曹慧敏，孔 亮，隋國(guó)媛，吳 瑾，賈連群#（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 0847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6600）

據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)最新發(fā)布的《2020全球癌癥報(bào)告》，肝癌是全球第六大常見(jiàn)癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大常見(jiàn)原因[1]。原發(fā)性肝癌主要有兩種類型——肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝內(nèi)膽管癌，HCC占全世界原發(fā)性肝癌的80%以上。隨著肥胖和糖尿病的流行，非酒精性脂肪肝病相關(guān)肝細(xì)胞癌（non-alcoholic fatty liver disease-hepatocellular carcinoma，NAFLD-HCC）發(fā)病率不斷攀升，非酒精性脂肪肝病已成為全球HCC發(fā)病和死亡增長(zhǎng)最快的病因。相比病毒相關(guān)的HCC，NAFLD-HCC 缺乏有效的治療手段，手術(shù)根治率低，患者病死率高、生存期更短[2]。目前，進(jìn)行腫瘤切除后化療已成為大多數(shù)癌癥治療的主要策略。多柔比星（doxorubicin，DOX）是一線化療藥物，也是肝癌患者全身化療的有效藥物之一，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞核酸的合成發(fā)揮抗腫瘤活性[3]。雖然DOX的作用機(jī)制明確、療效顯著，但其具有一定的毒性及耐藥性[4]，因此，降低DOX使用劑量，提高化療敏感性，是目前亟須解決的問(wèn)題。中藥復(fù)方具有多種作用成分，可通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑產(chǎn)生抗腫瘤作用，配合放化療，在腫瘤治療過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)增效減毒效果[5]。

自噬參與機(jī)體的許多病理生理過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療有著密切的聯(lián)系。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，一直以來(lái)是各類腫瘤治療的根本目標(biāo)。凋亡耐受是產(chǎn)生腫瘤耐藥的重要機(jī)制，自噬性細(xì)胞死亡是凋亡耐受腫瘤細(xì)胞的一種死亡方式。但是，細(xì)胞自噬又可防止抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的凋亡，促進(jìn)腫瘤耐藥。因此，自噬在腫瘤化療耐藥性中發(fā)揮著促進(jìn)或抑制耐藥的雙重作用[6]。從細(xì)胞自噬角度探索中醫(yī)藥治療腫瘤、降低化療藥物耐藥性的新靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義和廣泛的應(yīng)用前景。

苓桂術(shù)甘湯（Linggui zhugan decoction，LGZG）出自《傷寒雜病論》，為健脾溫陽(yáng)化濁的代表方，本課題組前期研究表明LGZG 可抑制NAFLD-HCC 的發(fā)生發(fā)展[7]。但是，LGZG對(duì)DOX治療NAFLD-HCC耐藥的影響及分子機(jī)制尚不清楚。本研究擬以自噬為切入點(diǎn)，深入探討LGZG對(duì)DOX治療NAFLD-HCC效果的影響及機(jī)制，以期為提高DOX治療NAFLD-HCC敏感性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有SpectraMaxi3 型多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），ASP 6025型高性能組織脫水機(jī)、RM2235 型手動(dòng)石蠟切片機(jī)、EG1150H型包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司），M8型數(shù)字掃描顯微成像系統(tǒng)（德國(guó)PreciPoint 公司），1658001 型Mini-PROTEAN Tetra垂直板電泳裝置、1704150型Trans-Blot SD型半干轉(zhuǎn)印儀（美國(guó)Bio Rad公司），5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

茯苓（批號(hào)230301）、桂枝（批號(hào)230201CP0494）、白術(shù)（批號(hào)2301）、甘草（批號(hào)230301）均購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，全部飲片經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為真品，且質(zhì)量均符合2020年版《中國(guó)藥典》（一部）的相關(guān)要求。

二乙基亞硝胺（批號(hào)D0516）購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鹽酸多柔比星（批號(hào)MB1087）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；蘇木素染液（批號(hào)C0105S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；改良Masson三色染色試劑盒（批號(hào)G1346）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）（批號(hào)分別為F2632-A、F2630-A）均購(gòu)自上?？婆d生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測(cè)定試劑盒（批號(hào)分別為20210806、20210809、20210806、20210809）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；兔源微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3（microtubule-associated proteins 1A and 1B，LC3）、芐氯素1（Beclin1）、選擇性自噬接頭蛋白P62、B 細(xì)胞淋巴瘤2 相關(guān)X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X，Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、增殖標(biāo)志物Ki-67蛋白多克隆抗體和鼠源B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（批號(hào)分別為14600-1-AP、11306-1-AP、18420-1-AP、50599-2-Ig、60004-1-Ig、28074-1-AP、68103-1-Ig）均購(gòu)自武漢Proteintech公司；山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗（批號(hào)分別為CW0103、CW0102）均購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

