尚培駿姬乃春楊錦雯趙沅杰拓振杰張曉華

（1. 西安醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，西安 710021；2. 陜西省腦疾病防治重點實驗室／西安醫(yī)學院運動健康研究中心，西安 710021；3. 廈門大學神經(jīng)科學研究所／福建省神經(jīng)退行性疾病及衰老研究重點實驗室，福建 廈門 361005）

動物行為學實驗為研究大腦認知功能、情緒功能和相關病理生理學提供重要依據(jù)，現(xiàn)已成為神經(jīng)病理學理論重要支撐之一［1］。 不同于人類的認知功能可通過讀寫等直觀方式反映，動物的認知功能需要通過測量其學習記憶等方面體現(xiàn)進行評價［2］。在眾多實驗動物中，小鼠等嚙齒類動物因其喜歡探索陌生事物和環(huán)境的天性［3］，成為典型動物行為學模型之一。 在行為學實驗過程中，實驗者可借助實驗器材創(chuàng)造多種合適的刺激點與刺激條件，以便更好地觀測小鼠運動能力、探索行為、學習記憶行為等，進而幫助研究基因工程小鼠的學習記憶能力、觀察小鼠的用藥反應情況、評價藥物的安全性和可靠性，為研究疾病發(fā)病機制等提供重要依據(jù)。 目前，學習記憶相關行為已被認為是探索人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病最簡單、直接且安全的研究方法［4］。 隨著記憶學研究的快速發(fā)展，學習記憶理論不斷涌現(xiàn)，實驗動物模型發(fā)展道路也在不斷向前，各類型記憶被不斷地發(fā)現(xiàn)、定義，為神經(jīng)生理學和心理學提供研究基礎［5］。 目前主要的學習記憶相關行為學方法包括各種迷宮、曠場實驗、新物體識別實驗、情景恐懼實驗、轉(zhuǎn)棒疲勞實驗等。 但究竟在何種情況下采用何種實驗方法沒有精確地劃分。

《柳葉刀》2020 年發(fā)布的一項報告顯示，全球約有5000 萬人患有癡呆癥，預計這一數(shù)字到2050 年將增加到1.52 億［6］。 目前65 歲以上老年人患有阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的比例約占11%，85 歲以上的老年人患病比例更是高達42%。APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠是AD 主要的動物模型之一，該小鼠表達突變的人類早老素（Presenilin1，PS1） （DeltaE9） 和人鼠淀粉樣前蛋白融合體（APPswe）［7］，這兩個基因的表達都由小鼠朊病毒蛋白啟動子啟動［8］。APP基因是AD 病理癥狀之一老年斑成分人淀粉樣蛋白β（Amyloid β，Aβ）的前體蛋白。 人類早老素基因DeltaE9 突變是該基因的第9個外顯子缺失產(chǎn)生的［9］，此突變會導致早發(fā)性老年癡呆癥［10］。 因此，為了探索學習記憶相關行為學的特點，本研究通過分析對比APP／PS1 小鼠和野生型小鼠在不同行為學實驗中的運動能力、新物體識別能力以及學習與記憶能力的表現(xiàn)，綜合各實驗的優(yōu)缺點和評價指標，闡述各種行為學實驗的特點和應用特點，為研究者采取合理的行為學實驗方法提供更好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級C57BL／6J 背景的APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因健康小鼠和野生型C57BL／6J 雄性健康小鼠，3 月齡各60 只、6 月齡各95 只；3 月齡體重22.7 ～25.2 g；6月齡體重29.5 ～34.5 g，購于北京華阜康生物科技有限公司【SCXK（京）2019－0008】，飼養(yǎng)于西安醫(yī)學院實驗動物中心【SYXK（陜）2022－04】，環(huán)境溫度維持（23 ± 1）℃，12 h 光照循環(huán)。 除T 迷宮實驗期間進行饑餓處理外，小鼠其余時間均自由采食、飲水。動物行為學實驗全程在西安醫(yī)學院SPF 級動物行為室進行，遵循實驗動物福利倫理審查指南【GB／T35892－2018】，經(jīng)西安醫(yī)學院動物倫理委員會審批（XYLS 2019016）。

