劉佳，魏寶紅，，畢旺華，，楊文哲，楊雪，*，李欣，王長(zhǎng)云，馬曉青，，胡淑曼

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)藥學(xué)院，山東青島 266003；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東青島 266071）

腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命安全的疾病之一。2019年我國(guó)癌癥中心數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，全國(guó)每年惡性腫瘤發(fā)病約392.9 萬(wàn)人，死亡約233.8 萬(wàn)人，而且惡性腫瘤發(fā)病率還在持續(xù)上升[1]，尋找治療腫瘤的藥物迫在眉睫。目前，臨床上治療腫瘤的辦法主要有手術(shù)治療、化療、放療、免疫治療、分子靶向治療等。手術(shù)治療主要適用于良性腫瘤和未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤；化療和放療這兩種治療方法都伴隨著藥物毒性，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)；雖然靶向治療和免疫治療在各種臨床環(huán)境中遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)療法，但它們?nèi)匀皇艿较忍旌秃筇炷退帣C(jī)制的困擾，限制了許多患者的治療效果[2]。近些年來(lái)，從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的抗腫瘤成分，合理選用可輔助治療腫瘤的特殊癥狀和并發(fā)癥，不僅與西醫(yī)放化療配合有效，而且可單獨(dú)應(yīng)用治療腫瘤[3-4]。

昆布是海帶科植物海帶（Laminaria japonicaAresch.）或翅藻科植物昆布（Ecklonia kuromeOkam.）的干燥葉狀體，是大宗海洋中藥品種，具有軟堅(jiān)散結(jié)、利水退腫、消痰功效[5]。勿日汗等[6]對(duì)昆布的應(yīng)用方劑進(jìn)行整理發(fā)現(xiàn)，含有昆布的方劑約有180 首，其中用于治療癭瘤病的方劑占總方數(shù)的40%，治癭瘤方中昆布的使用頻率為63.5%，因此，臨床上常用昆布的軟堅(jiān)散結(jié)之功效對(duì)腫瘤進(jìn)行干預(yù)治療[7]。目前昆布抗腫瘤研究主要集中在昆布多糖、巖藻黃質(zhì)等有效成分，昆布多糖即褐藻膠是昆布發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分，褐藻膠由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannur-onic acid，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通過(guò)1→4 糖苷鍵雜聚在一起組成[8]。研究表明，M 段、G 段是海洋藻類(lèi)抗腫瘤的有效部位，目前發(fā)現(xiàn)褐藻膠寡糖抗腫瘤作用涉及多種機(jī)制，包括腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)等[9]。褐藻膠寡糖具有天然無(wú)毒、對(duì)機(jī)體的副作用小等特點(diǎn)，已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。昆布利用傳統(tǒng)水提得到的昆布水提物中古洛糖醛酸和甘露糖醛酸得率偏低，其抗腫瘤活性IC50大多在300 μg/mL 以上，甚至達(dá)到1 mg/mL[10-11]。為提高昆布的資源利用率，本課題組借鑒槐耳-黃芪菌質(zhì)、雷靈菌質(zhì)的開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)，采用中藥雙向發(fā)酵技術(shù)，對(duì)昆布進(jìn)行雙向發(fā)酵研究。中藥雙向發(fā)酵是指以藥用真菌為發(fā)酵菌種，以中藥材作為藥性基質(zhì)，該基質(zhì)在為真菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，又與真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物相互作用、相互影響，使整個(gè)發(fā)酵具有“雙向性”[12]。

桑黃是銹革孔菌科真菌粗毛纖孔菌[Inonotus hispidus（Bull.）P.Karst.]的干燥子實(shí)體，是一種名貴的藥食兩用真菌，具有散結(jié)化飲、活血止血、健脾止瀉的功效[13]。在生物抗癌領(lǐng)域，桑黃是國(guó)際公認(rèn)的最具抗癌功效的真菌之一[14]。

