于瀟瑋,王創(chuàng),王可,李欣艷,董雷,崔中利,曹慧*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095;2.宣城市宣州區(qū)煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心,安徽 宣城 242000;3.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司蚌埠卷煙廠,安徽 蚌埠 233010)

煙草是全球廣泛種植的非食用經(jīng)濟(jì)作物。中國(guó)煙草的種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一位[1-2]。安徽是我國(guó)重要的煙草產(chǎn)區(qū),煙草的種植對(duì)安徽省的農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著極為重要的推動(dòng)作用[3],但煙草黑脛病、煙草炭疽病、煙草白粉病等病害發(fā)生嚴(yán)重[4],輕則減產(chǎn),重則絕收,嚴(yán)重影響煙草品質(zhì)和產(chǎn)量。因此,在防治煙草病害方面的問(wèn)題亟待解決,以促進(jìn)煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。雖然化學(xué)農(nóng)藥是病害防治高效快速的手段,但其會(huì)通過(guò)滲透、揮發(fā)和遷移等方式滲入土壤水源和大氣等自然環(huán)境中,對(duì)整體生態(tài)環(huán)境造成威脅,同時(shí)也會(huì)嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品生長(zhǎng)質(zhì)量和土壤養(yǎng)分情況[5]。因此,植物致病菌的生物防治被認(rèn)為是保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一項(xiàng)重要措施。

真菌是引起植物病害的常見(jiàn)病原微生物,真菌性病害占植物病害的70%～80%[6]。真菌病害對(duì)作物生長(zhǎng)危害嚴(yán)重,降低作物產(chǎn)量,進(jìn)而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤的功能有密切聯(lián)系[7],土壤微生物群落結(jié)構(gòu)反映土壤的生物功能[8]。植物病原微生物在植株根際定植的數(shù)量是其能否侵染植株的關(guān)鍵因素,土傳真菌病害的發(fā)生與土壤中病原菌數(shù)量有直接的相關(guān)性[9-10]。

黏細(xì)菌(Myxobacteria)屬于δ變形菌綱(Deltaproteobacteria)黏球菌目(Myxococcales),為革蘭氏陰性棒狀桿菌[11]。黏細(xì)菌Myxococcussp. BS是本實(shí)驗(yàn)室分離出的一株生防菌,室內(nèi)和田間試驗(yàn)表現(xiàn)出明顯的生防效果[12]。王婷[12]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)獵物胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.Carotovorum,Pcc)與黏細(xì)菌BS共培養(yǎng)時(shí),獵物能誘導(dǎo)黏細(xì)菌分泌大量的外膜囊泡。黏細(xì)菌分泌的外膜囊泡聚集在Pcc周圍,使Pcc被裂解,由此囊泡在黏細(xì)菌捕食Pcc過(guò)程中具有一定的作用。喬燕等[13]通過(guò)田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌EGB在土傳植物真菌病害控制方面具有良好的防控效果,表明其作為一類新型生防微生物,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的病害控制方面具有重要的應(yīng)用潛力。葉現(xiàn)豐[14]發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌來(lái)源的β-1,6-葡聚糖酶(GluM)通過(guò)對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞壁的水解作用,激活高滲甘油信號(hào)(HOG)途徑及細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累,誘導(dǎo)真菌細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生,造成尖孢鐮刀菌孢子和菌絲的死亡。Dai等[15]的研究表明影響不同堆肥糞便中黏細(xì)菌分布的關(guān)鍵非生物因素(pH和Mg2+)與黏細(xì)菌群落多樣性呈顯著正相關(guān),堆肥可增加黏細(xì)菌群落多樣性并且改良農(nóng)田土壤。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn),施用氮肥引起的土壤酸化是土壤黏細(xì)菌豐度和細(xì)胞密度下降的最重要驅(qū)動(dòng)因素,黏細(xì)菌豐度和細(xì)胞密度是土壤細(xì)菌α和β多樣性的潛在驅(qū)動(dòng)因素。Ye等[17]研究發(fā)現(xiàn),黏細(xì)菌EGB通過(guò)捕食改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu),降低土壤中尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum,FOC)的數(shù)量,抑制由FOC引起的黃瓜枯萎病。Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn),施肥和秸稈覆蓋使小于2 mm土壤組分的細(xì)菌Chao1指數(shù)下降,并且黏細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是土壤微生物多樣性最重要的潛在驅(qū)動(dòng)因素。還有研究表明,微生物菌劑通常會(huì)改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[19]。因此,在種植煙草時(shí)可以添加黏細(xì)菌,利用其生防功能,可以將病原菌數(shù)量控制在發(fā)病閾值內(nèi),從而減小經(jīng)濟(jì)損失[20]。

