孫澳,王藝萌,張春雷

病毒與腫瘤發(fā)展密切相關(guān),據(jù)估計,全世界約有15%的腫瘤與感染相關(guān)［1］。1964年 Epsteinn等［2］在非洲伯基特淋巴瘤患者細胞系中發(fā)現(xiàn)了病毒顆粒,這種病毒被命名為愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus, EBV),是第一種被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤相關(guān)病毒。迄今為止,人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)、愛潑斯坦-巴爾病毒、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus,KSHV)、默克爾細胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus,MCV)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類T細胞嗜淋巴細胞病毒1型(human T lymphotropic virus, HTLV-1)7種病毒已被國際癌癥研究機構(gòu)歸類為1類致癌物質(zhì)［3］。研究表明,HPV、EBV、KSHV、MCV、HTLV-1主要通過直接致癌作用導致皮膚腫瘤,本文將從流行病學、分子機制的角度闡述致癌病毒與皮膚腫瘤之間的因果關(guān)系,從病毒感染的角度探討皮膚腫瘤新的診斷及治療思路。

1 病毒導致皮膚腫瘤的作用機制

病毒介導的腫瘤發(fā)生是多種事件共同作用的結(jié)果,病毒導致腫瘤可分為直接和間接致癌模式［4］。直接致癌病毒以單克隆形式存在于腫瘤細胞內(nèi),病毒基因會整合到宿主基因組中,或成為宿主細胞內(nèi)的游離基因,表達特定病毒致癌相關(guān)基因來誘導和維持腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。病毒癌基因可以引起細胞代謝變化、細胞周期失調(diào)、滅活腫瘤抑制基因、抑制細胞凋亡、誘導血管生成,從而導致腫瘤細胞無限增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。對于大部分直接致癌病毒,僅感染病毒不足以發(fā)展成腫瘤,腫瘤的發(fā)生需要其他輔助因子,如慢性炎癥、環(huán)境誘導和免疫抑制的參與［1］。HPV、EBV、KSHV、MCV、HTLV-1在皮膚腫瘤中均發(fā)揮直接致癌作用:HPV、EBV、KSHV的DNA通常不整合到宿主基因組中,而是成為宿主細胞內(nèi)的游離基因;MCV的DNA克隆整合入宿主基因組中,HTLV-1將RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄為DNA,并克隆整合入宿主基因組中。它們均通過表達病毒癌蛋白發(fā)揮直接致癌作用。間接致癌病毒顧名思義為不在腫瘤細胞內(nèi)直接發(fā)揮作用,它們通過以下兩種主要機制發(fā)揮作用:①引發(fā)慢性炎癥和氧化應激持續(xù)損害局部組織;②減少或消除抗腫瘤免疫監(jiān)視［4］。發(fā)揮間接致癌作用的病毒包括HBV、HCV及HIV,其中HIV感染通過引發(fā)嚴重免疫抑制間接促進皮膚腫瘤的發(fā)展,除最常見的卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma,KS)外,HIV感染者患其他皮膚腫瘤如皮膚淋巴瘤、皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)、默克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma,MCC)的概率也會增加。

2 病毒與皮膚腫瘤

2.1HPV與cSCC HPV屬于乳頭瘤病毒科,迄今已發(fā)現(xiàn)了200多種類型,并分為5個屬:α、β、γ、μ和ν,分別表現(xiàn)出皮膚嗜性和黏膜嗜性。絕大多數(shù)α-HPV表現(xiàn)出黏膜嗜性,與宮頸癌相關(guān);而β-HPV為皮膚嗜性,與cSCC相關(guān);γ、μ和ν屬表現(xiàn)出皮膚嗜性并引起疣［6］。

