尹碩鑫，敖先偉，李 博，張 濤，陳遠能#（1.南陽市中心醫(yī)院，河南 南陽 7000；.荊州市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 荊州 000；.南陽市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 南陽 7000；.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧 50011）

胃癌是全球第五大常見癌癥[1]，全球每年約有100萬人診斷為胃癌，其中約40%的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在中國[2]。目前，胃癌的主要治療方法包括手術(shù)和放化療，但術(shù)后復發(fā)率高，并且晚期胃癌患者化療后5年生存率低于5%[3]。中醫(yī)藥作為我國醫(yī)療事業(yè)中不可或缺的一部分，不僅能提高化療藥的療效、減少副作用、提高患者生活質(zhì)量，還能減慢腫瘤生長速度、緩解臨床癥狀，在腫瘤患者治療中的應用也日益廣泛。

清熱化濕方為經(jīng)典方“藿樸夏苓湯”加黃連、梔子化裁而成。藿樸夏苓湯出自清代的《醫(yī)原》，能宣通氣機、燥濕利水[4]。本課題組前期研究證實，清熱化濕方能夠防治幽門螺桿菌感染相關的胃癌[5—6]。近年來miRNA與胃癌的關系被廣泛報道。本課題組前期通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中的miRNA-155 會被明顯下調(diào)[7]，且穩(wěn)定沉默miRNA-155 可促進胃癌的進展[8]。此外，有研究顯示，miRNA能夠通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控胃癌細胞的生物學行為[9]?；诖耍狙芯客ㄟ^構(gòu)建胃癌荷瘤裸鼠模型探討清熱化濕方是否能夠通過干預miRNA-155 抑制Wnt/β-catenin 信號通路中Wnt7、β-catenin、T 細胞因子4（T-cell factor-4，TCF-4）表達進而治療胃癌，以期為清熱化濕方的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

IX71 型熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；RM2135 型切片機購自德國Leica 公司；3K15 型低溫冷凍離心機購自德國Sigma 公司；Mini Protean 3 Cell 型電泳儀購自美國BioRad公司；MK3型酶標儀、ChemiScope 5300 Pro 型一體式化學發(fā)光成像儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 藥品與試劑

清熱化濕方（包括藿香6 g、白豆蔻1.8 g、淡豆豉9 g、川厚樸3 g、姜半夏4.5 g、杏仁9 g、赤茯苓9 g、豬苓4.5 g、澤瀉4.5 g、生薏苡仁12 g、黃連12 g、梔子12 g）購自廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院。過表達miRNA-155 慢病毒由漢恒生物科技（上海）有限公司構(gòu)建；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（批號分別為SH30022.01、SH30406.05）均購自美國HyClone 公司；青鏈雙抗（批號E607011）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；嘌呤霉素、Trizol RNA 提取試劑、SYBRGreen PCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號分別為A1113803、15596026、F-415XL、K1622）均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；0.25%胰蛋白酶（批號C0201）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號BL521A）購自廣州碩譜生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號422300）購自北京索萊寶科技有限公司；ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；兔源Wnt 單克隆抗體（批號10605-1-AP）購自美國Proteintech 公司；兔源β-catenin 單克隆抗體（批號ab32572）購自英國Abcam公司；山羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗（批號223120412）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SPF 級裸鼠，雄性，4 周齡，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2021-0010，動物合格證號為202235128。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核批準，批準號為DW20220621-122。

1.4 細胞株

人胃腺癌AGS 細胞購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

2 方法

2.1 清熱化濕方藥液的制備

按處方量稱取清熱化濕方藥材，搗碎，先以8倍量水煮沸30 min，用8層紗布過濾；藥渣再以6倍量水煮沸30 min 后同法過濾；合并兩次濾液，濃縮成質(zhì)量濃度為1 g/mL的藥液（以生藥量計），于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 miRNA-155過表達AGS細胞株的構(gòu)建

將AGS細胞鋪板于培養(yǎng)皿中，密度為5×104個/皿；待細胞匯合度為80%時，以最佳感染復數(shù)（200）進行病毒感染；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換為DMEM高糖培養(yǎng)基；感染72 h 后，加入含5 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行篩選，以后每天用熒光顯微鏡觀察細胞熒光及細胞狀態(tài)，當熒光效率在90%以上時表明miRNA-155 過表達AGS細胞株構(gòu)建成功。