本文以安徽省宣城市宣州區(qū)的煙稻輪作土壤為研究對(duì)象,運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黏細(xì)菌菌劑和菌肥處理的土壤真菌微生物多樣性、群落組成和組裝過(guò)程進(jìn)行研究,以期分析黏細(xì)菌添加對(duì)土壤中真菌群落產(chǎn)生的影響,為黏細(xì)菌的生物防治功能和土壤微生物區(qū)系調(diào)控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株黏細(xì)菌Myxococcussp. BS是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分離出的一株生防菌。分類上屬于黏球菌目(Myxococcales)黏球菌科(Myxococcacceae)黏球菌屬(Myxococcus),由無(wú)菌兔糞誘導(dǎo)子實(shí)體從土壤中分離獲得。

1.1.2 供試煙草供試煙草為‘云煙97’由宣城市宣州區(qū)煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心提供。

1.1.3 菌劑和菌肥的制備BS菌劑制備:在10 L發(fā)酵罐中添加LBS培養(yǎng)基,按照1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量,將種子液與LBS培養(yǎng)基混合發(fā)酵,發(fā)酵罐轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)速100 r·min-1,通氣量9 L·min-1,30 ℃、發(fā)酵48 h,得到發(fā)酵液,BS菌劑制備完成。

BF菌肥制備:將滅菌后的兔糞研磨成粉末,與打碎的稻秸稈以2∶1(質(zhì)量比)混合,濕熱滅菌2～3次。將BS菌劑以1%的接種量接入上述有機(jī)肥中,調(diào)節(jié)溫度為30～45 ℃,含水量為75%,發(fā)酵4 d,期間不斷翻拋,即得到BF菌肥。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)田位于安徽省宣城市宣州區(qū)文昌鎮(zhèn)(118°28′E—119°04′E,30°34′N—31°19′N),試驗(yàn)田土壤的利用方式為多年煙草-水稻輪作。

試驗(yàn)田分為3個(gè)試驗(yàn)小區(qū),每個(gè)小區(qū)面積為86.4 m2(6 m×14.4 m),設(shè)置3個(gè)處理:CK(不添加任何菌劑或菌肥)、BS(添加菌劑)和BF(添加菌肥)。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)有5壟煙草,壟間距為1.2 m,每個(gè)小區(qū)種植煙草32株,株間距0.45 m。壟垂直方向上,不同處理小區(qū)間用1壟煙草苗作為隔離行。壟平行方向上,不同處理小區(qū)間由5株煙草苗隔開(kāi)。隔離區(qū)的煙草苗株距和移栽的煙草苗與處理小區(qū)相同。煙草田間試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)間是2019年5月25日,CK試驗(yàn)區(qū)不施用菌劑或菌肥,作對(duì)照處理;在BS試驗(yàn)區(qū)的每株煙草根際施加5 mL BS菌劑;在BF菌肥試驗(yàn)區(qū)的每株煙草根穴施加10 g發(fā)酵后的BS固態(tài)菌肥。

1.3 土壤樣品的采集

在每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn),每個(gè)采樣點(diǎn)使用五點(diǎn)取樣法采集土壤樣品。土壤采樣器事先經(jīng)消毒處理,將表層土刮去后用土壤取樣器取煙草植株根際處0～20 cm的土壤,去除土壤中石礫和植物殘根,完成單次采樣。按上述操作完成余下采樣,共采集9個(gè)樣品。將采集的土壤裝入自封袋,冷藏運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室,放入-80 ℃冰箱保存,用于后續(xù)土壤總DNA的提取。

