劉彥婷,張欣悅,曾維惠,馬慧群,牛新武,耿松梅

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, cSCC)是最常見(jiàn)的皮膚惡性腫瘤,具有侵襲性和潛在的生命威脅［1-3］。低風(fēng)險(xiǎn)cSCC可通過(guò)局部治療或手術(shù)切除治愈,但不適合切除及高風(fēng)險(xiǎn)cSCC則對(duì)治療提出更高要求［1, 4］。全反式維A酸(all-trans retinoic acid, ATRA)具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡的重要作用,在多種腫瘤中抑制其發(fā)生和進(jìn)展［5］。ATRA作為抗腫瘤藥物,已成功應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防和治療,包括急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和cSCC等［5-6］,并在2021年為《中國(guó)皮膚鱗狀細(xì)胞癌診療專(zhuān)家共識(shí)》推薦用于高風(fēng)險(xiǎn)SCC輔助治療［7］。但是,臨床上ATRA耐藥情況常見(jiàn),cSCC對(duì)ATRA治療抵抗機(jī)制尚不明確［6］。

干細(xì)胞更新因子BMI-1在腫瘤的形成、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程和腫瘤耐藥機(jī)制中都有著非常重要的作用［8］。研究表明,沉默BMI-1可顯著改善胃癌、骨髓瘤和頭頸部鱗癌等腫瘤的化療敏感性,提高了抗腫瘤效率［8-10］。 BMI-1在cSCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著增加,包括A431 細(xì)胞［11］。cSCC中BMI-1高表達(dá)是否影響其腫瘤細(xì)胞對(duì)ATRA治療的藥物敏感性尚不清楚。筆者推測(cè),降低BMI-1表達(dá)可能成為增強(qiáng)ATRA敏感性的途徑。本研究通過(guò)構(gòu)建BMI-1沉默的A431細(xì)胞株,通過(guò)細(xì)胞增殖能力及小鼠成瘤實(shí)驗(yàn),探討ATRA在cSCC治療中藥物敏感性的變化及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1構(gòu)建BMI-1基因沉默A431細(xì)胞株 A431細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法分別將無(wú)關(guān)序列vector和BMI-1干擾序列shBMI-1(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)轉(zhuǎn)染至A431細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選、傳代、收集和提取細(xì)胞的總RNA和蛋白,進(jìn)行Real-time PCR、Western blot和免疫熒光檢測(cè)BMI-1的表達(dá)水平,確認(rèn)成功構(gòu)建BMI-1基因沉默的A431細(xì)胞系(A431-shBMI-1)。

1.2Real-time PCR 使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞RNA,借助Prime Script RT試劑盒 (Takara, 日本)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增 (Applied Biosystems PCR儀,美國(guó)),每個(gè)反應(yīng)體系總體積為20 μL,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃30 s,40 cycles。檢測(cè)指標(biāo)的引物如下:BMI-1:5′-CTGGTTGCCCATTGACAGCG -3′ and 5′-AAATCCCGGAAAGAGCAGCC -3′; ABCB1:5′-TGACTCAGGAGCAGAAGTTTGAACA-3′ and 5′-AAATACATCATTGCCTGGGTGAAG-3′; ABCC3:5′-GACAGATCCCAGATGGTGGTG-3′ and 5′-GGTGCTGCTGAAGCCTTGTG-3′; β-actin (internal control):5′-TGGCACCCAGCACAATGAA -3′ and 5′-C TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA -3′。結(jié)果分析:采用2-△△Ct法分析。