1.1.2 主要試劑與儀器

APP、PS1 引物 （ 金斯瑞， RP10004CN、RP10009CN），50 × TAE（生工，B548101），瓊脂糖（吉至，9012-36-6），DNA ladder 核酸燃料（碧云天，D0139），4 × Taq Master Mix，8 × DNA 緩沖液（碧云天， D0072）， DL2000 DNA marker （ 賽默飛，SM1391），新潔爾滅（利爾康，30701122），75%乙醇（利爾康，ri5FTXeVtZj5），蒸餾水。 T 迷宮（Noldus，T-Maze）、Y 迷宮（Noldus，Y maze）、新物體識別探索箱（ Noldus， PhenoTyper ）、 曠場箱 （ Noldus，PhenoTyper）、疲勞轉(zhuǎn)棒儀（眾實科技，ZB ～200），動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)（Noldus EthoVision XT）、小動物行為學視頻記錄與分析系統(tǒng)（Panlab SMART 3.0），攝像頭（SONY，F(xiàn)CB-EW9500H）。

1.2 方法

1.2.1 Y 迷宮

Y 迷宮是基于嚙齒動物對新環(huán)境的自發(fā)探索能力而設計的實驗裝置，由三個完全相同的臂組成、三個臂之間為120°夾角，呈Y 字形分布（如圖1）。小鼠在前一次的記憶基礎上做出下一次進臂選擇，令其不斷進出各個臂［11］，是測量動物學習記憶能力的典型方法。 根據(jù)分析小鼠探索進入各臂的次數(shù)、順序進而反映實驗動物的瞬時記憶能力（instantaneous memory）［12］。 相比于其他實驗方法，Y 迷宮更加偏向于工作記憶，在加工存儲短時間內(nèi)記憶的能力有更為直觀地表現(xiàn)［13］，較為簡便且無需動物學習任何規(guī)則來進行趨利避害［14］，有一定的實用性。

圖1 Y 迷宮示意圖Figure 1 Schematic diagram of Y maze

實驗選用3 月齡、6 月齡的AD 小鼠與WT 小鼠各20 只進行實驗，實驗開始隨機選取一臂為起始臂并將小鼠放置于起始臂末，讓小鼠進行自由探索8 min， 記錄小鼠運動軌跡與進臂次數(shù)N，記錄小鼠運動軌跡的自主交替進臂數(shù)（alternation，如ABC）：計算自主交替率，即alternations／（N-2）、在探索結(jié)束一臂后返回上一探索臂的自主返回數(shù)（return，如ABA）以及在兩次連續(xù)探索同一臂的自主重復數(shù)（repeated）的自主返回率和自主重復率［15］。

注意事項：（1）Y 迷宮三臂內(nèi)部各有不同標記，協(xié)助小鼠分辨三臂。 （2）每組小鼠隨機從不同的起始臂進入，每只小鼠實驗完成后需用乙醇、新潔爾滅、蒸餾水依次擦拭迷宮，消除因上一只小鼠氣味遺留造成的影響。 （3）實驗期間實驗人員切勿隨意走動，切勿移動實驗設備或發(fā)出噪音。 （4）小鼠行為學實驗期間，應保持室內(nèi)環(huán)境接近飼養(yǎng)環(huán)境溫度，過高或過低會導致小鼠產(chǎn)生煩躁或戰(zhàn)栗，使其拒絕探索。 （5）以小鼠尾根進入虛線位置（見圖1虛線）為進臂標準。

1.2.2 T 迷宮

T 迷宮由一起始臂以及兩對稱的目標臂構(gòu)成，起始臂（start arm）和目標臂（goal arm）夾角90°。 相較于其他實驗，T 迷宮利用動物覓食行為和對周圍環(huán)境探索的習性［16］，在測定動物學習與記憶能力中的長時記憶方面擁有更高的準確性［17］。 實驗以小鼠是否選擇正確目標臂為標準，對小鼠的學習和記憶能力進行評判［18］。 T 迷宮通常用來研究動物的空間工作記憶（spatial working memory），即測定動物在一定規(guī)則下對有用的信息的記憶存儲及提取。經(jīng)改進后的T 迷宮實驗方法也可用來評價參考記憶（reference memory），即小鼠自己與記憶產(chǎn)生聯(lián)系后，探究小鼠行為與記憶之間的相互影響［19］。 常見的T 迷宮有誘導探索型實驗（Ⅰ型T 迷宮）與懲罰型實驗（Ⅱ型T 迷宮）兩種。