1.4 土壤微生物DNA的提取和Illumina高通量測(cè)序

土壤樣品微生物DNA的提取參見(jiàn)試劑盒FastDNATMSpin Kit For Soil(MP Biomedicals,USA)的說(shuō)明書,每個(gè)處理3個(gè)DNA重復(fù)樣品。將各個(gè)處理對(duì)應(yīng)的DNA送至天津諾禾致源生物科技公司進(jìn)行高通量測(cè)序分析。使用Ion S5TMXL測(cè)序平臺(tái),利用單端測(cè)序(Single-End)的方法,構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行單端測(cè)序,對(duì)各個(gè)樣品的土壤總DNA中ITS序列進(jìn)行測(cè)序。引物為ITS1-1F-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAA-GTAA-3′)和ITS1-1F-R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′),對(duì)真菌ITS1可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(30 μL):Phusion Master Mix(2×)15 μL,Primer F(1 mol·L-1)1 μL,Primer R(1 mol·L-1)1 μL,gDNA(1 ng·μL-1)10 μL,ddH2O補(bǔ)足30 μL;PCR擴(kuò)增程序:98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。2 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,使用GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)回收純化產(chǎn)物,之后使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)構(gòu)建文庫(kù),文庫(kù)經(jīng)Qubit定量和檢測(cè)合格后采用Ion S5TMXL平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

使用Cutadapt減去測(cè)序結(jié)果中的低質(zhì)量序列,以97%相似度聚類為操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTU),然后利用UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU序列進(jìn)行物種注釋。

1.5 測(cè)序分析與數(shù)據(jù)處理

為評(píng)估真菌群落的α多樣性指數(shù),使用R包“vegan”計(jì)算Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù),并通過(guò)單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

豐度差異散點(diǎn)圖用于顯示不同OTU豐度變化的差異性。本研究選擇錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)來(lái)調(diào)整P值[21]。使用R包“DESeq2”計(jì)算log2倍數(shù)變化(log2FC)和調(diào)整后的P值。OTU的差異豐度圖是使用R包“ggplot2”構(gòu)建的。使用OriginPro2021(ver.9.80)中的“主坐標(biāo)分析”應(yīng)用程序構(gòu)建PCoA圖。

在HutlabGalaxy網(wǎng)站(https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)應(yīng)用程序1上進(jìn)行線性判別分析(LDA),同時(shí)結(jié)合效應(yīng)大小(LEfSe)測(cè)量,以找到各處理之間的統(tǒng)計(jì)生物標(biāo)志物[22]。

真菌亞群落的組裝過(guò)程是使用“MicEco”包中的“ses.comdistnt”函數(shù)構(gòu)建的[23],使用β平均最近分類單元距離(βMNTD)來(lái)確定群落的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)。同時(shí),通過(guò)空模型分析評(píng)估真菌亞群落的隨機(jī)和確定性生態(tài)過(guò)程[24]。使用R包“iCAMP”[24]定量分析真菌的群落組裝過(guò)程,確定隨機(jī)過(guò)程的擴(kuò)散限制和非主導(dǎo)過(guò)程的比例,以及確定過(guò)程的變量選擇和同質(zhì)選擇的比例。結(jié)合β最近分類單元指數(shù)(βNTI)和通過(guò)模擬得到的Bray-Curtis距離小于實(shí)際觀察到的Bray-Curtis距離的比例(RCbray)來(lái)確定不同生態(tài)過(guò)程對(duì)真菌群落組裝過(guò)程的貢獻(xiàn)度。其中:βNTI>2為變量選擇的影響;βNTI<-2為同質(zhì)選擇的影響;|βNTI|<2且RCbray>0.95為擴(kuò)散限制的影響;|βNTI|<2和RCbray<0.95則用于估計(jì)非主導(dǎo)過(guò)程的影響[23-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加黏細(xì)菌對(duì)土壤真菌多樣性的影響

2.1.1 α多樣性從9個(gè)樣品測(cè)序結(jié)果中共得到575 867條有效序列,將序列按照97%相似水平聚類,共得到1 395個(gè)真菌OTU。通過(guò)Chao1指數(shù)分析(圖1-A)可以發(fā)現(xiàn),添加菌劑和菌肥后,土壤中的真菌豐富度呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì),并且添加菌肥的土壤中真菌豐富度比添加菌劑的土壤中真菌豐富度下降更多。Shannon指數(shù)(圖1-B)結(jié)果表明,添加菌劑和菌肥后BS和BF處理組中的Shannon指數(shù)增加,說(shuō)明群落多樣性增加。

圖1 土壤真菌群落Chao1指數(shù)(A)和Shannon指數(shù)(B)Fig.1 Soil fungal community Chao1 index(A)and Shannon index(B)CK:未處理土壤Untreated soil;BS:添加菌劑土壤Soil with added Myxococcus sp. BS;BF:添加菌肥土壤Soil with added organic fertilizer. 不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences between groups(P<0.05).