2.3 胃癌荷瘤模型裸鼠的構(gòu)建及分組給藥

將裸鼠適應性喂養(yǎng)1 周后按體重隨機分為模型組、對照組、過表達組和清熱化濕方低、中、高劑量組，每組5只。將裸鼠置于超凈臺內(nèi)，以75%乙醇消毒裸鼠右側(cè)腋部皮膚后，除過表達組裸鼠接種過表達miRNA-155 AGS細胞外，其余各組裸鼠接種AGS細胞懸液（密度為1×107個/mL）。清熱化濕方低、中、高劑量組裸鼠從造模第2 天起分別按2.71、5.43、10.86 g/kg 灌胃相應藥液（劑量參考文獻[10]設置），對照組腹腔注射順鉑（0.004 g/kg）+氟尿嘧啶（0.02 g/kg）（劑量根據(jù)臨床等效劑量換算），每天1次，連續(xù)3周；模型組和過表達組灌胃等體積生理鹽水。末次給藥后禁食不禁水，于24 h后采用頸椎脫臼法處死，并取腫瘤組織進行檢測分析。

2.4 裸鼠腫瘤抑制率的測定

以生理鹽水沖洗各組裸鼠腫瘤組織，然后測量其質(zhì)量，并計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率＝（模型組腫瘤組織質(zhì)量—干預組腫瘤組織質(zhì)量）/模型組腫瘤組織質(zhì)量×100%。

2.5 裸鼠腫瘤組織的病理學形態(tài)觀察

取各組裸鼠部分腫瘤組織，以10%甲醛固定液固定，切開病灶，流水沖洗干凈后放入生物脫水機中逐級脫水、透明、石蠟浸泡、包埋，切片4 μm，以常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色后，采用顯微鏡觀察并拍照。

2.6 裸鼠腫瘤組織中miRNA-155 和Wnt7、β-catenin、TCF-4 mRNA表達水平的檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）法進行檢測。取各組裸鼠腫瘤組織各20 mg，加入Trizol裂解液1 mL后提取總RNA；取適量總RNA將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行PCR 擴增。PCR 反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變 性15 s；循 環(huán)60 次。以U6 或GAPDH為內(nèi)參，采用2—ΔΔCt法計算miRNA-155和目的基因mRNA 的表達水平。PCR 引物序列及擴增產(chǎn)物長度見表1。

表1 PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度

2.7 裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法進行檢測。取各組裸鼠腫瘤組織各20 mg，剪碎，加入250 μL RIPA 裂解液，并加入適量的PMSF 蛋白酶抑制劑，反復吹打裂解，置于冰上2 h后以12 000 r/min 離心10 min；取上清液加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水加熱5 min 變性，采用BCA 試劑盒定量后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜；以4%脫脂奶粉封閉2 h，加入Wnt（稀釋度為1∶1 000）、β-catenin（稀釋度為1∶1 000）、TCF-4（稀釋度為1∶2 000）、GAPDH（稀釋度為1∶1 000）一抗，于4 ℃孵育過夜；以1%TBST洗膜，加入相應二抗室溫孵育2 h；以1% TBST洗膜后加入適量ECL顯色液顯影，采用凝膠成像儀曝光成像，并用Image J軟件分析圖像，以目的蛋白與內(nèi)參的灰度值比值表示其表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用-±s表示。方差齊性時組間比較采用方差分析，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 miRNA-155穩(wěn)定過表達AGS細胞株的構(gòu)建情況

熒光顯微鏡下觀察細胞熒光及細胞狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在嘌呤霉素篩選后，細胞初期死亡較多，熒光較弱；隨著時間延長，細胞狀態(tài)好轉(zhuǎn)，熒光增強且能穩(wěn)定傳代，說明miRNA-155 過表達AGS 細胞株構(gòu)建成功。結(jié)果見圖1。

圖1 miRNA-155過表達AGS細胞株的構(gòu)建過程

3.2 裸鼠腫瘤組織生長情況的觀察結(jié)果

與模型組比較，過表達組、對照組和清熱化濕方中、高劑量組裸鼠腫瘤組織質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05），腫瘤抑制率分別為90.23%、63.79%、27.01%、44.25%。結(jié)果見圖2、表2。

