鐘鵬， 苗麗麗， 王建麗， 劉杰， 王曉龍

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005； 2.黑龍江省黑土保護(hù)利用研究院，哈爾濱 150086； 3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，哈爾濱 150086）

中美貿(mào)易摩擦不斷升級使我國食用油和飼料安全問題日益凸顯，替代進(jìn)口大豆、降低食用油和飼料對外依存度成為公眾關(guān)注的熱點和焦點。解決油料需求增長與耕地面積有限之間的矛盾，必需尋找單產(chǎn)和品質(zhì)均高于大豆的食用油新油源作物開發(fā)利用。油莎豆被證明是能夠部分替代進(jìn)口大豆、最為現(xiàn)實可行的糧油飼兼用型作物[1]。油莎豆屬莎草科一年生植物，耐旱、耐貧瘠、防風(fēng)固沙能力強(qiáng)，比較適宜沙質(zhì)土壤和沙化邊際土地生長，不與糧爭地[2-4]。在我國東北農(nóng)牧交錯區(qū)適時發(fā)展油莎豆產(chǎn)業(yè)，將是補(bǔ)充優(yōu)質(zhì)食用油供給、保護(hù)農(nóng)牧交錯區(qū)生態(tài)環(huán)境、補(bǔ)齊農(nóng)業(yè)發(fā)展短板的有效途徑。

低溫是植物生長發(fā)育的限制因子之一，低溫冷害會抑制植物生長發(fā)育、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并影響正常生理代謝[5]。玉米、水稻、花生及果菜等耐低溫脅迫研究較多，已經(jīng)在耐低溫性品種鑒定、低溫脅迫生理響應(yīng)及外源調(diào)節(jié)劑作用機(jī)理等方面取得一定進(jìn)展[6-10]。盡管油莎豆引進(jìn)我國已經(jīng)70余年，但對其研究相對滯后。目前，國內(nèi)外關(guān)于油莎豆的研究主要集中在栽培技術(shù)、營養(yǎng)成分分析、加工工藝、功能性食品開發(fā)等方面[11-14]，國內(nèi)關(guān)于油莎豆萌發(fā)期及苗期耐低溫全面系統(tǒng)的評價尚未見報道。黑龍江省十年九春寒，且近幾年來倒春寒現(xiàn)象頻發(fā)，溫度成為限制該地區(qū)油莎豆種植的主要因素。篩選和評價油莎豆耐低溫種質(zhì)資源，挖掘油莎豆耐低溫基因?qū)|北農(nóng)牧交錯區(qū)水土流失治理、黑土地保護(hù)利用及鹽堿地改良具有重要意義。本研究在低溫脅迫下對不同生態(tài)區(qū)油莎豆種質(zhì)資源耐低溫性進(jìn)行鑒定和評價，以期明確油莎豆萌發(fā)期和苗期耐低溫的主要鑒定指標(biāo)，并篩選出耐低溫較強(qiáng)的油莎豆種質(zhì)資源，為后續(xù)培育耐低溫品種、克隆耐低溫基因及功能驗證提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2010 年以來引進(jìn)國內(nèi)外不同生態(tài)區(qū)的18 份油莎豆種質(zhì)資源材料，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)村能源研究所能源植物資源利用研究室提供。由于國內(nèi)油莎豆只有1 個登記品種中油莎1 號（ZYS01），其余均為種質(zhì)材料，均用代號表示。18 份油莎豆種質(zhì)材料如下：HLJ105、RY126、BY156、HLJ106、RY102、BY141、RY114、NM103、XJ101、JL154、LN181、SX100、HB122、HN162、ZYS01、XY109、GD187和QY186。

1.2 試驗設(shè)計

大田試驗在黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣新店林場試驗基地（46°32′ N，124°30′ E）進(jìn)行，該區(qū)屬中溫帶大陸季風(fēng)氣候。2018—2020年均于5 月1 日播種，每穴1 粒，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，小區(qū)4.5 m×10 m，行株距45 cm×20 cm。倒春寒規(guī)定及等級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[15-16]。