2.1.2 β多樣性基于OTU的絕對(duì)豐度,對(duì)土壤中真菌群落進(jìn)行PCoA分析(圖2)。PCoA1的解釋量為42.57%,PCoA2的解釋量為22.2%,2個(gè)坐標(biāo)軸共解釋了64.77%的信息。PCoA2可以很好地將CK與BS、BF分開(kāi),CK全部在PCoA2=0的上方,BS和BF都在PCoA2=0的下方。

圖2 不同處理真菌群落主坐標(biāo)分析(PCoA)圖Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)plots offungal communities in different treatments

使用CK的OTU豐度作為對(duì)照,統(tǒng)計(jì)BF與CK和BS與CK中豐度顯著變化的OTU(圖3)。在BF處理組中,有25個(gè)(1.93%)OTU豐度顯著上調(diào),4個(gè)(0.31%)顯著下調(diào);BS處理中,有49個(gè)(3.67%)OTU豐度顯著上調(diào),25個(gè)(1.87%)顯著下調(diào)。BS較BF處理的OTU變化更顯著,表明單獨(dú)添加BS菌劑較添加菌肥處理對(duì)OTU影響更大。

圖3 不同處理OTU上調(diào)和下調(diào)豐度差異散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of the difference in abundance between up- and down-regulated OTU by treatments每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單獨(dú)的OTU,沿y軸的位置代表與CK相比豐度倍數(shù)的變化。紅色點(diǎn)表示OTU豐度顯著增加,藍(lán)色點(diǎn)表示OTU豐度顯著降低,數(shù)字代表上調(diào)或下調(diào)的OTU總數(shù)。Each dot represents an individual OTU and the position along the y-axis represents the change in abundance multiple compared to CK. Red dots indicate significant increase in OTU abundance,blue dots indicate significant decrease in OTU abundance,and the numbers represent the total number of OTU that were adjusted up or down.

2.2 添加黏細(xì)菌對(duì)土壤真菌群落組成的影響

以相對(duì)豐度從高到低對(duì)樣品中的真菌門進(jìn)行排序,相對(duì)豐度排前10的真菌門的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖 4-A。在3個(gè)處理中,相對(duì)豐度排前10的真菌門的真菌豐度占總真菌數(shù)的58.20%～75.54%。子囊菌門(Ascomycota)在各個(gè)處理組中的相對(duì)豐度均最高,其在CK中的相對(duì)豐度最高(53.22%),在BS處理中的相對(duì)豐度為43.37%,BF處理最低(40.94%)。被孢霉門(Mortierellomycota)的相對(duì)豐度僅次于子囊菌門(Ascomycota),在所有處理組中,其平均相對(duì)豐度為18.10%。與CK相比,BS和BF處理中的球囊菌門(Glomeromycota)的相對(duì)豐度降低。

以相對(duì)豐度排名前10的真菌屬為優(yōu)勢(shì)屬,真菌優(yōu)勢(shì)屬統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4-B。真菌優(yōu)勢(shì)屬結(jié)構(gòu)在不同處理間存在差異。CK處理中的優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度之和為41.53%,高于其他2個(gè)處理組(BS 29.43%,BF 27.16%)。鏈格孢屬(Alternaria)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)和被孢霉屬(Mortierella)在CK中的相對(duì)豐度分別為23.67%、10.19%和4.64%,高于BS(10.07%、5.04%和1.27%)和BF(2.96%、5.95%和4.20%)處理組。其中,莖點(diǎn)霉屬(Phoma)和綠核菌屬(Ustilaginoidea)的相對(duì)豐度在BF處理組中最高(0.74%、1.05%),BS次之(0.16%、0.53%),CK最低(0.04%、0.15%)。

圖4 不同處理真菌優(yōu)勢(shì)門(A)和屬(B)相對(duì)豐度Fig.4 The relative abundance of the dominant fungal phylum(A)and genus(B)in the different treatmentsOthers表示相對(duì)豐度排前10真菌門之外的所有真菌門的豐度總和?！癘thers”represents the sum of the abundances of all fungal phylums except the top 10 phylums in relative abundance.

