米傳靚付彬*李思迪陳志達(dá)郭中坤張振宇王可洲*

（1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)院（省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），濟(jì)南 250117；2. 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，濟(jì)南 250000）

脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein，LBP）作為分泌型Ⅰ類急性期蛋白，主要在肝細(xì)胞中產(chǎn)生，并在先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌的外膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是免疫系統(tǒng)最有效的誘導(dǎo)劑之一［2］。 LBP 與LPS 結(jié)合并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［3］。 有研究證明敲除LBP 可以降低LPS 誘導(dǎo)的大鼠炎癥因子水平，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用［4］。 前期研究發(fā)現(xiàn)，Lbp－／－小鼠雖無法正常表達(dá)LBP，但仍會(huì)將LPS 信號(hào)傳遞給靶細(xì)胞引起遲發(fā)炎癥反應(yīng)［5］，表明LPS 誘導(dǎo)信號(hào)傳遞可能存在代償途徑。 因此，以Lbp－／－小鼠為背景研究LPS 信號(hào)傳遞的代償途徑，對(duì)解決由革蘭氏陰性菌引起的炎癥反應(yīng)有重要意義。

血管緊張素受體1a 型（Agtr1a angiotensin Ⅱreceptor， type 1a， Agtr1a）作為G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），含有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的七跨膜螺旋結(jié)構(gòu)?；罨腁gtr1a 將激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)并觸發(fā)多種信號(hào)通道如細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶［6］如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK、c-JunN-末端激酶（JNK）和p38 MAPK［7］。 Agtr1a 的促炎效應(yīng)是通過激活信號(hào)通路來表達(dá)促炎介質(zhì)，如細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子等。 ERK1／2 途徑由多種細(xì)胞表面受體（如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子受體、G 蛋白偶聯(lián)受體等）激活，其被磷酸化激活后轉(zhuǎn)位入核，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β 等炎癥因子的表達(dá)［8］。 本文旨在證明Agtr1a 通過激活MAPK／ERK 通路調(diào)節(jié)LPS 誘導(dǎo)的Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)；氯沙坦是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，主要用于選擇性阻斷AT1 受體［9］，而RNAi 則是通過特定靶點(diǎn)來降低Agtr1a 的表達(dá)，抑制Agtr1a 活性或降低Agtr1a表達(dá)均能有效地降低由LPS 誘導(dǎo)的Lbp－／－小鼠肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)，為L(zhǎng)PS 所致的炎癥治療探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)健康雌性Lbp－／－小鼠10 只，SPF 級(jí)健康雌性C57BL／6J 小鼠4 只，周齡為6 ～8 周，體重20～22 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司【SCXK（魯）2019 0003】，飼養(yǎng)于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK（魯）2019－0007】，并經(jīng)60Co 滅菌。 晝夜各半并循環(huán)照明，溫度控制在22 ～25℃，濕度60% ±5%，飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食、進(jìn)水。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用遵循3R 原則，所有實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理審批（SYDW20220403-1）。

LPS（sigma，L5418），干擾RNA（北京擎科生物科技公司合成），Losartan（Selleck，S1359），RNA 提取試劑盒 （ Omega， R6934-02 ）， Anti-β-actin（Cohension， CPA9100）， Anti-ERK1／2 （Cohension，CPA1944），Anti-p-ERK（Cohension，CPA4924），Anti-AT1（Cohension，CQA8011），Goat Anti-Rabbit IgG（Cohension， CSA1036）， LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，13778-150）。 顯微鏡（ZEISS，德國）， 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo， 德國）， 酶標(biāo)儀（SpectraMax，美國），蛋白電泳和印跡系統(tǒng)（Bio-Rad，美國），凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）Nanodrop（Thermo，德國），熒光定量PCR 儀（Thermo，德國）。

1.2 方法

1.2.1 原代肝細(xì)胞的分離與提取

利用改良版兩步灌流法提取WT 型、Lbp－／－型小鼠原代肝細(xì)胞，將小鼠麻醉后，75%乙醇皮膚消毒，打開腹腔。 用37℃、pH ＝ 7.4 的灌洗液Ⅰ（含有0.375 g／L EGTA 的D-Hanks 溶液）按20 mL／min 流速進(jìn)行肝灌注約30 mL，灌入的同時(shí)剪開肝門靜脈，隨后用灌流液Ⅱ（含0.5 g／L 膠原酶Ⅳ的高糖培養(yǎng)基）灌流約30 mL 至肝軟塌出現(xiàn)皸裂。 剪下肝放置培養(yǎng)皿中，加入15 mL 完全培養(yǎng)基，撕裂肝包膜，形成肝細(xì)胞混懸液，用70 μm 細(xì)胞網(wǎng)濾過，收集濾液。600 r／min，離心3 min，棄上清，重復(fù)3 次。 加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基混勻，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（活細(xì)胞數(shù)＞80%則用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)）。 接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組與LPS 刺激炎癥模型的構(gòu)建