Ⅰ型T 迷宮，通過借助食餌，誘導小鼠探索迷宮［20］。 誘導探索階段，在迷宮各臂放置2 ～3 個食餌，誘導小鼠探索迷宮3 min，適應3 d。 待小鼠完全適應迷宮之后，在兩目標臂末端放置食餌后隨機關閉一臂（如圖2 單虛線）。 實驗選用6 月齡AD 小鼠和WT 小鼠各10 只進行實驗，實驗開始將小鼠放于起始臂末端開始計時，讓小鼠自由覓食，直至小鼠接觸食餌，停止計時，此段時間記為訓練時間；待小鼠離開食餌區(qū)域，將小鼠帶離迷宮，一段時間后（適應階段間隔5 s，實驗階段第1 次間隔20 s、第2 次間隔1 min 重復實驗）將小鼠重新放回起始臂，打開封閉臂閘門，讓小鼠自由探索，在新的、有食餌的臂（即原封閉臂）和舊的、無食餌的臂進行選擇，以第1 次進入目標臂為評判標準，若進入原封閉臂記得分為1，反之為0；在接觸食餌后停止計時，記為記憶時間。 1 h 后再測試一輪［21］。

圖2 T 迷宮示意圖Figure 2 Schematic diagram of T maze

Ⅱ型T 迷宮實驗存在特殊的懲罰機制。 實驗適應階段，讓小鼠在T 迷宮內(nèi)自由探索3 d，每天3 min。 在小鼠熟悉迷宮之后，第4 天讓每只小鼠自主探索T 迷宮3 ～5 次，記錄進入次數(shù)多的一側(cè)，并記為偏好臂［22］。 選用6 月齡AD 小鼠和WT 小鼠各15 只進行實驗，實驗開始，將各小鼠對應偏好臂閘門關閉，迷宮另一臂末端放置食餌。 第一步將小鼠放于起始臂末端讓小鼠自由探索且開始計時，直至小鼠接觸食餌［23］，停止計時并記此段時間為學習時間；間隔10 s 后，將小鼠重新放回起始臂末端，打開偏好臂閘門并開始計時，若小鼠進入非偏好臂（放置食餌的臂）則計得分為1，若小鼠進入偏好臂，計得分為0，并且關閉偏好臂閘門懲罰小鼠，10 s 后打開閘門并繼續(xù)記錄進入非偏好臂次數(shù)，直至再次觸碰非偏好臂食餌［24］停止計時，記此時間段為記憶時間。

注意事項：（1）誘導時應選擇氣味較小的食餌，避免小鼠以嗅覺取代記憶引起實驗誤差。 （2）食餌體積不宜過小，擱置在每臂中央，便于小鼠發(fā)現(xiàn)食餌。 （3）Ⅱ型T 迷宮中小鼠3 min 內(nèi)未探索或Ⅰ型T 迷宮小鼠5 min 內(nèi)未探索則排除此次實驗。 （4）每組實驗完成后，待小鼠停止進食后再將小鼠取出，避免小鼠受到驚嚇造成后續(xù)實驗誤差，每只小鼠做完一輪實驗要采用新潔爾滅、乙醇和水分別擦拭迷宮。 （5）以小鼠尾根部為標準評判是否進臂。

1.2.3 新物體識別

新物體識別實驗是基于人類患有失憶癥時識別環(huán)境的差異而發(fā)展起來的，用于評價嚙齒動物的新物體識別記憶能力與識物記憶。 本實驗基于小鼠在新環(huán)境下自由探索的習性和對新物體的好奇心［25］。 該實驗無需像迷宮實驗，以食物為介控制小鼠，也不需要像轉(zhuǎn)棒疲勞實驗一樣強制小鼠運動，完全依靠小鼠在密閉空間下的自由探索能力，發(fā)現(xiàn)周圍環(huán)境變化。 在小鼠自由記憶的情況下，更能模擬人類學習、記憶的行為，借此用來評估改善記憶藥物的效果［26］。