2.3 不同處理下真菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

通過(guò)線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)方法分析多級(jí)物種的差異,以發(fā)現(xiàn)CK、BS和BF中差異顯著物種,結(jié)合LDA效應(yīng)值(linear discriminant analysis effect sizes,LEfSe)與P值比較各組中真菌物種豐度對(duì)差異效果的影響,篩選出差異物種(LDA≥ 2.0,P<0.05)。如圖5所示:在CK中,發(fā)生顯著變化的真菌差異物種有7個(gè),分別來(lái)源于雙擔(dān)菌綱(Geminibasidiomycetes)、Geminibasidiales、陸生壺菌科(Terramycetaceae)、Geminibasidiaceae、叢孢菌屬(Arthrobotrys)、Boothiomyces和雙子擔(dān)子菌屬(Geminibasidium),差異物種相對(duì)豐度為0.42%;在BS處理中發(fā)生顯著變化的真菌差異物種有5個(gè),分別來(lái)源于銀耳科(Tremellaceae)、Helotiales_fam_Incertae_sedis、赤霉菌屬(Gibberella)、隱球菌屬(Cryptococcus)和Apiotrichum,差異物種相對(duì)豐度為0.15%;在BF處理中,發(fā)生顯著變化的真菌差異物種有8個(gè),分別來(lái)源于葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)、銀耳目(Tremellales)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)、生赤殼科(Bionectriaceae)、Hypocreales_fam_Incertae_sedis、螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)、綠核菌屬(Ustilaginoidea)以及葡萄座腔菌科中未被鑒定的屬,差異物種相對(duì)豐度為4.47%。

圖5 不同處理中真菌LEfSe進(jìn)化分支圖(A)和LDA值柱狀分布圖(B)Fig.5 Branch diagram of LEfSe evolution(A)and Histogram of LDA values(B)of fungi in different treatments

2.4 添加黏細(xì)菌后土壤真菌群落組裝機(jī)制

βNTI能夠明確微生物群落變化受確定性或隨機(jī)性因素影響的大小。大部分真菌OTU都存在于|βNTI|<2的范圍內(nèi)(圖6-A),說(shuō)明真菌群落組裝過(guò)程是以隨機(jī)性過(guò)程為主導(dǎo)。其中,CK的隨機(jī)性過(guò)程占62.96%,BS處理中隨機(jī)性過(guò)程占66.67%,BF處理中隨機(jī)性過(guò)程比70.73%。在加入黏細(xì)菌之后,確定性過(guò)程的比例逐漸減小,隨機(jī)性過(guò)程的比例逐漸增加。為進(jìn)一步深入探究群落組裝機(jī)制,計(jì)算RCbray的值(圖6-B)。隨機(jī)性過(guò)程的擴(kuò)散限制對(duì)群落組裝的貢獻(xiàn)最大,其在CK、BS和BF處理中依次增加,分別是51.85%、55.56%和62.96%。確定性過(guò)程中的同質(zhì)選擇在CK、BS和BF中依次降低,分別是18.52%、11.11%和7.41%。隨機(jī)性過(guò)程中的未主導(dǎo)過(guò)程也依次降低?？傮w而言,添加菌劑增加真菌群落組裝中擴(kuò)散限制的比例,而添加菌肥則進(jìn)一步增加了擴(kuò)散限制的占比。

圖6 不同處理中土壤真菌群落的βNTI值(A)和不同生態(tài)過(guò)程對(duì)真菌群落組裝的貢獻(xiàn)(B)Fig.6 βNTI values of soil fungal communities under different treatments(A)and the contribution ofdifferent ecological processes to fungal community assembly(B)