1.3Western blot 提取各組細(xì)胞的蛋白,裂解后測(cè)定每個(gè)樣本的蛋白濃度,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗BMI-1 (Abcam, 英國(guó))、ABCB1 (Cell Signaling Technology, 美國(guó))、ABCC3(Santa Cruz, 美國(guó))和β-actin (Santa Cruz, 美國(guó)),4 ℃ 孵育過(guò)夜后用TBST洗膜液漂洗3次,再進(jìn)行二抗 (Santa Cruz,美國(guó))孵育,洗膜、發(fā)光、拍照,測(cè)定條帶的面積及灰度值,以平均灰度值表示蛋白質(zhì)相對(duì)含量,并計(jì)算目的蛋白/β-actin比值,表示目的蛋白在各組的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4細(xì)胞增殖能力檢測(cè) ① MTT法:用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板,ATRA(濃度:10、20、40、60、80 μmol/L)作用培養(yǎng)細(xì)胞24/48 h后,每孔加入MTT溶液20 μL,孵育4 h后終止培養(yǎng),加入DMSO,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值,記錄結(jié)果。② EdU法:分組同前,干預(yù)24 h后,每孔加入EdU培養(yǎng)基(試劑盒購(gòu)于廣州銳博生物),細(xì)胞固定、染色、脫色、清洗等步驟后,于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果,紅色熒光反應(yīng)細(xì)胞DNA復(fù)制活性。

1.5小鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 20只6周齡雌性裸鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,分為2組,每組10只,分別于小鼠右側(cè)臀部注射A431-vector細(xì)胞和A431-shBMI-1細(xì)胞3×106個(gè),于第6天進(jìn)行隨機(jī)分組,即將之前的兩組分別再分為兩組,共4組(A431-vector組;A431-vector+ATRA組;A431-shBMI-1組;A431-shBMI-1+ATRA組),每組5只,第6～14天給予腹腔注射ATRA(10 mg/kg·d),測(cè)量瘤體大小及重量,于15 d(對(duì)照組腫瘤直徑10～15 mm)時(shí)處死小鼠,剝離瘤體并測(cè)量其大小及重量(瘤體體積=a×b2/2)。

1.6免疫組織化學(xué) 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,選取A431-vector細(xì)胞和A431-shBMI-1細(xì)胞成瘤的瘤體,進(jìn)行石蠟包埋、切片、抗原修復(fù)、封閉、孵育一抗(BMI-1和RARβ,Abcam, 英國(guó))、二抗、DAB顯色等步驟,完成BMI-1和RAR在瘤體中的免疫組化檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1檢測(cè)A431-shBMI-1細(xì)胞株的BMI-1表達(dá) 通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染使BMI-1-shRNA序列進(jìn)入靶基因后,導(dǎo)致BMI-1基因沉默,靶基因序列為GAAAGTAAACAAAGACAAA。提取A431、A431-vector和A431-shBMI-1三組細(xì)胞的RNA和蛋白,Real-time PCR(F=235.30,P<0.001)和Western blot結(jié)果(F=163.10,P<0.001)一致顯示,與陰性對(duì)照組(A431-vector)相比,A431-shBMI-1組細(xì)胞的BMI-1表達(dá)水平明顯降低,表明穩(wěn)定沉默BMI-1的A431細(xì)胞株構(gòu)建成功,見(jiàn)圖1。

Note:* P<0.05 compared with the control group.

2.2沉默BMI-1后ATRA對(duì)A431細(xì)胞作用的影響 ATRA作用A431細(xì)胞48 h的殺傷效果強(qiáng)于24 h,且在同樣濃度的藥物作用下,BMI-1沉默組的細(xì)胞較對(duì)照組存活率更低,BMI-1沉默組的細(xì)胞需要較低的藥物濃度就可以達(dá)到與對(duì)照組同樣的殺傷率。BMI-1沉默組的細(xì)胞,增殖能力相比對(duì)照組細(xì)胞減弱;不同濃度的ATRA作用A431細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn),同樣濃度的ATRA,BMI-1基因沉默組的細(xì)胞增殖能力明顯低于陰性對(duì)照組(t=17.19、7.30、6.93、8.57,P<0.01)。MTT和EdU結(jié)果一致顯示,沉默BMI-1能夠增加A431細(xì)胞對(duì)ATRA的作用敏感性,見(jiàn)圖2。

2.3檢測(cè)耐藥基因ABCB1和ABCC3的表達(dá) 通過(guò)Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)了BMI-1沉默前后A431細(xì)胞耐藥基因ABCB1和ABCC3的表達(dá),結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,BMI-1基因沉默組細(xì)胞耐藥蛋白的mRNA(F=54.45、13.85,P<0.01)和蛋白表達(dá)水平(F=469.54、172.10,P<0.001)明顯減少,這提示了沉默BMI-1可能通過(guò)下調(diào)耐藥蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),從而提高A431細(xì)胞對(duì)ATRA的作用敏感性,見(jiàn)圖3。