本研究利用昆布和桑黃配伍組合的抗腫瘤功效[15-16]，利用雙向發(fā)酵技術(shù)優(yōu)化制備桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)，闡明菌質(zhì)中有效成分含量的變化，并采用磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）比色法測(cè)定桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖的影響，初步評(píng)價(jià)桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)的抗腫瘤活性，以期提高昆布的抗腫瘤功效及利用率，為拓展其在藥食同源功能食品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃：臨清清源正本生物醫(yī)藥科技有限公司；昆布：亳州市佰世信中藥飲片有限公司；L-阿拉伯糖、半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、D-無(wú)水葡萄糖、D-半乳糖醛酸（純度均>98%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；D-葡萄糖醛酸、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽（純度均≥99%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；D-甘露糖醛酸、L-古羅糖醛酸（純度均為98%）：青島博智匯力生物科技有限公司；人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、HUVECs：中科院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640 培養(yǎng)液、DMEM高糖培養(yǎng)液、Mc-COY’S 5A 培養(yǎng)液：浙江森瑞生物科技有限公司；SRB（S1402）：上海生物工程有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：Merk 公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、三氯乙酸（tric-hloroacetic acid，TCA）（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MQD-B1T 全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司；ZHJH-C1115B 垂直流超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZH-150KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；Aglient 1260Ⅱ型高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；ME204E 萬(wàn)分之一天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GL 冷凍高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；HWS-26 水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；SCIENTZ-18N 型冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)朗儀器有限公司；SpectraMax-i3 多功能酶標(biāo)儀：上海艾研生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桑黃-昆布雙向發(fā)酵體系的建立

1.3.1.1 培養(yǎng)基的配制

前期優(yōu)化的桑黃最佳培養(yǎng)工藝為3%蔗糖、2%酵母浸粉、0.3%硫酸鎂、0.6%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸銅，在此基礎(chǔ)上添加一定量的昆布，進(jìn)行桑黃-昆布雙向發(fā)酵。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，去皮洗凈后切小塊，沸水煮30 min后4 層紗布濾過(guò)，濾液加20 g 葡萄糖及15 g 瓊脂，定容至1 L。

液體種子培養(yǎng)基：蔗糖2%、酵母浸粉1%、硫酸鎂0.3%、磷酸二氫鉀0.6%。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖3%、酵母浸粉2%、硫酸鎂0.3%、磷酸二氫鉀0.6%、硫酸銅0.1%。

1.3.1.2 菌種活化

將保存的桑黃菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，每個(gè)平板接入1 塊體積約0.1 cm3的桑黃菌種，置于26 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)14 d，備用。

1.3.1.3 液體培養(yǎng)

于250 mL 錐形瓶裝入液體種子培養(yǎng)基100 mL，接入活化后的桑黃菌種4 塊，每塊約0.1 cm3，于28 ℃、160 r/min 的搖床條件下培養(yǎng)7 d，得桑黃液體菌種子。

1.3.1.4 桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)的制備

取粉碎后的昆布粉末4 g 置于250 mL 錐形瓶中，加入100 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，攪拌均勻，放入121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min，得雙向發(fā)酵培養(yǎng)基；待其冷卻至室溫，接種10 mL 桑黃種子液，在28 ℃，160 r/min的搖床條件下培養(yǎng)9 d，10 000 r/min 離心10 min，沉淀用蒸餾水洗滌2 次，合并上清液，即得桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)，濃縮后冷凍干燥，備用。

1.3.1.5 昆布水提物的制備

取4 g 粉碎后的昆布，加100 mL 蒸餾水，100 ℃回流提取1 h，提取2 次，合并兩次提取液，10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得昆布水提物，濃縮后冷凍干燥，備用。

1.3.2 化學(xué)成分含量測(cè)定

1.3.2.1 總糖含量測(cè)定

采用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定總糖含量[17]。分別取昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)精密稱(chēng)定，加蒸餾水制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的溶液，10 000 r/min離心10 min，取上清液，待測(cè)。精密吸取樣品溶液2 mL，迅速精密加入0.1%硫酸-蒽酮溶液6 mL，立即搖勻，沸水浴15 min，立即至冰浴中冷卻15 min，取出，于625 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線(xiàn)計(jì)算其總糖含量。

1.3.2.2 單糖組成分析

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：取L-阿拉伯糖、半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、D-無(wú)水葡萄糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、D-甘露糖醛酸、L-古羅糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品精密稱(chēng)定，加水制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待測(cè)。取100 μL 上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入0.3 mol/L NaOH 溶液和0.5 mol/L PMP 甲醇溶液各100 μL，混勻，至70 ℃恒溫水浴90 min，冷卻，加入100 μL、0.3 mol/L 鹽酸溶液中和。繼而加入500 μL氯仿，渦旋30 s，離心去除有機(jī)相，重復(fù)3 次。取水相，即得對(duì)照品溶液[18]。

供試溶液的制備：取昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)精密稱(chēng)定，加水制成質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的待測(cè)樣品溶液，備用。精密吸取樣品溶液200 μL，加入2 mol/L 的TFA 溶液200 μL，封管后，置100 ℃恒溫烘箱5 h；精密吸取水解液200 μL，加入200 μL 甲醇，氮?dú)獯蹈?，重?fù)2 次。加入100 μL 水溶解，后續(xù)反應(yīng)步驟同標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備，即得供試品溶液。