3 討論

微生物是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動(dòng)力,調(diào)控著土壤能量流動(dòng)和養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程[25],因此在土壤中增加具有特殊功能的微生物制劑能夠改變土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的活性狀態(tài),改善土壤營(yíng)養(yǎng)狀況,進(jìn)而調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)將黏細(xì)菌Myxococcussp. BS制備為微生物菌劑(BS)和菌肥(BF)分別添加到土壤中,發(fā)現(xiàn)土壤中真菌OTU數(shù)量和Chao1指數(shù)都呈下降趨勢(shì),而Shannon指數(shù)升高,表明真菌豐富度降低,但多樣性和均勻度升高,這與劉海洋等[26]在棉田土壤中施用微生物菌劑的研究結(jié)果相似。黏細(xì)菌具有廣譜性捕食真菌的能力[27],黏細(xì)菌菌劑或菌肥施入煙草-水稻輪作的土壤中,可能對(duì)土壤中某些真菌(如本試驗(yàn)中的鏈格孢菌)產(chǎn)生優(yōu)先捕食作用,造成真菌種類減少,呈現(xiàn)Chao1指數(shù)下降和Shannon指數(shù)升高的變化特征。本試驗(yàn)中,BF比BS對(duì)微生物群落組成的影響更大,具體表現(xiàn)為Chao1指數(shù)從大到小的處理依次為CK、BS、BF,Shannon指數(shù)從大到小的處理依次為BF、BS、CK,上述結(jié)果表明以黏細(xì)菌配施有機(jī)肥會(huì)增強(qiáng)黏細(xì)菌的捕食作用,這可能是因?yàn)榫蕿轲ぜ?xì)菌的生長(zhǎng)提供了更多營(yíng)養(yǎng),而黏細(xì)菌的“狼群捕食”策略[28]需要捕食性細(xì)菌達(dá)到足夠的細(xì)菌密度[29]。

大量研究表明,向土壤中添加微生物菌劑會(huì)改變?cè)嫉奈⑸锶郝浣M成,從而達(dá)到有效控制土傳真菌病害的發(fā)生、提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì),以及改善土壤的微生物環(huán)境等目的[30-32]。從本研究中發(fā)現(xiàn),添加黏細(xì)菌后鏈格孢屬(Alternaria)的相對(duì)豐度降低。鏈格孢屬是一種寄主范圍廣泛的植物病原菌[33],可造成多種作物的嚴(yán)重病害。Li等[34]的研究表明,由于黏細(xì)菌分泌的β-1,6-葡聚糖酶可以水解真菌細(xì)胞壁,添加黏細(xì)菌會(huì)使稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的相對(duì)豐度降低。同樣,鏈格孢屬相對(duì)豐度降低極有可能是黏細(xì)菌的專性捕食作用引起的。

闡明群落組裝的機(jī)制是微生物生態(tài)學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵主題[35]。外源添加菌劑/菌肥可能會(huì)改變微生物群落的組裝機(jī)制,不同的添加物可能會(huì)使微生物群落組裝向著不同的方向發(fā)展[36-37],而量化確定性和隨機(jī)性過(guò)程對(duì)群落組裝的影響至關(guān)重要。對(duì)本研究中的群落組裝過(guò)程分析表明,CK、BS和BF都是以隨機(jī)性過(guò)程為主導(dǎo)且占比逐漸增大,擴(kuò)散限制貢獻(xiàn)最大,這與Jiao等[38-39]的研究結(jié)果類似。Xun等[40]研究了微生物α多樣性對(duì)微生物群落組裝的隨機(jī)性/確定性過(guò)程的影響,發(fā)現(xiàn)在高的微生物多樣性條件下群落隨機(jī)性組裝過(guò)程占據(jù)主導(dǎo)地位;Zhang等[41]在研究長(zhǎng)期保護(hù)性耕作的玉米-小麥輪作土壤中真菌群落的響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn),常規(guī)耕作處理組的Chao1多樣性指數(shù)最高、Shannon多樣性指數(shù)最低,其群落組裝過(guò)程由隨機(jī)性過(guò)程主導(dǎo)。這表明黏細(xì)菌添加會(huì)使煙稻輪作土壤中真菌群落的組裝過(guò)程更加隨機(jī),同時(shí)以有機(jī)肥配施黏細(xì)菌菌劑較單一菌劑施用具有更好的生防效果。