實驗選用3 月齡、6 月齡AD 和WT 小鼠各25只進行實驗，實驗分為適應階段和測試階段。 在適應階段之前，需進行3 d 的熟悉過程。 實驗人員每天將小鼠放到手上撫觸5 min，借此消除小鼠緊張恐懼感，并熟悉實驗者氣味。 實驗開始前，剔除活動異常小鼠（活動過少、活動過多、轉(zhuǎn)圈等），符合標準的小鼠在無物體箱體中每天自由探索3 min，待3 d后小鼠熟悉實驗箱體內(nèi)環(huán)境［27］，正式開始實驗，實驗步驟如下。 實驗開始：T1 階段，分別在箱體底板對角放置兩完全相同的物體A、B，將小鼠放入密閉環(huán)境的箱體中，讓小鼠在A、B 兩物體周圍探索時間累計25 s（以鼻尖湊近物體約2 ～3 cm 為標準），或3 min 內(nèi)探索時間還不到25 s 則停止探索，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，停止T1 階段。 1 h、24 h 后分別開始短期、長期T2 階段測試，將其中一個物體換成新的物體b，物體放置位置不變，再次將小鼠放入箱體進行探索，當小鼠在A、b 兩物體周圍探索時間累計15 s，或5 min 內(nèi)探索時間還不到15 s 則停止探索，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，停止T2 階段，見圖3。

圖3 新物體識別實驗示意圖Figure 3 Schematic diagram of new object recognition test

注意事項：（1）探索物體的時間需要根據(jù)小鼠的學習能力摸索，與年齡和基因型密切相關［28］。（2）物體可以選擇不同材質(zhì)、形狀和顏色［29］；具有一定重量，防止小鼠推翻；應保證新舊物體存在差異；避免選擇太過鮮艷的顏色，如橙色。 （3）每只動物實驗完成后需擦拭糞便尿液，因?qū)嶒炘诿荛]空間內(nèi)進行，在清潔箱體時切勿用乙醇等刺激性試劑擦拭［30］。 （4）每組實驗完畢后，先取出物體，后取出小鼠，減少對動物的刺激。

1.2.4 曠場實驗

曠場實驗常用于檢測嚙齒動物運動能力、探索能力、活躍性以及對曠場的畏懼程度。 自20 世紀40 年代被學者發(fā)明以來，曠場實驗已經(jīng)被廣泛應用到神經(jīng)生物學研究與生物節(jié)律當中。 曠場實驗一方面利用了動物畏懼空曠場地的天性，激發(fā)動物趨利避害的內(nèi)在特點［31］，用來評價小鼠的運動和情緒行為。 另一方面，利用小鼠在好奇心的驅(qū)使下探索新環(huán)境，曠場也為新物體識別實驗的建立提供一定的前提基礎［32］。

選用6 月齡AD 小鼠和WT 小鼠各15 只進行實驗，實驗開始前，實驗人員應消除小鼠的恐懼。實驗開始將小鼠放入箱體3 min，攝像頭記錄行動軌跡。 通過軟件分析其在中央?yún)^(qū)與周邊區(qū)逗留時間、速度和運動距離，以及直立次數(shù)和理毛行為等，見圖4。

圖4 曠場實驗示意圖Figure 4 Schematic diagram of open-field

1.2.5 轉(zhuǎn)棒疲勞實驗

轉(zhuǎn)棒疲勞實驗為檢測嚙齒動物運動功能、抗疲勞能力和晝夜節(jié)律提供了方法，主要用于運動協(xié)調(diào)性、平衡感測試、抗疲勞藥物篩選和鑒定，也可間接反映動物的晝夜節(jié)律［33］。 實驗期間，當動物被放置在滾筒中央的轉(zhuǎn)棒上時，為避免滑落，需調(diào)整平衡，隨轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)動而跑動。 通過測量動物在滾筒上行走的時間來評定實驗對象的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?4］。