室內(nèi)試驗在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)村能源研究所進(jìn)行。油莎豆種子萌發(fā)試驗使用人工氣候箱，光照時間為6:00—18:00，濕度80%。將種子置于直徑為20 cm 的培養(yǎng)皿中，45 ℃溫水浸泡吸脹36 h，根據(jù)大田試驗倒春寒日最低溫度范圍，以正常溫度（25 ℃）為對照，將溫度設(shè)置3、5、7、9 ℃共4 個溫度處理，分別培養(yǎng)3 d，25 ℃復(fù)溫后繼續(xù)培養(yǎng)，記錄發(fā)芽時間、發(fā)芽數(shù)、芽長等數(shù)據(jù)。每個試驗組每個油莎豆種質(zhì)材料50粒種子，重復(fù)3次。

將油莎豆種子45 ℃溫水浸泡吸脹36 h 后播種于盛珍珠巖的營養(yǎng)缽中，澆灌1/2 經(jīng)典霍格蘭（Hoagland）營養(yǎng)液培養(yǎng)萌發(fā)后，當(dāng)幼苗第3 片葉完全展開后，進(jìn)行低溫處理。將幼苗置人工氣候箱中，分別于3 、5 、7 、9 ℃ 4個溫度處理2 h，以正常溫度（25 ℃）為對照。每個試驗組的每個種質(zhì)材料8株，3次重復(fù)。

1.3 測定目標(biāo)及方法

1.3.1 大田試驗出苗時間和出苗率統(tǒng)計 2018—2020 年播種后10 d，在18 個油莎豆種質(zhì)材料小區(qū)分別隨機(jī)挑選3條壟每天調(diào)查出苗情況，記錄出苗時間（emergence date, ED）、出苗數(shù)（emergence plant,EP），直至6月3日。統(tǒng)計播種穴數(shù)和出苗穴數(shù)，根據(jù)以下公式計算出苗率（emergence rate, ER）。

1.3.2 室內(nèi)發(fā)芽試驗 以正常溫度為對照，統(tǒng)計18 個油莎豆種質(zhì)材料在不同處理后種子發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽時間、芽長等數(shù)據(jù)。計算發(fā)芽率（germination rate， GR）、發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）和種子活力指數(shù)（seed vigor index，VI）等參數(shù)[17-18]。

式中，M指發(fā)芽種子數(shù)，N指供試樣品的種子數(shù)；Gt指不同發(fā)芽天數(shù)的發(fā)芽率，Dt指對應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；S指長出部分鮮重。

1.3.3 生化特性指標(biāo)測定 采用張憲政[19]的丙酮乙醇混合液法測定計算葉綠素（a+b）含量[chlorophyll content，Chl（a+b）]。相對膜透性（relative membrane permeability, RMP）測定參考李錦樹等[20]的方法。丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量測定參照Guo 等[21]的方法并進(jìn)行改進(jìn)?？扇苄蕴牵╯oluble sugar, SS）含量和游離脯氨酸（proline, Pro）含量測定參照常博文等[7]的方法。

1.3.4 抗氧化酶活性測定 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性的測定參照Giannopolitis 等[22]的方法。過氧化物酶（peroxidase,POD）活性的測定參照Klapheck等[23]的方法。

1.4 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Duncan’s檢驗（P=0.05）進(jìn)行顯著性分析。根據(jù)隸屬函數(shù)法，綜合各指標(biāo)數(shù)據(jù)計算18 份種質(zhì)材料隸屬函數(shù)值進(jìn)行抗寒性評價[24-25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆大田出苗時間及出苗率統(tǒng)計

2018—2020 年4 月28 日至6 月3 日期間試驗場地連續(xù)3年均發(fā)生倒春寒現(xiàn)象。2018—2020年5 月11 日開始調(diào)查出苗情況，由圖1 可知，HLJ105、RY126、BY156、HLJ106、RY102 和BY141出苗相對較早，每年均在5 月11 日開始出苗，于5月20 日出苗結(jié)束，出苗率均達(dá)到85.0%以上；QY186、GD187、XY109、ZYS01、HB122 和HN162出苗相對較晚，5 月14 日開始出苗，5 月22 日出苗結(jié)束，出苗率均低于65.0%。

圖1 2018—2020年18份種質(zhì)材料出苗情況Fig. 1 Emergence of 18 germplasm materials in 2018-2020

2018—2020 年均在6 月3 日統(tǒng)計出苗率，由表1 可知，3 年出苗率較高的種質(zhì)材料為HLJ105、RY126、BY156、HLJ106、RY102 和BY141，平均出苗率為95.21%、94.63%、93.32%、90.50%、88.96%和85.93%；而出苗率較低的種質(zhì)材料為QY186、GD187、XY109、ZYS01、HN162 和HB122，平均出苗率為40.13%、41.88%、43.84%、45.34%、52.98%和65.56%。從3年氣溫變化、出苗情況、出苗率綜合比較，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 耐低溫性較強(qiáng)，QY186、GD187、XY109 和ZYS01 耐低溫性較弱。

