曹輝 ， 董靜 ， 賈宇 ， 江一帆

華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，抗體藥物河北省工程研究中心，抗體藥物研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050015

生物藥物在國際醫(yī)藥市場中占據(jù)主導(dǎo)地位，截至2023年，全球范圍內(nèi)已有100多個抗體藥物被批準(zhǔn)上市，近1200個抗體藥物處于不同臨床試驗(yàn)階段［1］。2021年全球暢銷藥品Top10中，生物藥品占了7個，其中單克隆抗體藥物4個，這些單抗藥物均由重組中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞表達(dá)［2］。

CHO細(xì)胞在單抗工業(yè)生產(chǎn)中具有明顯的優(yōu)勢，如表達(dá)產(chǎn)品具有和人類抗體類似的翻譯后修飾；重組蛋白可胞外表達(dá)，便于目的蛋白分離純化；CHO細(xì)胞由于非人源，可以減少人類病毒交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)；同時CHO細(xì)胞具有較長的培養(yǎng)周期，可以進(jìn)行無血清、高密度、懸浮大規(guī)模培養(yǎng)，從而獲得高純度目的蛋白［3-4］。隨著CHO細(xì)胞的廣泛應(yīng)用，圍繞CHO細(xì)胞開發(fā)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)用設(shè)備、耗材種類日益豐富［5-7］，越來越多的開發(fā)項(xiàng)目也使得CHO細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品質(zhì)量研究相對透徹，CHO細(xì)胞也成為目前市場上超過84%蛋白藥物的首選宿主細(xì)胞［7］。

1957年，Puck通過中國倉鼠卵巢組織分離獲得CHO細(xì)胞，1970年野生型CHO-K1保存于ATCC，1985年分離得到的CHO-K1亞克隆保存于ECACC［8-9］。此后多家藥企使用懸浮培養(yǎng)基將野生型CHO-K1細(xì)胞懸浮馴化并作為宿主細(xì)胞使用，比如Merck、Lonza等公司。1973年Thompson從原始細(xì)胞中分離了1株可用于懸浮培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，1980年Gibco公司將此細(xì)胞馴化至CD CHO培養(yǎng)基中，建立了CHO-S細(xì)胞和GMP細(xì)胞庫。1983年，Urlaub等［9-10］通過突變一個基因，篩選出雙等位DHFR基因敲除的CHO宿主細(xì)胞，并命名為CHO-DG44。圖1展示了CHO細(xì)胞譜系。然而，由于培養(yǎng)條件、篩選方式等不同，不同CHO細(xì)胞在基因組、新陳代謝乃至細(xì)胞形態(tài)、生長方式、蛋白表達(dá)等方面具有較大的差異。

圖1 CHO細(xì)胞譜系圖Fig. 1 CHO cell lineage

1 CHO細(xì)胞不同亞型染色體差異

研究表明，ATCC保存的野生型CHO-K1細(xì)胞和中國倉鼠基因組相比，已經(jīng)產(chǎn)生了25711個染色體結(jié)構(gòu)多樣性，包含13735個插入和11976個缺失［11］。在隨后的細(xì)胞系建立及培養(yǎng)過程中，突變?nèi)匀辉诓粩喈a(chǎn)生。CHO細(xì)胞可能的突變貫穿于長期傳代過程中的每次細(xì)胞分裂，包括插入、缺失、點(diǎn)突變等序列變異以及染色體結(jié)構(gòu)變異，足夠量突變的積累可能產(chǎn)生染色體結(jié)構(gòu)變異，導(dǎo)致染色體不平衡重排，致使CHO細(xì)胞染色體重排成為一種常見現(xiàn)象［12-13］。由于整個染色體的丟失或獲得，這些染色體結(jié)構(gòu)的變異還會被非整倍體補(bǔ)充，進(jìn)而表現(xiàn)為染色體非整倍性和結(jié)構(gòu)改變，因此成為永生細(xì)胞的特征性標(biāo)志［14-15］。