3周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠50只，體重（10±2）g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（遼）2021-0001。小鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)符合遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)21000042022042）。高脂飼料（10%豬油、5%蔗糖、1%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%甲基硫氧嘧啶、83.3%普通飼料）購(gòu)自小黍有泰（北京）生物科技有限公司，批號(hào)為200426012。

2 方法

2.1 LGZG水提液的制備

取茯苓25 g、桂枝25 g、白術(shù)15 g、甘草10 g，混合后加入10倍量水浸泡1 h后，加熱回流提取2 h；過(guò)濾，回收溶劑，再加入10 倍量水繼續(xù)回流提取2 h；合并2 次濾液，濃縮成質(zhì)量濃度為1 g/mL 的溶液（以生藥量計(jì)），于4 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

2.2 動(dòng)物分組干預(yù)及取材

50只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、NAFLD-HCC 組、LGZG 組、DOX 組、DOX+LGZG 組，每組10 只。除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射二乙基亞硝胺溶液（50 mg/kg），每周1 次，連續(xù)8周[8]。小鼠在給予二乙基亞硝胺溶液4 周后，再同時(shí)以高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)12 周，建立NAFLD-HCC 小鼠模型[7]；空白組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。建模后，按人與小鼠體表面積比換算給藥等效劑量，各給藥組小鼠分別灌胃LGZG 水提液（20 g/kg[7]）和/或腹腔注射DOX 溶液（8 mg/kg[7]），空白組、NAFLD-HCC組小鼠灌胃等量生理鹽水，每日1 次，干預(yù)4 周。藥物干預(yù)結(jié)束后，小鼠眼球取血后靜置2 h，以3 000 r/min離心20 min，取上清液，—80 ℃保存。取一半小鼠的肝臟組織用4%多聚甲醛固定，另一半小鼠的肝臟組織凍存于—80 ℃冰箱，備用。

2.3 小鼠的一般情況、體重、肝重及肝臟系數(shù)的比較

在模型建立及藥物干預(yù)期間，對(duì)小鼠的飲食、毛色和狀態(tài)等一般情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)；藥物干預(yù)結(jié)束后，眼球采血前稱量小鼠體重，取材時(shí)，快速取出肝臟，肉眼觀察小鼠肝臟形態(tài)并稱重，每組隨機(jī)選取6只小鼠計(jì)算肝臟系數(shù)。肝臟系數(shù)＝肝重（g）/體重（g）×100%。

2.4 小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察

采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠肝臟組織病理形態(tài)。每組隨機(jī)選取固定在4%多聚甲醛中的3只小鼠肝臟組織，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，進(jìn)行石蠟包埋和切片；取部分石蠟切片按HE 染色常規(guī)方法進(jìn)行染色（剩余部分用于后續(xù)Masson 染色及免疫組化染色），然后采用數(shù)字掃描顯微成像系統(tǒng)觀察肝臟組織病理形態(tài)。

2.5 小鼠肝臟組織纖維化程度檢測(cè)

采用Masson染色法檢測(cè)小鼠肝臟組織中膠原纖維含量的變化情況以明確小鼠肝臟組織纖維化程度。取“2.4”項(xiàng)下各組小鼠肝臟組織石蠟切片，按Masson 染色常規(guī)方法進(jìn)行染色，切片經(jīng)脫蠟、染色、分化、復(fù)染、脫水、透明后封固，以數(shù)字掃描顯微成像系統(tǒng)觀察。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)不重復(fù)視野，采用Image J軟件計(jì)算肝臟膠原面積百分比以表示膠原纖維含量。肝臟膠原面積百分比（%）＝肝臟膠原面積/所測(cè)視野面積×100%。

2.6 小鼠血脂水平及血清中腫瘤標(biāo)記物AFP、CEA 含量檢測(cè)