表1 油莎豆種質(zhì)材料出苗率Table 1 Seedling emergence rates of all Cyperus esculentus germplasms

2.2 室內(nèi)低溫脅迫對油莎豆種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

由表2 可知，隨著處理溫度的降低，不同油莎豆種質(zhì)材料發(fā)芽指數(shù)均逐漸下降。3 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 種子發(fā)芽指數(shù)相對較高，與其他14 份材料差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）；QY186、GD187、XY109和ZYS01種子發(fā)芽指數(shù)相對較低，除與HN162差異不顯著外，與其余13 份材料差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。5 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 種子發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他14 份材料；QY186、GD187、XY109 和ZYS01 種子發(fā)芽指數(shù)相對較低，除與HN162、SX100 和JL154 差異不顯著外，顯著低于其余11 份材料。7 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156、HLJ106、RY102、BY141、NM103、JL154 和HN162共9份材料之間差異不顯著，但均顯著高于除LN181外的其他8份材料。9 ℃處理時，與對照組發(fā)芽指數(shù)基本一致，可達(dá)到對照組的97.6%。

表2 低溫脅迫對油莎豆種子發(fā)芽指數(shù)的影響Table 2 Effects of low temperature on germination index of Cyperus esculentus germplasms

由表3可知，隨著處理溫度的降低，除NM103外其他油莎豆種子活力指數(shù)逐漸下降。3 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 種子活力指數(shù)相對較高，與其他14 份材料差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）；QY186、GD187、XY109 和ZYS01 種子活力指數(shù)顯著低于其他14 份材料（P＜0.05）。5 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156、HLJ106、RY102和BY141 種子活力指數(shù)相對較高，與其他12 份材料差異均達(dá)顯著水平；QY186、GD187、XY109 和ZYS01 種子活力指數(shù)相對較低，與其他14 份材料差異均達(dá)顯著水平。7 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156、HLJ106、BY141、ZYS01、RY102 和LN181 這8 份材料之間差異不顯著，均與GD187之間差異顯著。9 ℃處理時，處理組較對照組相比活力指數(shù)下降幅度不大，可達(dá)到對照組的96.8%。

表3 低溫脅迫對油莎豆種子活力指數(shù)的影響Table 3 Effects of low temperature on seed vigor of Cyperus esculentus germplasms

2.3 低溫脅迫對油莎豆幼苗葉綠素含量的影響

隨著溫度的降低，油莎豆幼苗葉片葉綠素（a+b）含量逐漸降低（圖2）。3 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 葉綠素（a+b）含量較高；QY186、GD187、XY109 和ZYS01 葉綠素(a+b)含量較低。5 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106葉綠素（a+b）含量相對較高。7 和9 ℃處理時所有材料之間葉綠素（a+b）含量差別不明顯。

圖2 低溫脅迫對油莎豆幼苗葉片葉綠素含量的影響Fig. 2 Effects of low-temperature on the Chl（a+b） contents of Cyperus esculentus germplasms leaves

2.4 低溫脅迫對油莎豆幼苗葉片質(zhì)膜損傷程度的影響

隨著處理溫度的降低，油莎豆葉片相對膜透性逐漸增大（表4）。3 和5 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 與對照相比相對膜透性均增加，但顯著低于其他14 份種質(zhì)材料。3 和5 ℃處理，QY186、GD187、XY109 和ZYS01 與對照相比相對膜透性均增加，但顯著高于其他14 份材料。7 ℃處理下，QY186、GD187、XY109、HN162、JL154 和ZYS01 相對膜透性較大。9 ℃處理時，QY186 和GD187 相對膜透性與XJ101、BY141、RY102、BY156 和HLJ105 差異顯著，與其他材料之間差異不明顯。

3和5 ℃處理，丙二醛含量變化與相對膜透性基本相似，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 丙二醛含量較對照均增加，但丙二醛含量相對較少，顯著低于其他14 份種質(zhì)材料；QY186、GD187、XY109 和ZYS01 丙二醛含量較對照均增加，但丙二醛含量相對較大，顯著高于其他14 份材料。7 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156、RY114、SX100 和HLJ106 丙二醛含量相對較低，與除HN162 外的其他11 份材料差異顯著。9 ℃處理時，HLJ105、RY126、BY156、RY102、RY114、LN181、HLJ106 的丙二醛含量與QY186、GD187、XY109、ZYS01 之間差異顯著，與其他材料之間差異不顯著。