由于上述原因，CHO細(xì)胞沒有明確的染色體數(shù)目［16］。大量文獻(xiàn)顯示，CHO-S細(xì)胞具有和原始中國倉鼠細(xì)胞相似的染色體數(shù)目（22條），長期傳代時染色體數(shù)目沒有變化；CHO-DG44有20條染色體（19～21條染色體）；CHO-K1細(xì)胞在傳代過程中染色體數(shù)目明顯減少（18～20條染色體），CHOK1在有谷氨酰胺培養(yǎng)基長期傳代情況下，染色體數(shù)目下降到19條，而在無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中長期傳代，染色體數(shù)下降到18條［17-20］。但隨著培養(yǎng)時間的推移，細(xì)胞株染色體數(shù)目沒有再發(fā)生明顯變化。因此，雖然每個細(xì)胞株都有其特征性的染色體數(shù)，但細(xì)胞群體內(nèi)染色體數(shù)的變化是隨機(jī)發(fā)生且不可預(yù)測的，發(fā)生機(jī)制還未徹底揭示［21］。其原因可能是，細(xì)胞在體外人工高氧、富營養(yǎng)的培養(yǎng)條件下，快速分裂、增殖，積累大量突變造成染色體變異。另外，CHO細(xì)胞有較多的端粒序列重復(fù)，序列相似性增加了染色體易位發(fā)生的可能性。隨著培養(yǎng)時間的增加，這些變異會隨機(jī)積累，從而產(chǎn)生較大的染色體突變［22-25］。

CHO細(xì)胞在染色體突變過程中，有些染色體相對保守，圍繞這些相對保守染色體的研究對于細(xì)胞轉(zhuǎn)染及獲得穩(wěn)定克隆具有重要意義［26］。不同的培養(yǎng)基和傳代過程會導(dǎo)致觀察到的未變異染色體不完全相同。CHO-DG44細(xì)胞所有染色體中有5條或者7條是正常染色體，包括Chr1的2個拷貝，以及Chr2、Chr4、Chr5、Chr8和Chr9的1個拷貝，且Chr4存在染色體缺失或延長情況。在CHO-K1細(xì)胞的所有染色體中，有8條左右是正常的，包括Chr1和Chr5的2個拷貝，Chr2、Chr3、Chr8和Chr9的1個拷貝，其他染色體均發(fā)生重排。綜上所述，CHO-K1和CHO DG44相對保守的染色體，包括Chr1、Chr2、Chr8和Chr9［26-27］。這些保守的染色體可以作為定點(diǎn)整合或隨機(jī)整合的理想靶點(diǎn)［28-30］。

2 CHO細(xì)胞不同亞型生長狀態(tài)和表達(dá)差異性

CHO細(xì)胞常見的幾種亞型中，CHO-S被公認(rèn)為是比生長速度（specific growth rate）最高的細(xì)胞，具有最短的倍增時間［31］。有研究發(fā)現(xiàn)，CHOK1、CHO-DG44和CHO-S 3種宿主細(xì)胞的倍增時間分別為24±2、27±2和18±2 h［32］。本團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)的宿主細(xì)胞CHO-K1、CHO-DG44（使用CD CHO培養(yǎng)基）倍增時間分別為19.49±0.38和17.80±0.97 h，與Xu等［31］報(bào)道的培養(yǎng)倍增時間不同，這可能是相同亞型宿主細(xì)胞在不同實(shí)驗(yàn)室長期傳代積累發(fā)生突變造成的差異，也可能是培養(yǎng)條件引起的。

有研究發(fā)現(xiàn)，CHO-S細(xì)胞中糖酵解及三羧酸循環(huán)中重要的酶類蛋白、與細(xì)胞生長相關(guān)蛋白（如肌球蛋白）和細(xì)胞周期依賴性激酶表達(dá)水平較高。其中，肌球蛋白可能和細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞形態(tài)維持等有關(guān)，細(xì)胞周期依賴性激酶與細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄、mRNA加工有關(guān)，同時CHO-S細(xì)胞具有最高的葡萄糖消耗速率，以上結(jié)果可能是CHO-S細(xì)胞生長速度快的原因［32-33］。而CHO-DG44細(xì)胞中與細(xì)胞生長相關(guān)蛋白表達(dá)水平及葡萄糖消耗速率相對較低可能導(dǎo)致了CHO-DG44的生長速度最慢。在長期培養(yǎng)過程中，持續(xù)的培養(yǎng)一般會使細(xì)胞生長速率增加，但是細(xì)胞生長速率增加現(xiàn)象是隨機(jī)出現(xiàn)的，說明染色體突變是隨機(jī)的。