色譜條件：色譜柱采用日本半井公司COSMOSIL Packed 5 C18-PAQ（4.6 mm×150 mm，5 μm）的色譜柱；流動(dòng)相為0.1 mol/L KH2PO4-NaOH 緩沖溶液（A）和乙腈（B），18%B 等度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

各單糖組分相對(duì)含量分析：采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算，求得各單糖組分含量[19]。

1.3.2.3 總酚含量測(cè)定

采用福林酚比色法測(cè)定總酚含量[20]。分別取昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)精密稱(chēng)定，加蒸餾水制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的溶液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，待測(cè)。精密量取樣品溶液0.5 mL，加1.4 mol/L 的福林酚試劑0.5 mL，在1～8 min 內(nèi)加入30 g/L 的Na2CO3溶液4 mL，45 ℃水浴中避光顯色112 min，在765 nm 處測(cè)溶液的吸光度，根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線(xiàn)計(jì)算其總酚含量。

1.3.3 體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性試驗(yàn)

1.3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

分別將人肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2、人宮頸癌細(xì)胞HeLa 用DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和HUVECs 用RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 用McCOY’S 5A 培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶消化，傳代，保持細(xì)胞在良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3.3.2 檢測(cè)方法

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、HUVECs 分別以5 000 個(gè)/孔（180 μL/孔）接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，加入待測(cè)樣品20 μL，待測(cè)樣品分為溶劑對(duì)照組，陽(yáng)性藥組（阿霉素），昆布水提物組和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)組，陽(yáng)性藥的終濃度為1 μmol/L，所有待測(cè)樣品終濃度100 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，溶劑對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌水。藥物作用72 h 后，每孔加入50%冰冷的三氯乙酸固定細(xì)胞，SRB 染色后，加入150 μL/孔的Tris 溶液，于540 nm 測(cè)定其吸光度。

腫瘤細(xì)胞增殖抑制率（I，%）按下列公式計(jì)算。

I＝[（A1－A2）/A1]×100

式中：A1為對(duì)照品在540 nm 處的吸光度；A2為給藥孔樣品在540 nm 處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有結(jié)果以用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用Excel和SPSS 軟件進(jìn)行分析。采用T-test 統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖含量檢測(cè)結(jié)果

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以吸光度對(duì)質(zhì)量進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為y=0.010 6x+0.041 7（R2=0.999 9），曲線(xiàn)擬合性較好。測(cè)得昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)中總糖含量分別為（30.00±1.51）、（645.00±18.55）mg/g，表明在相同的昆布生藥量條件下，與昆布水提物相比，桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)總糖含量顯著升高（P<0.01）。推測(cè)原因可能為桑黃在發(fā)酵過(guò)程中不斷代謝產(chǎn)生的纖維素酶類(lèi)、淀粉酶類(lèi)物質(zhì)分解昆布的細(xì)胞壁，促進(jìn)昆布細(xì)胞中褐藻膠、褐藻淀粉、褐藻糖膠等物質(zhì)的溶出，此外，昆布也促進(jìn)了桑黃的生長(zhǎng)、分裂和發(fā)育，從而提高了菌質(zhì)中總糖的含量[21]。

2.2 單糖組成分析結(jié)果

混合標(biāo)準(zhǔn)品、昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）圖見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品單糖的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards of monosaccharides

圖2 昆布水提物的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Eckloniae Thallus water extract

圖3 桑黃-昆布發(fā)酵菌質(zhì)的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Inonotus-Eckloniae Thallus bidirectional fermentation product

由圖1～圖3 可知，昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)均含有甘露糖、古洛糖醛酸、甘露糖醛酸和巖藻糖。

根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得到昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)中單糖的含量，見(jiàn)表1。

表1 昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)單糖含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Content of monosaccharides in Eckloniae Thallus water extract and Inonotus-Eckloniae Thallus bidirectional fermentation product mg/g

由表1 可知，在相同的昆布生藥量條件下，昆布經(jīng)桑黃發(fā)酵后，古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖和巖藻糖含量顯著增加（P<0.01），分別達(dá)到（15.46±0.25）、（50.66±0.14）、（16.37±0.26）、（22.64±0.11）mg/g，推測(cè)原因可能為桑黃在昆布提供能量的情況下進(jìn)行分裂、生長(zhǎng)、繁殖和代謝，它可以針對(duì)昆布不同的成分構(gòu)成的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，分泌各種胞外酶，如纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、蛋白酶等使昆布中的有效成分如褐藻膠、褐藻淀粉、褐藻糖膠溶出，從而提高了菌質(zhì)中古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖和巖藻糖的含量[22]。