轉(zhuǎn)棒疲勞儀以動物運動時間作為實驗指標，若動物掉落，儀器將自動記錄動物在轉(zhuǎn)棒上的堅持時間以及滑落瞬間轉(zhuǎn)棒的速度。 因小鼠的協(xié)調(diào)性由小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)決定，協(xié)調(diào)性越差的小鼠會在越短時間內(nèi)從轉(zhuǎn)棒下掉落［35］。 轉(zhuǎn)棒疲勞儀運動能力在帕金森病、酒精依賴、亨廷頓病、智力發(fā)育、運動失調(diào)和阿爾茨海默病的藥物評價等研究上，被認為是非常重要的檢測指標［36］。 實驗選用3 月齡、6 月齡AD 和WT 小鼠各15 只進行實驗，實驗適應階段分為三個階段，三個階段間無時間間隙：T1 階段，轉(zhuǎn)棒以加速度5 r／min2從靜止開始勻加速至速度為5 r／min；T2 階段，更改加速度為10 r／min2，加速至15 r／min 后勻速轉(zhuǎn)動2 min；T3 階段，繼續(xù)以加速度10 r／min2加速至20 r／min 后繼續(xù)勻速2 min。 若小鼠在測試過程中掉落，記錄掉落時間［37］，待20 min 后重新對掉落小鼠開始實驗，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上持續(xù)的時間。 小鼠在進行適應實驗期間訓練小鼠體力，加強小鼠協(xié)調(diào)能力。 正式實驗階段，T1、T2、T3 各階段加速度不變，結(jié)束時勻速速度分別達到5 r／min、 15 r／min、18 r／min， 記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒持續(xù)時間。

注意事項：（1）測試期間，舍棄連續(xù)3 次以上實驗失敗的小鼠。 （2）待小鼠穩(wěn)定站立在轉(zhuǎn)棒上時開始實驗。 （3）選擇擁有高摩擦系數(shù)的轉(zhuǎn)棒材質(zhì)。

1.2.6APP／PS1 小鼠的培育

實驗所用APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠品系為APPswe／PSEN1dE9（C57BL／6J），該小鼠攜帶小鼠朊病毒蛋白啟動子啟動下的突變的人早老素基因PSEN1（DeltaE9）和人鼠淀粉樣前蛋白（APPswe）融合體，其中PSEN1 的DeltaE9 突變是該基因的第9個外顯子缺失產(chǎn)生的，此突變會導致早發(fā)性老年癡呆癥。 設計了APP和PSEN1 的引物，序列如表1，進行基因鑒定。 該小鼠在大約4 個月皮層開始出現(xiàn)淀粉樣斑塊，在大約6 個月時海馬中出現(xiàn)淀粉樣斑塊，并且隨著年齡的增長而增加大小和數(shù)量。

表1 APP／PS1 小鼠引物序列Table 1 APP／PS1 mouse primer sequences

1.2.7APP／PS1 基因鑒定

實驗用APP、PS1，兩種引物對小鼠的基因型進行鑒定，當小鼠共同表達APP／PS1 基因時，鑒定為APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因。 小鼠使用雙面耳標進行序列編號，以鼠尾為標本提取DNA。

（1）組織的消化

將Protease Plus 與Buffer L 按1 ∶50 配制，充分混合后向含有樣本的EP 管內(nèi)加入100 μL 新鮮消化液，55℃金屬?。》磻?0 min（確保鼠尾完全浸入消化液中），后將樣本在95℃金屬?。≈蟹跤? min 以滅活反應蛋白酶。 以12 000 r／min 離心5 min 后取含有DNA 的上清液為PCR 模板。

（2）PCR 的擴增

反應體系在配置過程中，最好處于低溫情況下，以確保PCR 擴增的效率以及特異性。 配置比例（見表2）。 將上述配置好的樣本進行PCR 擴增，程序為（見圖5）：①94℃預變性5 min（1 次循環(huán)）；②94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s（35 次循環(huán)）；③72℃充分延伸5 min（1 次循環(huán)）；④擴增結(jié)束4℃保持。