轉(zhuǎn)入目的基因后，比生長速率最快的依然是CHO-S細(xì)胞。CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S 3種宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染攜帶相同目的基因的相同質(zhì)粒，單克隆通過不同的方式培養(yǎng)，無論是批式培養(yǎng)（batch culture）、批式補(bǔ)料培養(yǎng)（fed-batch culture），還是灌注培養(yǎng)（perfusion cultuer），CHO-S細(xì)胞都有最快的比生長速率，并能最快到達(dá)最高密度。而所有培養(yǎng)方式中，CHO-K1細(xì)胞比生長速率最慢；在最高密度方面，批式培養(yǎng)獲得的CHO-S細(xì)胞和CHO-DG44細(xì)胞比CHO-K1細(xì)胞有更高的密度；批式補(bǔ)料培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)中，CHO-DG44細(xì)胞密度最高，CHO-K1最高密度相對最低［10，34］?；蚪M學(xué)研究表明，CHO細(xì)胞為了適應(yīng)無血清條件下的高密度生長，其促細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)比中國倉鼠細(xì)胞明顯下降，抗凋亡基因表達(dá)明顯上升［11］。除基因表達(dá)水平外，凋亡相關(guān)基因拷貝數(shù)的改變也可以影響細(xì)胞生長，CHO細(xì)胞亦不例外［11，35］。

CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S 3種宿主細(xì)胞在抗體表達(dá)和密度方面的表現(xiàn)是相反的，與宿主細(xì)胞相比，不同培養(yǎng)基對于抗體比生長速率的影響較小。在批式補(bǔ)料培養(yǎng)中，抗體比生產(chǎn)率由高到低依次是：CHO-K1細(xì)胞、CHO-DG44細(xì)胞、CHO-S細(xì)胞，其中CHO-K1細(xì)胞的抗體比生產(chǎn)速率是DG44細(xì)胞的2～3倍，是CHO-S細(xì)胞的6～8倍，且補(bǔ)料并沒有給CHO-S細(xì)胞帶來很大的表達(dá)提升［34］。因此，CHO-K1細(xì)胞作為工程細(xì)胞表達(dá)抗體，具有低密度、高表達(dá)的特點(diǎn)。

研究表明，CHO-DG44細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄速率方面可能存在瓶頸，其與轉(zhuǎn)錄及糖酵解過程相關(guān)的蛋白表達(dá)水平均次于CHO-K1。蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CHO-K1細(xì)胞中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的幾種蛋白表達(dá)水平較高，如核糖核苷二磷酸還原酶、核仁素蛋白、核仁素相關(guān)蛋白NRP等［32］。同時，CHO-K1細(xì)胞有更大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，更豐富的線粒體基因組變異和異質(zhì)性以及與之對應(yīng)的高細(xì)胞特異性抗體表達(dá)量［36］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對于分泌蛋白的折疊組裝非常關(guān)鍵，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里不可逆地錯誤折疊蛋白超過一定限度，細(xì)胞將啟動未折疊蛋白響應(yīng)機(jī)制，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。因此，大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有利于分泌蛋白的高產(chǎn)率，也有利于高產(chǎn)細(xì)胞的存活和蛋白加工。豐富的線粒體基質(zhì)有利于細(xì)胞自我供能，便于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工處理未折疊的蛋白［37-39］。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體占據(jù)了細(xì)胞內(nèi)大量的空間，因此抗體表達(dá)量也反映在細(xì)胞體積上。研究發(fā)現(xiàn)，灌流培養(yǎng)時高產(chǎn)的CHO-K1細(xì)胞直徑15.7±0.7 μm，CHO-DG44細(xì)胞直徑14.2±0.5 μm，CHO-S細(xì)胞直徑13.7±1.1 μm［34，40］。