2.4沉默BMI-1對(duì)ATRA抑制A431細(xì)胞成瘤能力的影響 小鼠成瘤后進(jìn)行ATRA干預(yù),檢測(cè)瘤體體積和腫瘤,瘤體體積的變化如下,與陰性對(duì)照組(612.01±231.74)mm3相比,BMI-1基因沉默組(205.13±46.05) mm3及ATRA作用組(283.20±98.12)mm3的腫瘤大小明顯減小,沉默BMI-1與ATRA聯(lián)合治療組(147.65±57.43)mm3的腫瘤體積最小(n=5,F=4.82,P<0.05)。瘤體重量的變化如下,與陰性對(duì)照組(437.20±122.12) mg相比,BMI-1基因沉默組( 193.60±44.77) mg及ATRA作用組(223.00±58.69) mg的腫瘤重量明顯降低,沉默BMI-1與ATRA聯(lián)合治療組(125.00±40.44) mg的腫瘤體積最小(n=5,F=5.36,P<0.05)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)的體積曲線和腫瘤重量結(jié)果的趨勢(shì)一致,見(jiàn)圖4。

Note:*P< 0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 compared with the control group.

2.5小鼠成瘤中沉默BMI-1對(duì)維A酸受體β(retinoic acid receptor β, RARβ)表達(dá)的影響 為了驗(yàn)證體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中BMI-1的敲減效率,在裸鼠成瘤的瘤體組織通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了BMI-1的表達(dá),結(jié)果顯示,和陰性對(duì)照組相比,A431-shBMI-1組的瘤體中BMI-1表達(dá)顯著降低,再次證實(shí)BMI-1基因敲減成功。為了進(jìn)一步研究BMI-1增強(qiáng)ATRA敏感性的機(jī)制,在瘤體中檢測(cè)RARβ的表達(dá)變化,與陰性對(duì)照組相比,BMI-1基因沉默組的RARβ表達(dá)明顯增加(t=144.63、116.93,P<0.001),提示RARβ可能參與了BMI-1改善ATRA耐藥的過(guò)程,見(jiàn)圖5。

3 討論

ATRA具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡的能力,在多種癌癥中發(fā)揮了抗癌活性,包括cSCC［5-6, 12］。既往研究發(fā)現(xiàn),ATRA通過(guò)抑制端粒酶活性從而抑制cSCC細(xì)胞(HSC-1)的增殖［13］,ATRA通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) -AP1途徑從而抑制cSCC細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯［14］,表明ATRA對(duì)cSCC具有明確的抑制作用。筆者的研究發(fā)現(xiàn),ATRA以濃度和時(shí)間依賴(lài)的方式抑制A431細(xì)胞的增殖,在加入ATRA并孵育24 h和48 h后,MTT結(jié)果表明,高濃度ATRA對(duì)cSCC增殖有明顯抑制作用,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致,再次證實(shí)了ATRA對(duì)cSCC細(xì)胞增殖的抑制作用。然而,臨床中存在高危型cSCC對(duì)ATRA治療不敏感,提示部分cSCC存在對(duì)ATRA耐藥的現(xiàn)象。為了避免高濃度ATRA藥物不良反應(yīng),提高ATRA對(duì)cSCC的療效,分析ATRA耐藥機(jī)制,探索增強(qiáng)ATRA的藥物敏感性具有非常重要的臨床意義。