表2 反應體系的配置Table 2 Configuration of reaction system

圖5 PCR 擴增程序Figure 5 PCR amplification procedure

（3）瓊脂糖凝膠電泳

在1 × TAE 溶液中加入2%瓊脂糖，微波加熱充分溶解后，待冷卻至50℃時加入核酸染料，充分混勻后倒入模具。 凝固后浸入含有1 × TAE 溶液的電解槽中待用；DNA 擴增產(chǎn)物與DNA 緩沖液混合后以8～10 μL 每孔上樣，上樣完畢后以120 V 恒壓電泳25 min。

以上各種實驗方法的設備、評價指標、應用特點的比較見表3，各種行為學實驗方法的優(yōu)缺點比較見表4。

表4 不同行為學實驗的優(yōu)缺點比較Table 4 Comparison of the advantages and disadvantages of different behavior tests

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)± 標準誤差（±s）表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 軟件，數(shù)據(jù)通過t檢驗（或mann-whitney 非參數(shù)檢驗），當P＜0.05 為具有顯著性差異，作圖采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件。

2 結(jié)果

2.1 APP／PS1 小鼠基因鑒定

裂解鼠尾提取DNA，經(jīng)PCR 和瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型，核酸凝膠成像結(jié)果顯示，GAPDH內(nèi)參條帶在391 bp，APP基因條帶在344 bp，PS1 基因條帶在608 bp，結(jié)果見圖6 ～8，可以看到編號為288、289、290、292、293、294、296、297、298、352、353、363、365、366、368、371、373、374、375、376、378 和380 小鼠為APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，其余為野生型小鼠。

圖6 GAPDH 鑒定結(jié)果Figure 6 GAPDH identification results

圖8 PS1 基因型鑒定結(jié)果Figure 8 PS1 genotype identification results

2.2 APP／PS1 和WT 小鼠的工作記憶存在差異且均隨月齡增大呈下降趨勢

Y 迷宮可以測試小鼠的工作記憶能力。 6 月齡APP／PS1 小鼠相比于WT 小鼠在自主返回率更高，有顯著性差異性（P＜0.05，圖9），說明同月齡APP／PS1 小鼠工作記憶能力較WT 小鼠差；此外，6 月齡APP／PS1 小鼠的自主交替率較3 月齡小鼠顯著降低（P＜0.05，圖9），自主返回率頻率顯著增加（P＜0.001，圖9），WT 小鼠的自主交替率頻率也隨月齡增加而減少，自主重復率頻率隨月齡增加而增加，但無顯著性差異，見圖9。 以上結(jié)果表明，六月齡APP／PS1 和WT 小鼠工作記憶能力有差異，且APP／PS1 小鼠隨月齡增加工作記憶下降更為明顯。

圖9 3 月齡和6 月齡APP／PS1 小鼠和WT 小鼠Y 迷宮差異比較Figure 9 Comparison of the differences in Y maze of APP／PS1 mice and WT mice at 3 and 6 months of age

2.3 APP／PS1 和WT 小鼠的記憶存儲和提取能力具有顯著性差異

T 迷宮可以同時測試小鼠的學習和記憶能力，能夠反映記憶的存儲和提取。 基于Ⅰ型T 迷宮實驗，發(fā)現(xiàn)6 月齡APP／PS1 小鼠在學習階段的第1 天記憶時間顯著長于WT 小鼠（P＜0.05，圖10A）；在測試階段，第1 天記憶時間顯著長于WT 小鼠（P＜0.05，圖10D），說明小鼠在第1 次學習和記憶環(huán)境下更敏感。 2 d 的測試階段，APP／PS1 小鼠在得分率方面均顯著低于WT 小鼠（P＜0.01，P＜0.05，圖10F，10G）。 說明APP／PS1 和WT 小鼠在學習與記憶時間和準確率之間存在差異，APP／PS1 小鼠記憶提取能力顯著低于WT 小鼠。 基于Ⅱ型T 迷宮，APP／PS1 和WT 兩種小鼠在記憶時間方面未出現(xiàn)顯著性差異，但學習方面，APP／PS1 小鼠學習時間長于WT 小鼠（P＜0.001，圖10H，10I）；APP／PS1和WT 小鼠在得分率無明顯差別，見圖10。 綜上，APP／PS1 和WT 小鼠在記憶的存儲和提取方面存在差異，APP／PS1 小鼠較WT 小鼠記憶存儲時間顯著增加，記憶提取時間增加，記憶準確率降低。