圖2 各組裸鼠腫瘤組織的觀察結(jié)果

表2 各組裸鼠腫瘤組織質(zhì)量和抑制率的測定結(jié)果（n＝5）

3.3 裸鼠腫瘤組織病理形態(tài)學的觀察結(jié)果

模型組裸鼠腫瘤細胞排列緊實，核大且染色較深；與模型組相比，過表達組、對照組及清熱化濕方低、中、高劑量組裸鼠的腫瘤細胞均出現(xiàn)不同程度的排列疏松，核染色較淺，出現(xiàn)壞死灶。其中，過表達組裸鼠腫瘤組織的損傷程度最高，對照組次之；清熱化濕方低、中、高劑量組腫瘤組織的損傷程度表現(xiàn)出劑量依賴性。結(jié)果見圖3。

圖3 各組裸鼠腫瘤組織的病理變化觀察結(jié)果

3.4 清熱化濕方對裸鼠腫瘤組織中miRNA-155、Wnt7、β-catenin和TCF-4 mRNA表達的影響

與模型組比較，過表達組、對照組和清熱化濕方中、高劑量組裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4 mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05），miRNA-155 表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 各組裸鼠腫瘤組織中miRNA-155、Wnt7、β-catenin、TCF-4 mRNA表達水平的檢測結(jié)果（n＝5）

3.5 清熱化濕方對裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4蛋白表達的影響

與模型組比較，過表達組、對照組和清熱化濕方高劑量組裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4 蛋白表達水平，以及清熱化濕方中劑量組Wnt7 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖5。

圖5 各組裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4 蛋白的表達情況

4 討論

中醫(yī)理論認為，胃癌的形成是在脾胃虛寒的基礎上，飲食生冷，感受濕熱寒邪，日久郁積引起的氣血運行不暢；最常見的證型為脾氣虛證、肝胃不和證、痰濕證、熱毒證、血虛證、血瘀證等；治療原則一般以益氣補脾、活血化瘀、清熱解毒為主[4]。清熱化濕方為經(jīng)典方“藿樸夏苓湯”加黃連、梔子化裁而成，可宣化表里之濕邪，對胃癌有一定的療效[11]。

miRNAs 是一種長度為19～25 個核苷酸的短鏈非編碼RNA[12]，已被證明參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。一項研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155是胃癌組織中下調(diào)程度最高的miRNAs之一，可能是胃癌的腫瘤抑制因子[14]，這一結(jié)果與本課題組前期的基因芯片分析結(jié)果一致[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達的miRNA-155可顯著抑制胃癌荷瘤模型裸鼠腫瘤的生長，與上述研究結(jié)果一致。

Wnt/β-catenin 信號通路是一個關鍵的級聯(lián)反應，對許多生理過程至關重要，如細胞增殖和分化、干細胞更新、胚胎發(fā)生和組織穩(wěn)態(tài)[15]。既往研究也提示，Wnt信號通路的病理紊亂可能與胃癌進展有關[16]。其中，Wnt 家族蛋白成員中的Wnt7a蛋白在胃癌組織中高表達，且與患者惡性病理特征顯著相關[17]。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵下游效應因子，當Wnt配體與其膜受體復合體結(jié)合時，β-catenin 穩(wěn)定并在細胞質(zhì)中積累，然后與TCF一起進入細胞核，從而驅(qū)動多重增殖和凋亡相關基因的轉(zhuǎn)錄[18]。本研究證實清熱化濕方能夠上調(diào)miRNA-155表達，抑制Wnt/β-catenin 信號通路中Wnt7、β-catenin 和TCF-4的表達，從而抑制胃癌細胞的生長，進一步闡明了清熱化濕方防治胃癌的效用機制。

綜上所述，清熱化濕方可通過上調(diào)miRNA-155，抑制Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制胃癌荷瘤模型裸鼠瘤體生長。但本研究只對miRNA-155進行過表達處理，未進行沉默，后續(xù)筆者將從正反兩方面研究清熱化濕方和miRNA-155之間的關系，積極闡明清熱化濕方治療胃癌的作用機制，為清熱化濕方在臨床中的應用提供更多、更可靠的循證依據(jù)。