將WT 型小鼠原代肝細(xì)胞分為對(duì)照組（空白對(duì)照）、LPS 組（LPS 刺激）；Lbp－／－型小鼠原代肝細(xì)胞抑制劑法將細(xì)胞分為對(duì)照組A（空白對(duì)照）、LPS 組A（LPS 刺激）、抑制劑組（氯沙坦干預(yù)3 h 后加入LPS 刺激）；Lbp－／－型小鼠原代肝細(xì)胞siRNA 轉(zhuǎn)染法將細(xì)胞分為對(duì)照組B（空白對(duì)照）、LPS 組B（LPS 刺激）、陰性對(duì)照組（si-NC 干擾12 h 后加入LPS 刺激）、干擾組（si-agtr1a 干擾12 h 后加入LPS 刺激）。提取原代肝細(xì)胞后，按照70%細(xì)胞滿度鋪于六孔板，細(xì)胞貼壁過夜后，各對(duì)照組不做處理，其他組均加入LPS 使其終濃度10 μg／mL，刺激時(shí)間12 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 抑制劑處理原代肝細(xì)胞

提取Lbp－／－型小鼠原代肝細(xì)胞，按照70%細(xì)胞滿度鋪于六孔板，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁過夜后，于次日處理細(xì)胞，對(duì)照組A 不做處理，抑制劑組中加入氯沙坦使其終濃度為0.1 μmol／L，3 h 后于LPS 組A、抑制劑組中加入終濃度10 μg／mL LPS 刺激12 h，收集樣品待用。

快要到期末了，我們每天不停地讀書、做卷子，反反復(fù)復(fù)。考完語文考數(shù)學(xué)，考完數(shù)學(xué)考英語，考完英語考科學(xué)。每天的試卷就像雪花一樣飄來，有時(shí)還會(huì)因?yàn)榇中某鲥e(cuò)，吃到家長(zhǎng)的一頓“竹筍烤肉”。

1.2.4 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞

提取Lbp－／－型小鼠原代肝細(xì)胞，按照70%細(xì)胞滿度鋪于六孔板，細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基更換成無雙抗培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，于次日進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，對(duì)照組B 不做處理，陰性對(duì)照組中加入終濃度為50 nmol／L的si-NC，干擾組中加入終濃度為50 nmol／L 的si-agtr1a， 6 ～8 h 后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染12 h 后LPS組B、陰性對(duì)照組、干擾組中分別加入終濃度10 μg／mL LPS 處理12 h，收集樣品待用。 si-agtr1a 的靶向序列為：GCTTGGTGGTGATCGTCAT；正義鏈為：5’-GCUUGGUGGUGAUCGUCAU（dT）（dT） -3’；反義鏈為：5’-AUGACGAUCACCACCAAGC（dT）（dT） -3’。

1.2.5 熒光定量qPCR 檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

用RNA 提取試劑盒提取各組細(xì)胞中RNA，逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，用熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，以2－ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)。 Agtr1a 上游引物序列：5’-CTAAGGCCATTCTACTTGGGGT-3’，下游引物序列：5’-CGAGTGCAGATGCCGATGA-3’；β-actin 上游引物序列：5’-GGCTGTATTCCCCT CCATCG-3’，下游引物序列：5’-CCAGTTGGTAAC AATGCCATGT-3’；IL-1β 上游引物序列：5’-GCAA CTGTTCCTGAACTCAACT-3’，下游引物序列：5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’；TNF-α 上游引物序列：5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3’，下游引物序列：5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’。

1.2.6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率

將細(xì)胞以1 × 104個(gè)／孔接種于96 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。 10 μg／mL LPS 刺激12 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)，3 h 后于酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光值。

1.2.7 Western Blot 法檢測(cè)LBP、Agtr1a、ERK、p-ERK 蛋白

取3 組小鼠原代肝細(xì)胞，加入RIPA 裂解液100 μL 冰上充分裂解，4℃，12 000 r／min 離心10 min 取上清，應(yīng)用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度；待測(cè)樣本加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸變性。 取25 μg 蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（濃縮膠恒壓80 V電30 ～40 min，Marker 進(jìn)入分離膠后110 V 電泳至結(jié)束），半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜（恒壓25 V，電流130 mA，轉(zhuǎn)膜9 min）。 5%脫脂奶粉37℃封閉2 h；加入LBP、Agtr1a、ERK、p-ERK 和β-actin 一抗（1 ∶500 ～1 ∶1000），4℃孵育過夜，1 × TBST 洗滌3 次每次15 min；加入二抗（1 ∶3000 ～1 ∶5000），室溫孵育2 h，1 × TBST 洗滌3 次每次15 min；加入ECL 化學(xué)發(fā)光液，凝膠成像儀顯影，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad 8.4.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞LBP 蛋白表達(dá)量的鑒定