2.3 總酚含量檢測(cè)結(jié)果

以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以吸光度（A）對(duì)質(zhì)量進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為y=33.21x-0.094 9（R2=0.999 2），曲線(xiàn)擬合性較好。計(jì)算昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)中總酚的含量分別為（2.24±0.19）、（9.94±0.57）mg/g。結(jié)果顯示在相同的昆布生藥量條件下，與昆布水提物比較，桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)總酚的含量顯著升高（P<0.01）。推測(cè)原因可能與總糖含量升高的原因一致。

2.4 體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

昆布水提物、桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)A549、HCT-116、HeLa、HUVECs、HepG2、MCF-7 細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果如表2所示。

表2 昆布水提物和桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率（n=3）Table 2 Inhibition rates of cell proliferation by Eckloniae Thallus water extract and Inonotus-Eckloniae Thallus bidirectional fermentation product（n=3）%

如表2所示，昆布水提物、桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)和阿霉素對(duì)HUVECs、A549、HCT-116、HeLa 細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用；對(duì)于HepG2 細(xì)胞增殖，只有昆布水提物和阿霉素表現(xiàn)出了抑制作用；而對(duì)于MCF-7 細(xì)胞增殖除阿霉素外，昆布水提物和雙向發(fā)酵菌質(zhì)均未表現(xiàn)抑制作用，說(shuō)明桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)具有一定的抗腫瘤作用。相同的昆布生藥量條件下，桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)較昆布水提物的抗腫瘤活性明顯提高，推測(cè)可能與桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)中古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、巖藻糖等功能單糖含量升高有關(guān)。古洛糖醛酸、甘露糖醛酸是昆布中的特征性單糖，分子量低，水溶性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，本身無(wú)細(xì)胞毒性，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)損傷；古洛糖醛酸、甘露糖醛酸與一般的抗腫瘤劑不同，是通過(guò)提高生物體對(duì)腫瘤細(xì)胞的防御能力和增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用而非直接作用于腫瘤細(xì)胞[23-25]；甘露糖則是通過(guò)干擾葡萄糖代謝阻斷腫瘤的能量來(lái)源，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[26-28]，另外還可調(diào)控免疫檢查點(diǎn)分子PD-L1，達(dá)到抗癌作用[29]；巖藻糖可以參與細(xì)胞的識(shí)別與黏附、糖鏈的合成、腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等[30]。桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)在100 μg/mL 的濃度條件下，對(duì)HUVECs 的增殖抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到了49.35%，HUVECs 來(lái)源于人臍靜脈，是一種具有干細(xì)胞潛能的內(nèi)皮細(xì)胞，可以通過(guò)抑制HUVECs 增殖，減少或阻止新血管的生成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[31]。

3 結(jié)論

本研究以桑黃作為發(fā)酵菌株，昆布作為藥性基質(zhì)，采用雙向液體發(fā)酵技術(shù)，在一定的優(yōu)化條件下制備桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)，其中兩類(lèi)活性成分總量分析結(jié)果表明，在相同的昆布生藥量情況下，發(fā)酵處理后的菌質(zhì)中總糖及總酚含量均顯著增加，總糖含量由30.00 mg/g 升高到645.00 mg/g；總酚含量由2.24 mg/g升高到9.94 mg/g。發(fā)酵處理后的菌質(zhì)中古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露糖和巖藻糖含量顯著增加，分別由2.64、8.96、1.13、17.76 mg/g 升高到15.46、50.66、16.37、22.64 mg/g。除此之外還進(jìn)行了桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)6 種細(xì)胞株增殖的影響研究，結(jié)果表明桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)在100 μg/mL 的濃度條件下，對(duì)HUVECs的增殖顯示出顯著的抑制作用，抑制率為49.35%，同時(shí)對(duì)A549、HCT-116、HeLa 細(xì)胞增殖也表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，抑制率分別為21.88%、21.33%、7.67%，說(shuō)明桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)具有一定的抗腫瘤作用。本研究為將桑黃-昆布發(fā)酵菌質(zhì)開(kāi)發(fā)功能食品提供了參考，后續(xù)還將進(jìn)行桑黃-昆布雙向發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)HUVECs 增殖抑制是否呈劑量依賴(lài)性以及對(duì)HUVECs 抑制效果的穩(wěn)定性等進(jìn)行深入研究。