β-HPV與cSCC之間的關(guān)聯(lián)首次是在疣狀表皮發(fā)育不良(epidermodysplasia verruciformis, EV)的患者中發(fā)現(xiàn)的,30%～60%的EV患者在良性皮膚病變發(fā)作后10～30年出現(xiàn)cSCC,癌癥通常位于皮膚的陽光暴露部位,且90%的cSCC病變中可檢測到HPV 5、8［7］。流行病學證據(jù)表明［8］,β-HPV是導致cSCC的潛在病原體:cSCC患者中β-HPV DNA陽性率、病毒載量均高于正常對照組,且患者腫瘤皮膚組織比正常皮膚HPV陽性率高。一項前瞻性研究發(fā)現(xiàn)［9］,β-HPV DNA陽性的受試者cSCC發(fā)病率高于DNA陰性的受試者(風險比HR=4.32,95%CI:1.00～18.66)。薈萃分析表明［10］,HPV 5、8、17、20、24 和 38 與cSCC發(fā)展風險增加之間存在顯著關(guān)聯(lián)。

從分子機制的角度,β-HPV編碼的病毒癌蛋白E6、E7蛋白,通過改變細胞周期,抑制細胞凋亡促進cSCC的發(fā)生。Notch信號通路可以驅(qū)動角質(zhì)形成細胞分化,其功能失調(diào)會導致角質(zhì)形成細胞的惡性轉(zhuǎn)化,E6蛋白可以與MAML1結(jié)合,從而抑制Notch信號通路功能,誘導cSCC的發(fā)生［7］。此外,E6 蛋白可以結(jié)合SMAD3并抑制TGF-β信號傳導,從而導致細胞的無序增殖［11］。腫瘤抑制因子pRb1通過負調(diào)控E2F家族成員(E2F1-3)的活性,使細胞處在G0/G1期穩(wěn)定狀態(tài)。E7蛋白可以使pRb1通過蛋白酶體途徑降解,進而釋放和激活E2F、誘導細胞周期蛋白的轉(zhuǎn)錄,從而使上皮細胞自發(fā)跨越過G1/S檢驗點而發(fā)生無序增殖和永生化［12］。

在宮頸癌中,α-HPV感染持續(xù)存在,并且在所有腫瘤細胞中都可以檢測到病毒基因組。相比之下,β-HPV僅參與致癌作用的發(fā)生,但不參與腫瘤維持。盡管cSCC患者皮膚HPV DNA含量增加,但腫瘤組織中HPV mRNA定量與正常皮膚組織中無明顯差異,說明HPV在腫瘤組織中不活躍表達,不參與維持致癌過程［13］。日光性角化病是cSCC的癌前病變,Weissenborn 等［14］發(fā)現(xiàn),日光性角化病患者的病毒載量顯著高于cSCC,癌變過程中 β-HPV的丟失可能并不是偶然的,而是腫瘤進展所必需的。被β-HPV抑制的TGF-β 和 Notch 信號通路在上皮癌發(fā)生的早期階段具有腫瘤抑制作用,但在惡性進展的后期階段具有致癌性。因此,β-HPV僅在致癌過程的起始階段起作用,即β-HPV具有“肇事逃逸”機制。β-HPV丟失可能重新激活TGF-β和Notch信號傳導,從而促進癌癥的進展［15］。

在健康的皮膚上,β-HPV的陽性率很高,因此可以推測β-HPV感染需要輔助因子來誘導致癌過程。在EV患者中觀察到的cSCC大多發(fā)生在陽光照射的區(qū)域,這表明β-HPV感染和紫外線的致癌作用之間存在協(xié)同作用［13］。BAK屬于促凋亡BCL2 家族成員,在紫外線照射時從線粒體中釋放,促進受紫外線損傷的細胞凋亡;β-HPV E6蛋白能夠通過蛋白酶體途徑促進BAK的降解,從而抑制受紫外線損傷的細胞發(fā)生凋亡,導致DNA致癌突變的積累,進而導致腫瘤發(fā)生［16］。器官移植受者在免疫抑制后發(fā)生cSCC的風險增加65～250倍,且β-HPV感染的負荷增加會使器官移植受者中的cSCC發(fā)病率提升,推測免疫抑制與β-HPV可能協(xié)同誘導cSCC的發(fā)生［17］。