Western Blot 結(jié)果表明，Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞中LBP 蛋白已敲除完全并不再表達(dá)，見圖1。

圖1 LBP 蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 1 LBP protein expression result

2.2 LPS 刺激下Agtr1a 表達(dá)的變化

Western Blot 結(jié)果表明，野生型小鼠原代肝細(xì)胞在LPS 刺激下Agtr1a 蛋白表達(dá)量沒有顯著變化（P＞0.05），如圖2A；Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞LPS 刺激后Agtr1a／β-actin 的比值顯著升高（P＜0.05），加入抑制劑后其Agtr1a 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.001），如圖2B；加入干擾RNA 后，Agtr1a 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.0001），如圖2C。

圖2 LPS 刺激條件下Agtr1a 表達(dá)的變化Figure 2 Changes in Agtr1a expression under LPS stimulation

2.3 抑制Agtr1a 對(duì)Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞存活率的影響

CCK8 結(jié)果顯示，與LPS 組相比，抑制劑組細(xì)胞存活率顯著上升（P＜0.01），如圖3A；干擾組細(xì)胞存活率雖有上升，但無顯著性變化，如圖3B。

圖3 抑制Agtr1a 對(duì)Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞存活率的影響Figure 3 Effect of inhibiting Agtr1a on survival rate of primary hepatocytes in Lbp－／－mice

2.4 抑制Agtr1a 蛋白表達(dá)對(duì)炎癥因子的影響

熒光定量PCR 結(jié)果顯示，加LPS 刺激后，Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞炎癥因子升高；加入抑制劑氯沙坦后，炎癥因子TNF-α、IL-1β 表達(dá)量均顯著降低（P＜0.0001；P＜0.01），即抑制劑抑制Agtr1a 蛋白表達(dá)后，能抑制炎癥的發(fā)生，如圖4A，4B。 同樣，將干擾RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，炎癥因子TNF-α、IL-1β 表達(dá)也會(huì)有顯著性降低（P＜0.01），如圖4C，4D。

圖4 抑制Agtr1a 蛋白表達(dá)對(duì)炎癥因子的影響Figure 4 Effect of inhibitory Agtr1a protein expression on inflammatory cytokines

2.5 抑制Agtr1a 蛋白表達(dá)對(duì)p-ERK 蛋白表達(dá)的影響

在LPS 刺激下，ERK 蛋白磷酸化顯著升高（P＜0.0001），當(dāng)加入抑制劑氯沙坦后ERK 磷酸化顯著性降低（P＜0.01），如圖5A。 同樣，對(duì)原代肝細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染si-agtr1a 后，ERK 磷酸化也顯著性降低（P＜0.001），如圖5B。

圖5 抑制Agtr1a 蛋白表達(dá)對(duì)p-ERK 蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of inhibiting the expression of Agtr1a protein on the expression of p-ERK protein