隨機(jī)選取6 只小鼠的血清，采用微板法檢測(cè)小鼠血脂水平（TG、TC、LDL-C和HDL-C水平），采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中AFP、CEA 含量，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.7 小鼠肝臟組織中Ki-67 蛋白及凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.4”項(xiàng)下各組小鼠（每組3只）肝臟組織石蠟切片，經(jīng)熱抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源酶、封閉后，滴加Ki-67 和凋亡標(biāo)志蛋白（Bax、Bcl-2）一抗（稀釋比均為1∶200）孵育1 h；PBS 清洗后加入二抗（稀釋比為1∶100）孵育30 min；以PBS 清洗后進(jìn)行DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、脫水、封片和觀察。利用Image Pro plus 6.0 軟件進(jìn)行免疫組化結(jié)果分析，以平均光密度值表示蛋白表達(dá)水平。

2.8 小鼠肝臟組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。每組隨機(jī)選取3 只小鼠的肝臟組織，每只取0.1 g，加入1 mL RIPA裂解液，充分勻漿并置于冰上裂解30 min，離心后取上清液；采用BCA 試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度，混合蛋白樣品和上樣緩沖液，在95 ℃條件下加熱5 min，以充分變性蛋白。以50 μg蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜；加 入LC3、Beclin1、P62 及GAPDH一抗（稀釋比分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃封閉過(guò)夜；以TBST 洗滌3 次，每次15 min，加入相應(yīng)二抗（稀釋比為1∶10 000）室溫孵育1 h；經(jīng)曝光、顯影后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察，利用AlphaView 凝膠圖像分析軟件進(jìn)行圖像處理，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值，以表示蛋白表達(dá)水平。LC3 在細(xì)胞中以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式存在，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值表示LC3 蛋白的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況、體重、肝重及肝臟系數(shù)的比較結(jié)果

在模型建立及藥物干預(yù)期間各組小鼠的飲食、活動(dòng)均無(wú)明顯異常，NAFLD-HCC 組小鼠隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)活動(dòng)逐漸減少，精神萎靡，毛發(fā)蓬亂無(wú)光澤；給藥組小鼠整體情況均有改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白組比較，NAFLD-HCC組小鼠體重顯著降低（P＜0.05），肝重有上升趨勢(shì)，肝臟系數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與NAFLD-HCC組比較，DOX組、LGZG組、DOX+LGZG組小鼠肝重和肝臟系數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體重、肝重和肝臟系數(shù)結(jié)果（±s，n＝6）

表1 各組小鼠體重、肝重和肝臟系數(shù)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與NAFLD-HCC組比較，P＜0.05。

組別空白組NAFLD-HCC組DOX組LGZG組DOX+LGZG組體重/g 26.99±1.72 20.38±2.90a 18.64±2.96 23.47±1.39 21.73±1.64肝重/g 1.30±0.05 1.43±0.12 1.02±0.23b 1.14±0.05b 1.01±0.11b肝臟系數(shù)/%0.048±0.00 0.071±0.01a 0.054±0.01b 0.049±0.00b 0.047±0.01b

3.2 小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

肉眼觀察結(jié)果顯示，空白組小鼠肝臟大小正常，表面光滑，顏色紅潤(rùn)，質(zhì)地柔軟；NAFLD-HCC組小鼠肝臟腫大，邊緣鈍而厚，表面粗糙，觸之有油膩感，仔細(xì)觀察有灰白色腫瘤結(jié)節(jié)；LGZG組小鼠肝臟表面顏色稍微改善，腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目較干預(yù)前減少；DOX組改善效果不明顯；DOX+LGZG 組小鼠肝臟表面顏色較干預(yù)前有較大改善，腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目明顯減少。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織形態(tài)圖及HE染色圖

HE染色結(jié)果顯示，空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，細(xì)胞排列整齊，無(wú)脂肪變性，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；NAFLD-HCC 組小鼠肝細(xì)胞體積增大，有大量的空泡狀細(xì)胞，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，脂肪變性明顯，部分細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變、細(xì)胞密度增大、小細(xì)胞性增生的病變；LGZG組小鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)小空泡，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕；DOX組小鼠肝臟空泡樣變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有改善效果但不明顯，DOX+LGZG組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)明顯，空泡樣變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.3 小鼠肝臟組織纖維化程度的結(jié)果