熱穩(wěn)定性的增加可提高抗體表達(dá)水平，而熱穩(wěn)定性與宿主細(xì)胞有關(guān)［41-42］。研究表明，CHODG44和CHO-K1表達(dá)抗體熱穩(wěn)定性接近，均明顯高于CHO-S表達(dá)抗體熱穩(wěn)定性［34］。然而，熱穩(wěn)定性差異影響蛋白質(zhì)表達(dá)的機(jī)制尚未明確，IgG1鏈間二硫鍵附近LC端絲氨酸的有無可能是影響抗體穩(wěn)定性的原因之一［43］。

3 CHO細(xì)胞不同亞型的糖型差異

抗體糖基化位點(diǎn)的組成主要是G0F、G1F、G2F，偶爾會有1個或2個唾液酸殘基，甘露糖基化、巖藻糖基化和無糖基化，這些受培養(yǎng)基影響較小，主要受細(xì)胞株影響［44］。CHO-DG44細(xì)胞表達(dá)單克隆抗體，相對于CHO-K1細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞表達(dá)的抗體甘露糖基化程度高（CHO-S：2%～3%；CHO-K1：5%～9%；CHO-DG44：11%～13%）；抗體產(chǎn)物巖藻糖基化在CHO-S細(xì)胞中最高（94%～96%），其次是CHO-K1細(xì)胞（82%～84%）和CHODG44細(xì)胞（71%～83%）；抗體無糖基化修飾在CHO-K1細(xì)胞（2%～5%）和CHO-S細(xì)胞（1%）中含量較低，且在CHO-DG44培養(yǎng)物中未檢測到［34-45］。

半乳糖基化很大程度上受培養(yǎng)基影響，比如培養(yǎng)基里的尿苷、氯化錳和半乳糖等成分，但同時細(xì)胞株對其也有一定程度影響［46-47］。CHO-K1細(xì)胞相對于CHO-DG44細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞可以達(dá)到較高的抗體半乳糖基化水平，而CHO-S細(xì)胞半乳糖基化水平最低。唾液酸化水平較高的是CHOK1細(xì)胞（21%～36%），其次是CHO-DG44（15%～19%）和CHO-S細(xì)胞（6%～15%），原因可能是唾液酸形成相關(guān)酶類在CHO-K1中表達(dá)水平較高，如ST3GAL1、ST3GAL 2、ST3GAL 5、ST3GAL 6等［34，48］。

不同宿主細(xì)胞存在糖基化之間的差異［49］。CHO-K1細(xì)胞雖然僅有3個糖型相關(guān)酶且與人類沒有同源性，糖型修飾與人類仍具有一定的差別，如CHO基因組中N-乙酰葡萄糖胺相關(guān)酶類基因不會全部表達(dá)，因此CHO細(xì)胞不會生產(chǎn)含有二等分N-乙酰葡萄糖胺殘基的糖型蛋白；另一方面，CHO細(xì)胞基因組相對簡單，因此容易進(jìn)行基因修飾，如僅通過敲除巖藻糖轉(zhuǎn)移酶8（fucosyltransferase 8，F(xiàn)UT8）基因即可去除蛋白的N-糖巖藻糖修飾，從而增加抗體ADCC效應(yīng)，原因在于CHO-K1細(xì)胞巖藻糖轉(zhuǎn)移酶中僅有該基因表達(dá)［11，50-52］。CHODG44和CHO-S細(xì)胞來源于CHO-K1，在此基礎(chǔ)上，糖型結(jié)構(gòu)又發(fā)生了一些變化。

有研究發(fā)現(xiàn)，中國倉鼠有256種酶，CHO-K1細(xì)胞、CHO-DG44細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞分別至少突變13%、2%、25%，雖然不是所有的突變都影響酶活或者存在底物偏好，但在漫長的糖型演化過程中，這些突變增加了最終糖型變化的可能性［11，34］。這就是不同的CHO表達(dá)系統(tǒng)會產(chǎn)生不同糖型的原因。