圖10 T 迷宮內(nèi)學習時間、記憶時間與得分Figure 10 Learning and memory duration and scores in T maze

2.4 APP／PS1 和WT 小鼠的新物體識別能力與識物記憶無明顯差異

新物體識別實驗可以測試小鼠的識物記憶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是3 月齡還是6 月齡小鼠，APP／PS1和WT 小鼠對新物體識別記憶均無顯著性差異（P＞0.05），見圖11。 這與文獻報告不同［38］，可能是因為學習階段時長過短或者學習階段和測試階段的時間間隔不同引起的。

圖11 3 月齡和6 月齡APP／PS1 和WT 新物體識別實驗識別參數(shù)Figure 11 Recognition index in the new object recognition test of APP／PS1 and WT mice at 3 and 6 month of age

2.5 APP／PS1 和WT 小鼠的運動能力、探索能力、活躍性以及對曠場的畏懼程度均存在差異

曠場實驗著重于研究小鼠在密閉空間內(nèi)的運動能力、探索能力、活躍性以及對曠場的畏懼程度。實驗表明：APP／PS1 小鼠的運動能力比同月齡WT小鼠弱，表現(xiàn)在規(guī)定時間內(nèi)的運動距離顯著低于WT 小鼠（P＜0.01，圖12A）；因兩種小鼠移動速度也存在顯著性差異（P＜0.01，圖12B），所以說明APP／PS1 小鼠活躍性也比同月齡WT 小鼠的低；與WT 小鼠比較，APP／PS1 小鼠進入中心曠場的次數(shù)同顯著降低（P＜0.01，圖12E），且APP／PS1 小鼠待在曠場中央?yún)^(qū)時間與周圍區(qū)域時間比顯著低于WT 小鼠（P＜0.01，圖12K），可得出結(jié)論，APP／PS1小鼠對曠場的畏懼程度高于WT 小鼠。 另外，APP／PS1 小鼠的直立次數(shù)顯著低于WT 小鼠（P＜0.001，圖12J），說明APP／PS1 小鼠較WT 小鼠的探索能力更弱，更容易對曠場產(chǎn)生畏懼和焦慮，見圖12。 綜上所述，APP／PS1 小鼠的的運動能力、探索能力、活躍性較WT 小鼠更差。

圖12 6 月齡APP／PPS1 和WT 小鼠在曠場實驗的表現(xiàn)Figure 12 Performance of 6-month-old APP／PS1 and WT mice in the open field test

2.6 APP／PS1 和WT 小鼠中樞協(xié)調(diào)能力無明顯差異

轉(zhuǎn)棒疲勞實驗主要檢測小鼠的中樞協(xié)調(diào)能力，經(jīng)實驗，并未發(fā)現(xiàn)APP／PS1 和WT 小鼠在轉(zhuǎn)棒掉落時間方面的差異，說明中樞協(xié)調(diào)能力無顯著性差異（P＞0.05）， 見圖13。 這可能是因為轉(zhuǎn)棒疲勞儀更適用于檢測小鼠的與運動協(xié)調(diào)性相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如亨廷頓舞蹈癥和帕金森病，在學習與記憶方面僅可能作為輔助或參考指標。