2.5 低溫脅迫對油莎豆幼苗葉片可溶性物質(zhì)含量的影響

除RY114 外，油莎豆葉片游離脯氨酸含量隨著溫度的降低急劇升高（表5）。當(dāng)處理溫度為3 ℃時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 游離脯氨酸含量顯著高于其他14 份材料；QY186、GD187、XY109和ZYS01顯著低于其他14份材料。處理溫度為5 ℃時，HLJ105、RY126、BY156、RY102、HLJ106 和BY141 游離脯氨酸含量顯著高于其他12 份材料。處理溫度為7 ℃時，HLJ105、RY126、BY156、RY102、BY141、RY114和HLJ106游離脯氨酸含量顯著高于其他11 份材料；處理溫度為9 ℃時，HLJ105、BY156 與HB122、QY186、GD187、XY109之間游離脯氨酸含量差異顯著。

除HN162 外，油莎豆葉片可溶性糖含量隨著溫度的降低而增加（表5）。處理溫度為3 ℃時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 可溶性糖含量顯著高于其他14 份材料；QY186、GD187、XY109和ZYS01 顯著低于其他14 份材料。在處理溫度5 ℃時，HLJ105、RY126、BY156、HLJ106、RY102、BY141 和RY114 可溶性糖含量顯著高于其他11份材料。在處理溫度7 ℃時，QY186、GD187、XY109、HN162、XJ101 和ZYS01 可溶性糖含量顯著低于其他12份材料。

2.6 低溫脅迫對油莎豆幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由表6 可知，SOD 活性隨著溫度的降低而升高（HN162 除外）。當(dāng)溫度降至3 ℃時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 葉片中SOD 活性顯著高于其他14 份材料；QY186、GD187、XY109 和ZYS01 顯著低于其他14 份材料。當(dāng)處理溫度為5 ℃時，HLJ105、RY126、BY156、HLJ106 和RY102材料葉片中SOD 活性顯著高于其他13 份材料；QY186、GD187、XY109 和ZYS01 顯著低于其他14份材料。7 和9 ℃時，HLJ105、RY126、BY156、HLJ106、RY102、BY141 和RY114 材料SOD 活性顯著高于其他11 份材料，其余材料之間差異不顯著。

表6 低溫脅迫對油莎豆幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Table 6 Effects of low-temperature on anti-oxidase activity of Cyperus esculentus germplasms leaves

POD 活性變化趨勢與SOD 大致相同。當(dāng)溫度降至3 ℃時，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106葉片中POD 活性顯著高于其他14 份材料；QY186、GD187、XY109 和ZYS01 顯著低于其他14份材料。當(dāng)溫度為5 ℃時，HLJ105、RY126、BY156、HLJ106、RY102、BY141和RY114材料葉片中POD 活性顯著高于其他11 份材料。當(dāng)溫度為7和9 ℃時，18份材料之間POD活性差異不顯著。

2.7 18份油莎豆種質(zhì)材料抗寒性綜合評價

18份油莎豆種質(zhì)材料抗寒性綜合評價情況見表7。參照劉慧民等[24]、張文娥等[25]的方法，將各材料綜合抗寒能力平均隸屬度分為5 級?？购跃C合評價值（cold-resistance integrated assessment value， IAV）≥0.70為強(qiáng)抗寒性，定為Ⅰ級；抗寒性綜合評價值在0. 60～0. 69為抗寒性，定為Ⅱ級；抗寒性綜合評價值在0.40～0. 59為中抗寒性，定為Ⅲ級；抗寒性綜合評價值在0. 30～0. 39為弱抗寒性，定為Ⅳ級；綜合評價值＜ 0.30 為不抗寒性，定為Ⅴ級。經(jīng)大田、室內(nèi)種子發(fā)芽和幼苗抗寒性試驗綜合評價HLJ105、RY126、BY156和HLJ106抗寒性綜合評價值分別為0.708 6、0.712 4、0.715 3 和0.705 4，為強(qiáng)抗寒性種質(zhì)材料；RY102和BY141抗寒性綜合評價值分別為0.616 0 和0.601 5，為抗寒性材料；RY114、NM103、XJ101、JL154、LN181 和SX100 抗寒性綜合評價值在0.40～0. 59，為中抗寒性材料；HB122 和HN162 抗寒性綜合評價值在0. 30～0. 39之間，為弱抗寒性材料；QY186、GD187、XY109 和ZYS01抗寒性綜合評價值均小于0.30，為不抗寒性材料。