Masson染色結(jié)果（見(jiàn)圖2）顯示，空白組小鼠肝臟組織無(wú)明顯染色；與空白組比較，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟組織癌細(xì)胞周圍纖維化，視野內(nèi)有廣泛致密的藍(lán)色膠原沉積，藍(lán)染纖維間隔形成，膠原面積百分比顯著增加（P＜0.05），膠原纖維含量增多，纖維化程度加重；與NAFLD-HCC 組比較，LGZG 組、DOX+LGZG 組小鼠肝臟組織纖維化范圍均有所減輕，尤其以DOX+LGZG 組小鼠改善最為顯著，膠原面積百分比顯著降低（P＜0.05），膠原纖維含量減少，纖維化程度減輕；與DOX 組比較，DOX+LGZG 組小鼠膠原面積百分比顯著降低（P＜0.05），肝臟纖維化程度減輕。

圖2 各組小鼠肝臟組織Masson染色圖及膠原面積百分比柱狀圖（n＝3）

3.4 小鼠血脂水平及血清中AFP、CEA含量的檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，NAFLD-HCC 組小鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平及AFP、CEA 含量均顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與NAFLD-HCC組比較，DOX組小鼠血清中CEA 含量顯著降低，LGZG 組、DOX+LGZG 組小鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平及AFP、CEA含量均顯著降低（P＜0.05），DOX+LGZG 組小鼠血清中HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血脂水平及血清中AFP、CEA含量的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表2 各組小鼠血脂水平及血清中AFP、CEA含量的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與NAFLD-HCC組比較，P＜0.05。

組別空白組NAFLD-HCC組DOX組LGZG組DOX+LGZG組TC/（μmol/mg）1.59±0.47 3.53±0.74a 3.16±0.82 2.35±0.26b 2.38±0.89b TG/（μmol/mg）0.63±0.24 2.68±0.27a 2.44±0.66 1.25±0.10b 1.24±0.20b LDL-C/（μmol/mg）0.99±0.24 4.79±0.55a 3.98±0.53 3.23±0.75b 3.26±0.46b HDL-C/（μmol/mg）11.01±4.50 3.06±1.87a 5.24±3.16 8.50±2.32 9.16±4.35b CEA/（ng/L）1.49±0.29 2.90±0.34a 2.35±0.33b 2.05±0.12b 1.98±0.16b AFP/（μg/L）100.39±33.62 259.03±53.50a 222.21±23.18 202.51±20.44b 187.97±15.42b

3.5 小鼠肝臟組織中Ki-67蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，NAFLD-HCC組小鼠肝臟組織中Ki-67 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與NAFLD-HCC組比較，LGZG組、DOX+LGZG組小鼠肝臟組織中Ki-67蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與DOX 組比較，DOX+LGZG 組小鼠肝臟組織中Ki-67 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3和圖3。

表3 各組小鼠肝臟組織中Ki-67、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表3 各組小鼠肝臟組織中Ki-67、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與NAFLD-HCC組比較，P＜0.05；c：與DOX組比較，P＜0.05。

Bcl-2平均光密度0.050±0.006 0.105±0.014a 0.087±0.003 0.070±0.007b 0.055±0.006bc組別空白組NAFLD-HCC組DOX組LGZG組DOX+LGZG組Ki-67平均光密度0.030±0.00 0.054±0.004a 0.048±0.002 0.041±0.002b 0.036±0.002bc Bax平均光密度0.059±0.003 0.041±0.002 0.069±0.005b 0.078±0.008b 0.125±0.008bc

圖3 各組小鼠肝臟組織中Ki-67蛋白免疫組化染色圖

3.6 小鼠肝臟組織中凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Bax 蛋白表達(dá)水平有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NAFLD-HCC 組比較，DOX 組、LGZG 組、DOX+LGZG組小鼠肝臟組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（DOX 組除外），Bax 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與DOX 組比較，DOX+LGZG 組小鼠肝臟組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3和圖4。

圖4 各組小鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2蛋白免疫組化染色圖

3.7 小鼠肝臟組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟組織中Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，P62蛋白表達(dá)水平升高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NAFLD-HCC 組比較，DOX 組、LGZG組及DOX+LGZG 組小鼠肝臟組織中Beclin1 蛋白表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著升高，P62 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與DOX 組比較，DOX+LGZG組小鼠肝臟組織中Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高，P62 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠肝臟組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果

