

在胃蛋白酶-胰液素的作用下(圖3),隨著聚乙二醇添加量的增加,高粱養(yǎng)分中的干物質(zhì)、氮素和總能的消失率呈線性升高(P<0.05)。25 mg·g-1聚乙二醇處理組的高粱養(yǎng)分消失率顯著高于對照組(P<0.05),但顯著低于50、100、250 mg·g-1聚乙二醇處理組(P<0.05);50、100、150 mg·g-1聚乙二醇處理組之間的高粱養(yǎng)分消失率無顯著差異(P>0.05)。

圖3 聚乙二醇對高粱養(yǎng)分的體外胃蛋白酶-胰液素酶解效率的影響Fig.3 Effects of PEG on pepsin-trypsin enzymatic hydrolysis efficiency of sorghum nutrients in vitro

2.4 在胃蛋白酶-胰液素-微生物作用下聚乙二醇對高粱養(yǎng)分消失率的影響

從圖4可知:在胃蛋白酶-胰液素-微生物的作用下,隨著聚乙二醇添加量的增加,高粱的風(fēng)干物質(zhì)、氮素和總能的消失率呈線性升高(P<0.05)。25 mg·g-1聚乙二醇處理組的高粱養(yǎng)分消失率顯著高于對照組(P<0.05),但顯著低于50、100、250 mg·g-1聚乙二醇處理組(P<0.05);而50、100、150 mg·g-1聚乙二醇處理組之間的高粱養(yǎng)分消失率無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

高粱單寧的酚羥基可以與多糖、蛋白質(zhì)和金屬離子等發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),抑制動物機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[9]。聚乙二醇能夠通過其含有的大量氧原子與單寧中酚羥基以氫鍵形式結(jié)合,形成穩(wěn)定的聚乙二醇-單寧復(fù)合物,從而競爭性絡(luò)合高粱單寧,釋放與高粱單寧絡(luò)合的養(yǎng)分。因此,聚乙二醇可以被用作高粱單寧的吸附劑。本試驗結(jié)果顯示,聚乙二醇可以顯著提高高單寧高粱養(yǎng)分的體外消失率。由于單胃動物采食富含單寧的飼料相對較少,所以聚乙二醇在單胃動物飼料中應(yīng)用的報道較少;在類似反芻動物飼料中研究表明,在富含單寧的日糧中添加聚乙二醇可以提高體外產(chǎn)氣速率,消除單寧帶來的負面影響[10];聚乙二醇可以提高綿羊的刺槐采食量、氮沉積量、微生物氮產(chǎn)量和日增重[11];在富含縮合單寧的牧草中添加聚乙二醇顯著提高了綿羊采食量、飼料養(yǎng)分消化率、料重比、氮保留率和平均日增重[12]。此外,聚乙二醇作為單寧的吸附劑可以顯著提高綿羊?qū)︼暳橡B(yǎng)分的消化[13]。上述研究均表明,在動物日糧中添加聚乙二醇可以消除單寧的負面影響并提高養(yǎng)分的消失率,本試驗結(jié)果與之相符。

飼料養(yǎng)分在動物胃腸中的降解率是衡量飼料營養(yǎng)價值的重要指標。肖敏敏等[14]研究發(fā)現(xiàn),聚乙二醇可以緩解高粱單寧提取物的負面影響,并提高氮素消失率;李大彪等[15]研究也發(fā)現(xiàn),聚乙二醇可以提高富含單寧檸條的體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量和微生物蛋白量。本試驗通過體外模擬胃和小腸酶的消化,聚乙二醇提高了高單寧高粱養(yǎng)分的消失率,推測可能因為聚乙二醇與單寧絡(luò)合形成難溶解的聚乙二醇-單寧復(fù)合物,由于聚乙二醇是一種惰性分子,在酸堿環(huán)境下不易降解,從而消除了單寧的負面影響。此外,Nsahlai等[6]研究指出,高粱單寧可以降低消化酶的活性,而聚乙二醇可以提高體外酶的活性。因此,聚乙二醇提高高粱養(yǎng)分消失率的原因可能是聚乙二醇不僅可以與單寧絡(luò)合成不溶的聚乙二醇-單寧復(fù)合物,釋放高粱養(yǎng)分,還可以緩解高粱單寧對消化酶活性的負面影響,提高消化酶與養(yǎng)分的接觸機會。

本試驗結(jié)果還顯示,當聚乙二醇添加量達到與高粱中單寧含量等比例后,再提高聚乙二醇添加量對高粱養(yǎng)分的降解率并沒有顯著影響。Salem等[11]試驗發(fā)現(xiàn),放牧綿羊采食含有單寧的藍葉相思,補充含有6%、12%、18%和24%聚乙二醇的精料后,其生長性能呈線性增長,且當聚乙二醇添加比例為18%時,氮排泄和生長性能達到最佳水平,但當聚乙二醇添加過量反而導(dǎo)致綿羊氮的沉積量和排泄量增加。李大彪等[15]通過體外試驗研究發(fā)現(xiàn),聚乙二醇/檸條單寧含量比例為4∶1時,檸條體外干物質(zhì)24 h降解率最高。Silanikove等[16-17]報道,山羊(聚乙二醇/單寧含量比為1∶4～1∶8)和綿羊(聚乙二醇/單寧含量比為1∶2)飼料中添加聚乙二醇可完全中和縮合單寧對動物采食量的負面影響;Tiemann等[18]報道,在熱帶灌木豆類(單寧含量50 g·kg-1)中添加與單寧含量等比例的聚乙二醇,即可消除縮合單寧對瘤胃發(fā)酵的負面影響,且對瘤胃發(fā)酵沒有副作用,本試驗結(jié)果與之一致。本研究發(fā)現(xiàn),當聚乙二醇添加量和單寧含量比例≥1∶1時均可以顯著提高養(yǎng)分的消失率,綜合經(jīng)濟成本考慮,建議以聚乙二醇添加量與高粱單寧含量等比例為佳。

綜上所述,基于體外仿生消化技術(shù)模擬豬的化學(xué)酶和微生物降解2種消化方式,25、50、100和250 mg·g-1的聚乙二醇可以提高高單寧高粱(單寧含量為50 mg·g-1)養(yǎng)分的體外消失率,建議在高單寧高粱中聚乙二醇添加量應(yīng)與高粱中單寧含量等比例為宜。