表7 油莎豆各指標(biāo)隸屬函數(shù)值、權(quán)重及抗寒性綜合評價值Table 7 Subordinate function values，weight function and cold-resistance integrated evaluation values of all indexes in Cyperus esculentus germplasms

2.8 各測定指標(biāo)抗寒性相關(guān)分析

低溫脅迫下出苗率（ER）、發(fā)芽指數(shù)（GI）和超氧化物歧化酶（SOD）活性與抗寒性綜合平均值（IAV）相關(guān)系數(shù)分別為0.978 2、0.953 6和0.970 1，呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），出苗時間（ED）和丙二醛（MDA）含量與抗寒性綜合平均值（IAV）相關(guān)系數(shù)分別為-0.912 8 和-0.923 3，呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表8）。種子活力（VI）、葉綠素[Chl（a+b）]、游離脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）含量和過氧化物酶（POD）活性與抗寒性綜合評價值（IAV）呈正相關(guān)，但相關(guān)性均不顯著；相對膜透性（RMP）與抗寒性綜合評價值（IAV）呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)性不顯著。出苗率（ER）與發(fā)芽指數(shù)（GI）、種子活力（VI）呈正相關(guān)，相關(guān)性達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

表8 供試油莎豆材料各測定指標(biāo)及苗期抗寒相關(guān)性分析Table 8 Correlation analysis of subordinate function values of cold resistance index for tested varieties in Cyperus esculentus germplasms

3 討論

低溫不僅影響植物生長發(fā)育，而且限制其地理分布，當(dāng)受到低溫脅迫時植物可通過調(diào)節(jié)自身生理代謝和基因表達(dá)來增強(qiáng)低溫耐受性[26]。近年來，倒春寒現(xiàn)象在我國發(fā)生頻率逐漸上升，尤其東北地區(qū)更為嚴(yán)重，輕者補(bǔ)苗，重者毀種，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來不可估量的損失[27]。種子在吸脹萌動和初始發(fā)育階段對低溫最為敏感[28]。本團(tuán)隊前期通過低溫脅迫篩選出耐低溫和不耐低溫的花生品種，明確了耐低溫品種發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力和芽長均高于不耐低溫品種[7,29]。本試驗以油莎豆為研究對象，大田試驗中連續(xù)3 年經(jīng)歷倒春寒，HLJ105、RY126、BY156 和HLJ106 出苗時間較其他材料早3 d，出苗率均大于90.0%，并且與其他材料相比差異顯著，說明其耐低溫能力較強(qiáng)，低溫對其種子萌發(fā)出苗影響較??；而QY186、GD187、XY109 和ZYS01 出苗時間較其他材料晚，出苗率均小于50.0%，并且與其他材料相比差異顯著，說明其耐低溫能力較弱，倒春寒對其種子萌發(fā)出苗影響較大。室內(nèi)試驗發(fā)芽率、種子活力等指數(shù)與大田結(jié)果一致。

細(xì)胞膜對維持植物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性起著重要作用。低溫脅迫時，丙二醛含量激增，導(dǎo)致質(zhì)膜透性增大，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，引起相對電導(dǎo)率升高[30]。本研究顯示，隨著溫度的降低，18份種質(zhì)材料的質(zhì)膜透性和丙二醛含量均顯著升高，說明溫度越低油莎豆葉片細(xì)胞膜受冷害程度越嚴(yán)重；當(dāng)溫度降至3和5 ℃時，材料HLJ105、RY126、BY156和HLJ106 的相對膜透性和丙二醛含量上升幅度低于其他材料，而QY186、GD187、XY109 和ZYS01 上升幅度高于其他材料，說明耐低溫性強(qiáng)的油莎豆材料細(xì)胞膜受低溫傷害較小，抗寒性優(yōu)于其他材料。質(zhì)膜透性和丙二醛含量呈顯著正相關(guān)，說明油莎豆葉片質(zhì)膜損傷大部分是由丙二醛含量積累所導(dǎo)致，與之前花生抗寒性評價研究結(jié)果不一致[29]，有待進(jìn)一步深入研究。