圖13 轉(zhuǎn)棒疲勞實驗掉落時間Figure 13 Dlatency to fall of rotarod test

3 討論

動物行為學實驗在藥理學中已被視為基礎實驗方法，同時也越來越多的被應用在精神生理學及精神病理學的基礎研究中，如在帕金森病癥、酒精依賴綜合征、亨廷頓病、智力發(fā)育、運動失調(diào)［39］和阿爾茨海默病的發(fā)病機制研究領域發(fā)揮重要作用［40］。因此，了解和總結(jié)各種行為學實驗的特點和適用范圍非常關鍵，能夠幫助研究者選擇更科學和精準的方法觀察小鼠的行為學。 本文作者采用APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠兩種動物，比較驗證學習記憶相關行為學實驗特點、優(yōu)缺點、注意事項和應用。 采用Y 迷宮、T 迷宮、新物體識別、曠場實驗以及轉(zhuǎn)棒疲勞實驗對兩種小鼠進行全面的對比分析。 5 種行為學實驗各有測試偏重，Y 迷宮測試工作記憶［41］，T 迷宮可以測試學習與記憶能力，特別能夠反映記憶的存儲和提取，新物體識別測試小鼠的新物體識別能力與識物記憶，曠場測試運動能力、探索能力、活躍性以及對曠場的畏懼程度，轉(zhuǎn)棒疲勞測試中樞協(xié)調(diào)能力。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠因受雌激素影響，在行為學實驗中，經(jīng)常表現(xiàn)出異常的行為，如潛伏期過長、易焦慮等情況，通常情況下，行為學實驗選擇雄性小鼠會使實驗結(jié)果更加穩(wěn)定［42］。

基于APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠與WT 小鼠實驗比較發(fā)現(xiàn)，在Y 迷宮中，同月齡的APP／PS1 小鼠與WT 小鼠的工作記憶能力有明顯差異，APP／PS1 小鼠較WT 小鼠自主交替率顯著降低，以及自主返回率顯著增加。 對比不同月齡的同類型小鼠發(fā)現(xiàn)，兩種小鼠的工作記憶能力均隨月齡增加而下降，且APP／PS1 小鼠相比于WT 小鼠下降更明顯。 說明APP／PS1 小鼠工作記憶能力顯著低于WT 小鼠。在T 迷宮中，APP／PS1 小鼠相比于WT 小鼠的學習記憶能力差，表現(xiàn)為記憶的存儲和提取較慢，提取的準確率較差，這與以往的報道是一致的［43］。 在新物體識別實驗中，對比兩種小鼠的新物體識別能力，通過對比兩種小鼠的短時識物記憶和長時識物記憶兩個方面，并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，這與文獻報道不一致，這可能與學習和測試階段的間隔時長存在密切關系［44］，測試和訓練階段間隔24 h，可能兩種小鼠的都遺忘了對舊物體的識別記憶。 在曠場實驗中，WT 小鼠的運動能力、探索能力和活躍性均顯著高于APP／PS1 小鼠，對曠場的畏懼程度和焦慮程度低于APP／PS1 小鼠，也存在顯著差異性。 在轉(zhuǎn)棒疲勞實驗中，APP／PS1 小鼠與WT 小鼠的中樞協(xié)調(diào)能力無顯著差異性。

現(xiàn)如今，越來越多的動物行為學模型被廣泛應用到神經(jīng)系統(tǒng)疾病和藥理學實驗中［45］，這些模型都盡可能去貼合小鼠生性習慣，對多種動物的研究和藥品應用提供路徑。 研究對比了5 種學習記憶相關行為學的特點、優(yōu)缺點、注意事項和應用，發(fā)現(xiàn)Y 迷宮反映小鼠自發(fā)的探索行為，是工作記憶的最佳和最便捷的檢測方法［46］；T 迷宮對學習記憶的檢測更為敏感和細致，能反映記憶的存儲和提??；新物體識別實驗可能需要更好的摸索學習和測試階段的時間間隔，并且需要精確的跟蹤和識別系統(tǒng)；曠場實驗可以作為學習記憶、運動能力、畏懼焦慮行為的綜合指標，可以放在一系列行為學實驗設計的最開始階段，便于觀察者對動物行為有大致的了解；轉(zhuǎn)棒疲勞實驗更適合與運動協(xié)調(diào)能力相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?7］，如帕金森病［48］、亨廷頓?。?9］等。 綜上，為有關神經(jīng)系統(tǒng)疾病行為學實驗的選擇提供了理論基礎、方法借鑒和參考標準。