4 展望

在構(gòu)建不同CHO細(xì)胞系的過程中，基因乃至染色體已經(jīng)發(fā)生了明顯變化，這些改變進(jìn)一步影響了不同細(xì)胞系的代謝和生長方式。CHO-S細(xì)胞染色體數(shù)目和原始中國倉鼠細(xì)胞相似，但是CHOS細(xì)胞中糖酵解和三羧酸循環(huán)中重要酶類的高水平表達(dá)表現(xiàn)為CHO-S產(chǎn)生最高的葡萄糖消耗速率，從而使得CHO-S細(xì)胞表現(xiàn)出較快的生長速率；Dhfr基因的敲除可能導(dǎo)致該細(xì)胞系細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)量下降，從而導(dǎo)致CHO-DG44生長較慢；CHO-K1數(shù)目可能較少，但含有豐富的能量代謝關(guān)鍵物質(zhì)，因此生長較快［27，31，48］。

除細(xì)胞系的建立過程外，長期傳代和培養(yǎng)過程中，CHO細(xì)胞也會持續(xù)積累變異，甚至造成染色體結(jié)構(gòu)變異，并且這些變異具有隨機(jī)性，是不可預(yù)測和不可控的［12］。內(nèi)在遺傳不穩(wěn)定性是CHO的蛋白表達(dá)可能出現(xiàn)不穩(wěn)定性的因素之一，持續(xù)變異是否影響產(chǎn)品質(zhì)量，需持續(xù)關(guān)注并展開相關(guān)研究。除保證細(xì)胞系的單克隆源性及穩(wěn)健的控制策略外，CHO細(xì)胞中存在的相對保守的DNA序列使得目的基因定點(diǎn)整合到保守基因序列成為一個較好的選擇［12，53-55］。但是目前大部分項(xiàng)目都是使用相對成熟的隨機(jī)整合方式，整合位點(diǎn)所在區(qū)域如果不是保守區(qū)域，則需要評估基因突變以及染色體變異與重組蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性之間有無直接的相關(guān)性。無論定點(diǎn)整合還是隨機(jī)整合，均需進(jìn)行細(xì)胞株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以證明重組細(xì)胞不同代次表達(dá)產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。

除不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式外，細(xì)胞系本身也可以影響抗體表達(dá)量及質(zhì)量。CHO-K1細(xì)胞有利于抗體表達(dá)，CHO-S有利于細(xì)胞量積累，而CHODG44表達(dá)能力和細(xì)胞生長表現(xiàn)居中［34］。高培養(yǎng)密度會帶來高耗氧，高消耗營養(yǎng)物質(zhì)，從而給培養(yǎng)過程帶來壓力，因此從便于培養(yǎng)和提高目的產(chǎn)物積累效率角度來看，CHO-K1細(xì)胞的表現(xiàn)最優(yōu)秀，具有高抗體比生產(chǎn)率、高表達(dá)和低細(xì)胞密度的特點(diǎn)［34，56-57］。同時，CHO-K1的低密度特點(diǎn)給工藝和培養(yǎng)基開發(fā)留出了更大的可操作空間，比如在CHO-K1細(xì)胞低密度基礎(chǔ)上進(jìn)行培養(yǎng)基和培養(yǎng)工藝開發(fā)，以便于帶來更大的抗體收獲量。

不同宿主細(xì)胞由于遺傳背景不同會影響抗體產(chǎn)量和質(zhì)量，因此宿主細(xì)胞選型需要結(jié)合目的蛋白預(yù)期的質(zhì)量屬性。糖型也可能影響生物藥物的藥效，因此需要將生物藥的安全性、有效性和糖型結(jié)果關(guān)聯(lián)，進(jìn)而指導(dǎo)宿主細(xì)胞選擇［58］。糖型本身也可能影響抗體電荷異質(zhì)性，CHO細(xì)胞系建立過程中產(chǎn)生了大量基因變異，這些變異可能影響目的蛋白翻譯后修飾，因此宿主細(xì)胞可能通過多種方式對抗體電荷異質(zhì)性產(chǎn)生影響，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究［59］。