3 討論

LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的主要脂質(zhì)成分，也是細(xì)菌感染的先天免疫反應(yīng)的主要啟動(dòng)物質(zhì)［10］。LBP 是一種由肝細(xì)胞產(chǎn)生的60 kDa 急性期蛋白［11］。 分布細(xì)胞表面，參與識(shí)別LPS 的第一個(gè)蛋白質(zhì)是LBP。 LBP-LPS 復(fù)合物被轉(zhuǎn)移到CD14 和Toll樣受體TLR4 簇，以觸發(fā)細(xì)胞炎癥因子的釋放，即內(nèi)毒素血癥［12］。 肝作為主要的代謝部位，成為L(zhǎng)PS 攻擊的重要靶器官，高水平的血清LPS 可引起肝細(xì)胞壞死和膽汁淤積，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥可并發(fā)敗血癥，導(dǎo)致感染性休克［13］。 血清LBP 濃度升高可作為細(xì)菌感染的早期診斷標(biāo)志。在重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）收治的成年患者中，血清LBP濃度升高與菌血癥或嚴(yán)重?cái)⊙Y和膿毒癥休克的發(fā)生相關(guān)［14］。 臨床上通過抗生素治療影響Toll 樣受體反應(yīng)來調(diào)節(jié)宿主免疫，從而控制炎癥以及增加細(xì)菌清除，此種治療手段殺死細(xì)菌的同時(shí)會(huì)釋放細(xì)菌來源的壁碎片，這導(dǎo)致了促炎級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)，可能會(huì)對(duì)服用這些抗感染藥物的患者造成更嚴(yán)重的傷害［15］。 宋子晨［16］通過敲除LBP，從源頭阻斷LPS的傳播，可顯著減低大鼠炎癥反應(yīng)。 另有研究表示在LPS 刺激下，激活循環(huán)單核細(xì)胞既不需要LBP 也不需要CD14。 目前尚不清楚這些情況下，LPS 刺激信號(hào)是通過TLRs 簇受體介導(dǎo)，還是通過另一種尚未識(shí)別的途徑介導(dǎo)的［17］，同時(shí)Minter 等［18］也有相似的發(fā)現(xiàn)，也證明了Lbp－／－小鼠和WT 小鼠對(duì)照組體內(nèi)循環(huán)細(xì)胞因子表達(dá)相當(dāng)，在外源性LPS 遞送后，Lbp－／－小鼠和WT 小鼠分離的Kupffer 細(xì)胞上，LPS 受體TLR4、CD14 和CD18 的細(xì)胞因子表達(dá)相當(dāng)，尚不清楚這是否代表敲除小鼠產(chǎn)生了代償機(jī)制。 目前，在對(duì)LBP 蛋白敲除的基礎(chǔ)上研究LPS 刺激的炎癥反應(yīng)鮮有報(bào)道，因此尋找LBP 敲除后替代LBP 傳遞LPS 刺激信號(hào)的代償途徑，將有助于開發(fā)新的治療方案用于由LPS 誘導(dǎo)引起的內(nèi)毒素血癥。

Agtr1a 作為一種細(xì)胞表面的GPCR 蛋白，可以觸發(fā)G 蛋白獨(dú)立的第二信使信號(hào)，激活許多細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，包括蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶MAPKs，MAPK 是慢性損傷時(shí)被激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白［19］。 Agtr1a 缺陷小鼠實(shí)驗(yàn)中表明AT1a 受體在受損肝中介導(dǎo)MAPK 的激活，介導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)展和ERK、c-Jun 的磷酸化。 目前的研究表明AT1a 受體在肝纖維形成中起著重要作用，缺乏AT1a 受體的小鼠對(duì)纖維化刺激后炎癥和纖維化的發(fā)展具有抗性［20］。 另有實(shí)驗(yàn)證明阻斷AT1 受體，即使用AT1 siRNA 可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)［21］，Zhao 等［22］利用血管緊張素Ⅱ受體抑制劑氯沙坦改善了由血管緊張素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞CRP 的表達(dá)，降低了肝炎癥。 以上實(shí)驗(yàn)均表明，Agtr1a 有介導(dǎo)肝損傷的作用，抑制其受體的表達(dá)均會(huì)對(duì)肝損傷有改善。

本研究對(duì)Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行LPS 刺激時(shí)，發(fā)現(xiàn)Agtr1a 蛋白的表達(dá)量顯著上升，在分別加入Agtr1a 抑制劑氯沙坦、si-Agtr1a 后，Agtr1a 蛋白的表達(dá)量顯著下降，ERK 磷酸化呈現(xiàn)顯著性降低，同時(shí)與ERK 相關(guān)的炎癥因子TNF-α、IL-1β 也顯著性下降，Agtr1a 在Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞炎癥的發(fā)生與發(fā)展中起著一定的作用，而對(duì)野生型小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行LPS 刺激時(shí)，Agtr1a 的表達(dá)量并無顯著性變化，由此猜想，Agtr1a 通過激活ERK 蛋白的磷酸化從而促使了Lbp－／－小鼠原代肝細(xì)胞炎癥的發(fā)生，Agtr1a 起到代償LBP 蛋白的作用。 兩種抑制方法相比較而言，利用si-Agt1a 有更好的炎癥抑制效果，而使用抑制劑氯沙坦既可以抑制炎癥也能提高細(xì)胞生存率，如Chan 等［23］在急性肝損傷中應(yīng)用AT1受體抑制劑氯沙坦作為治療方案，結(jié)果表明氯沙坦治療可以防止急性肝損傷的進(jìn)展并使得細(xì)胞存活率升高、肝酶的減少、肝組織學(xué)的得到改善，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了使用抑制劑氯沙坦不僅可以降低肝細(xì)胞炎癥，還能提高細(xì)胞的存活率，這也許是氯沙坦本身特性，其具體機(jī)制還有待探究。 本研究對(duì)炎癥的降低程度還有待提高，或許還有其他代償途徑需要進(jìn)一步探索，也許可以通過聯(lián)合用藥的方式來使LPS 誘導(dǎo)的炎癥有更大程度的降低，為臨床上治療內(nèi)毒素血癥提供有效的參考。