腫瘤干細(xì)胞在ATRA耐藥過(guò)程中有重要貢獻(xiàn),組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase,HDAC)能夠通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞分化從而改善ATRA的治療抵抗［15］。已知干細(xì)胞更新因子BMI-1在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用,且在cSCC及維A酸作用不敏感的A431細(xì)胞中高表達(dá),提示下調(diào)BMI-1可能成為增強(qiáng)ATRA作用cSCC的重要途徑。在本研究中,構(gòu)建BMI-1沉默的A431細(xì)胞株,探討沉默BMI-1是否能增強(qiáng)ATRA對(duì)鱗狀細(xì)胞癌的藥物敏感性。結(jié)果表明,在ATRA處理后,沉默的BMI-1細(xì)胞的存活率與對(duì)照組相比顯著下降,并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。此外,EdU結(jié)果顯示,ATRA處理24 h后,BMI-1沉默組細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組細(xì)胞明顯下降。上述結(jié)果提示,BMI-1高表達(dá)可能是A431細(xì)胞對(duì)ATRA治療抵抗的重要阻礙因素,而下調(diào)BMI-1表達(dá)可增加ATRA的藥物敏感性。

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了BMI-1對(duì)ATRA作用cSCC敏感性的影響,沉默BMI-1后,腫瘤的成瘤能力顯著下降,ATRA干預(yù)組的成瘤能力較對(duì)照組也顯著下降,這與細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)一致,表明沉默BMI-1或ATRA干預(yù)能夠抑制cSCC的進(jìn)展。此外,單獨(dú)沉默BMI-1基因與單獨(dú)ATRA作用相比,前者對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更明顯,提示BMI-1基因?qū)[癌的進(jìn)展非常重要,是一個(gè)不可忽視的有效的治療靶點(diǎn)。值得關(guān)注的是,在BMI-1沉默組使用ATRA干預(yù)后,腫瘤的成瘤能力下降最為顯著,提示沉默BMI-1和ATRA治療對(duì)抑制cSCC的增殖具有協(xié)同作用,也就是說(shuō),降低BMI-1表達(dá)能夠增加cSCC對(duì)ATRA的敏感性。

ATRA耐藥機(jī)制復(fù)雜,與維A酸受體異常、腫瘤干細(xì)胞、維A酸代謝和CRABP-Ⅱ和FABP5信號(hào)通路、耐藥蛋白表達(dá)等相關(guān)［5, 15］。在本研究中,沉默BMI-1一方面降低了腫瘤的干性,從而增強(qiáng)了ATRA的敏感性。另一方面,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在多種惡性腫瘤中高表達(dá),它們通過(guò)影響化療藥物的攝取和運(yùn)輸,導(dǎo)致腫瘤的化療敏感性降低［16］。但是,在BMI-1調(diào)控A431細(xì)胞對(duì)ATRA敏感性的過(guò)程中,是否涉及ABC家族蛋白的改變尚不可知。本研究檢測(cè)了沉默BMI-1前后ABCB1和ABCC3兩種耐藥蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,上述兩種耐藥蛋白的表達(dá)與BMI-1的表達(dá)呈正相關(guān),降低BMI-1的表達(dá)明顯下調(diào)了ABCB1和ABCC3的蛋白表達(dá)水平。這一結(jié)果提示沉默BMI-1在增加ATRA作用敏感性的過(guò)程中,除了細(xì)胞干性降低以外,耐藥蛋白的表達(dá)下調(diào)也參與其中。此外,既往研究發(fā)現(xiàn),RARβ表達(dá)減少或缺失,是導(dǎo)致腫瘤對(duì)ATRA不敏感的重要原因之一,而重新升高RARβ表達(dá)后可恢復(fù)ATRA對(duì)細(xì)胞的促凋亡和周期停滯作用［17］。本研究在瘤體組織中檢測(cè)RARβ表達(dá),發(fā)現(xiàn)BMI-1沉默組的RARβ表達(dá)顯著升高,因此,筆者推測(cè),RARβ表達(dá)的增加可能參與了BMI-1對(duì)ATRA作用敏感性的調(diào)控。

綜上所述,沉默BMI-1和ATRA均可抑制cSCC腫瘤細(xì)胞增殖,且二者具有協(xié)同作用,即沉默BMI-1能夠顯著增強(qiáng)cSCC對(duì)ATRA的敏感性,耐藥蛋白的降低和維A酸受體RARβ表達(dá)的升高可能參與這一過(guò)程,提示BMI-1可能成為調(diào)控cSCC進(jìn)展的重要靶點(diǎn),并且,抑制BMI-1聯(lián)合ATRA可能成為治療cSCC的潛在策略。