4 討論

NAFLD-HCC 發(fā)病較為隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期，喪失手術(shù)治療的時(shí)機(jī)，因此治療上以化療為主。雖然化療可以殺滅肝癌細(xì)胞，但其特異性差，長(zhǎng)時(shí)間的化療有很大毒性，易損傷脾胃運(yùn)化功能。因此，脾虛亦是肝癌化療后的重要病機(jī)，NAFLD-HCC 治療應(yīng)采取扶正兼顧祛邪的原則。中藥聯(lián)合化療，能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性、提高機(jī)體對(duì)化療的耐受力、延長(zhǎng)生存期[9]。LGZG為健脾溫陽(yáng)化濁的代表方，其中茯苓為君藥，健脾以化痰濕；桂枝為臣藥，溫通陽(yáng)氣；白術(shù)為佐藥，健脾燥濕，又可補(bǔ)益脾陽(yáng)；甘草為使藥，補(bǔ)中益氣，調(diào)和諸藥；四藥合用可使脾氣健運(yùn)。故應(yīng)用LGZG 作為NAFLDHCC治療或輔助化療用藥，符合中醫(yī)治病求本的治則。

本研究造模后肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟有灰白色腫瘤結(jié)節(jié)。病理形態(tài)學(xué)染色可見(jiàn)肝組織細(xì)胞體積增大、脂肪變性，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，部分細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變，有小細(xì)胞性增生；肝臟組織中可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維表達(dá)。AFP與肝癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，是原發(fā)性肝癌特異性最高的腫瘤標(biāo)志物，CEA是一種廣譜性的腫瘤標(biāo)志物，AFP、CEA 的聯(lián)合檢測(cè)是診斷原發(fā)性肝癌的重要指標(biāo)[10]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NAFLD-HCC組小鼠血清中AFP和CEA含量明顯升高。Ki-67又稱為核增殖抗原，是細(xì)胞增生指數(shù)的一種標(biāo)志，其陽(yáng)性表達(dá)率越高，腫瘤惡性程度越高[11]。本研究免疫組化結(jié)果顯示，NAFLD-HCC 組小鼠肝臟組織中Ki-67 蛋白表達(dá)水平明顯升高。上述結(jié)果均提示NAFLD-HCC 模型建立成功。本文對(duì)DOX、LGZG 及LGZG 聯(lián)合DOX 干預(yù)NAFLD-HCC 效果的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，以DOX、LGZG 及LGZG 聯(lián)合DOX 干預(yù)后，小鼠上述指標(biāo)均有不同程度的改善，且LGZG 聯(lián)合DOX 的改善作用更明顯。然而，LGZG聯(lián)合DOX化療的增效減毒作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

化療藥物可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而殺傷腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療耐藥的實(shí)質(zhì)是藥物不能活化其凋亡途徑，因此，凋亡耐受的腫瘤細(xì)胞是多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因[12]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡可增強(qiáng)NAFLD-HCC 化療敏感性[13]。因此，自噬可能是LGZG增效減毒、逆轉(zhuǎn)DOX腫瘤耐藥性的重要靶點(diǎn)。

Beclin1 是自噬體形成啟動(dòng)復(fù)合物Class Ⅲ PI3K 的關(guān)鍵組分，在自噬的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[14]。LC3 是自噬過(guò)程的標(biāo)志物，主要參與了自噬小體的形成，其合成后立即被自噬相關(guān)基因4剪切掉羧基端，形成胞漿型LC3 即LC3Ⅰ；隨后LC3Ⅰ會(huì)酶解掉一小段多肽，偶聯(lián)磷脂酰乙醇胺形成膜型LC3Ⅱ，因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在一定程度上反映了自噬的程度[15]。自噬體形成過(guò)程中，P62 作為鏈接LC3 和聚泛素化蛋白之間的橋梁，被選擇性地包裹進(jìn)自噬體，之后被自噬溶酶體中的蛋白水解酶降解，P62 蛋白的表達(dá)量與自噬活性呈負(fù)相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與DOX 組比較，DOX 聯(lián)合LGZG干預(yù)可以顯著誘導(dǎo)Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，P62 蛋白表達(dá)下調(diào)，激活肝臟自噬發(fā)生。Beclin1 不僅參與自噬的起始階段，還可與抗凋亡蛋白Bcl-2相互作用，抑制其抗凋亡作用，從而抑制腫瘤的增殖[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與DOX組比較，DOX聯(lián)合LGZG干預(yù)可使小鼠肝臟組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bax 蛋白表達(dá)水平明顯升高，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)NAFLD-HCC化療敏感性。

綜上所述，LGZG聯(lián)合DOX能夠協(xié)同促進(jìn)肝臟腫瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)NAFLD-HCC 化療敏感性，有效減緩原發(fā)性HCC 的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生有關(guān)。