當前流行病學數(shù)據(jù)和癌蛋白的致癌機制支持皮膚HPV參與cSCC的發(fā)病,并且紫外線照射、免疫抑制與HPV有協(xié)同作用,但相關(guān)機制仍待進一步研究。當前針對α-HPV的二價、四價、九價疫苗已廣泛應用于宮頸癌的預防,而針對β-HPV的疫苗正在開發(fā)中,Schellenbacher等［18］生產(chǎn)的RG1-VLP嵌合蛋白疫苗對β-HPV產(chǎn)生了強烈的免疫應答,目前正處于動態(tài)藥品生產(chǎn)管理(current good manufacture practices ,cGMP)生產(chǎn)階段,有望保護免疫抑制的易感人群,降低cSCC的患病率。

2.2EBV與皮膚淋巴瘤 EBV是一種普遍存在的嗜淋巴雙鏈DNAγ皰疹病毒,可感染全世界超過90%的人。EBV與一系列淋巴組織增生性疾病有關(guān)。EBV感染的主要目標是B淋巴細胞,病毒通過病毒包膜蛋白gp350/220與B細胞表面CD21相互作用進入B細胞。除最熟知的B細胞淋巴瘤外,EBV在NK/T細胞淋巴瘤中也呈陽性。其中皮膚B細胞淋巴瘤包括EBV陽性皮膚黏膜潰瘍、淋巴瘤樣肉芽腫病、漿母細胞淋巴瘤等;皮膚NK/T細胞淋巴瘤包括慢性活動性EB病毒感染-種痘樣水皰病樣淋巴組織增生性疾病、慢性活動性EB病毒感染-嚴重蚊蟲叮咬過敏、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤和外周T細胞淋巴瘤,非特指型等［19］。

EBV感染表現(xiàn)出潛伏感染和裂解感染兩種模式。在潛伏感染期間,EBV基因組表達五種EBV編碼的核抗原(Epstein-Barr nuclear antigen ,EBNA)和兩種潛伏膜蛋白(latent membrane protein,LMP),它們通過誘導活性氧ROS、抑制DNA修復、使細胞周期檢查點失活來促進基因組不穩(wěn)定性;通過下調(diào)抑癌基因的表達,激活NF-κB、MYC、BCL-2、Notch1等信號通路,促進B細胞增殖,從而誘導B細胞永生化和淋巴母細胞系的建立［20］。

目前研究集中于EBV感染B細胞的機制,而NK/T細胞的感染過程還不太確定。一種可能是NK/T細胞通過分子突觸獲得EBV陽性B細胞的CD21分子,從而使EBV通過細胞間感染,從B細胞感染到NK/T細胞［21］。EBV在NK/T細胞淋巴瘤中的致瘤機制可能與NF-κB通路相關(guān)。在EBV陽性B細胞淋巴瘤中,EBV通過病毒蛋白LMP1直接激活NF-κB,促進淋巴瘤的發(fā)生。Takada等［22］研究發(fā)現(xiàn),在NK/T細胞淋巴瘤細胞系中,EBV感染同樣通過LMP1誘導NF-κB活化,抑制受感染的細胞凋亡,使細胞永生。此外,在慢性活動性EB病毒感染患者中發(fā)現(xiàn)胞苷脫氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)高表達［23］。先前已經(jīng)證實EBV感染在B細胞中誘導AID表達,從而誘導體細胞超突變和免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換重組,導致B細胞淋巴瘤的發(fā)展,因此,可以推測EBV誘導NK/T細胞中的AID表達,導致基因突變,該推測仍需進一步研究證實［24］。強有力的證據(jù)表明EBV感染與B細胞淋巴瘤相關(guān),但誘導NK/T細胞淋巴瘤的機制仍需進一步研究。

外周血中EBV-DNA載量有助于淋巴瘤診斷、監(jiān)測和預后評估。EBV-DNA載量已被用于診斷移植后淋巴組織增生性疾病,并且美國和歐洲指南建議對同種異體造血干細胞移植后的高危人群進行EBV-DNA定量檢測,從而前瞻性篩查移植后淋巴組織增生性疾?。?5］。在NK細胞淋巴瘤、移植后淋巴組織增生性疾病及非霍奇金淋巴瘤中,EBV-DNA載量與治療反應平行,在達到完全緩解的病例中檢測不到EBV-DNA,而在難治性或復發(fā)性病例中,EBV-DNA載量仍很高,且EBV-DNA載量與疾病分期及LDH水平呈正相關(guān)［26］。EBV-DNA在皮膚淋巴瘤中的診療作用仍待進一步探究。

2.3KSHV與KS KSHV屬于以淋巴細胞嗜性為特征的γ皰疹病毒亞科,KSHV的DNA序列總是存在于KS病變中,但不存在于未受影響的皮膚或大多數(shù)其他惡性腫瘤中,并且,KSHV感染通常先于KS的發(fā)生,因此KSHV是KS的致病因素［27］。除KSHV外,HIV感染是KS發(fā)展重要的輔助因素,KS發(fā)病率在一般人群中為1/100 000,但在HIV感染者中約為1/20［28］。

KS腫瘤特征細胞是內(nèi)皮來源的非典型分化梭形細胞。KSHV有兩種復制模式,即潛伏和裂解復制。潛伏期KSHV存在于絕大多數(shù)KS腫瘤細胞(即梭形細胞)中,表達潛伏病毒蛋白,包括潛伏期相關(guān)核抗原(latency-associated nuclear antigen ,LANA)、vCyclin、vFLIP、miRNAs以及kaposins。這些轉(zhuǎn)錄物賦予腫瘤生長和增殖信號、逃避細胞凋亡、促血管生成和炎癥信號,以及無限的復制潛力［28］。使用潛伏病毒蛋白基因為探針進行原位雜交,可以顯示大多數(shù)KS梭形細胞被潛伏感染,只有一小部分梭形細胞亞群(1%～3%)顯示裂解感染［29］。盡管KSHV潛伏病毒蛋白總是在所有KS梭形細胞中表達,但與其他致癌皰疹病毒如EBV相比,KSHV潛伏期感染的細胞沒有很強的永生性,因此,潛伏感染并不足以驅(qū)動KS發(fā)?。?0］。傳統(tǒng)上認為裂解感染不會直接促進腫瘤發(fā)生,因為裂解感染的細胞通常會裂解并死亡［30］。然而,臨床研究表明,裂解復制在KS發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。更昔洛韋可以阻斷KSHV裂解感染,而非潛伏感染。在晚期艾滋病患者中,使用更昔洛韋治療會導致KS腫瘤的發(fā)病率迅速顯著下降［31］,說明裂解感染在KS發(fā)病過程中也起到重要作用。有研究顯示［28］,KS病變中的裂解感染細胞產(chǎn)生的細胞因子可以以旁分泌的形式,幫助驅(qū)動潛伏感染的細胞增殖。vGPCR、K1和K15等裂解病毒蛋白可以誘導旁分泌作用因子VEGF、ANGPT2、PDGF、GROa 和IL-6,來驅(qū)動潛伏感染細胞增殖、支持潛伏感染細胞的存活和免疫逃逸,還可以募集未感染細胞,誘導血管生成和炎癥反應。

盡管目前艾滋病的發(fā)病率已降低,然而KS在相關(guān)疾病流行地區(qū)發(fā)病率仍然很高,目前KS的治療方法主要包括放、化療和高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy, HAART),只有約50%的患者達到完全緩解。目前對KSHV誘導腫瘤發(fā)生的機制研究成果已應用于臨床,潛伏病毒蛋白LANA已成為KS的決定性診斷標志物;靶向潛伏病毒蛋白及裂解病毒蛋白VEGF的藥物目前正處于臨床實驗階段,然而單點阻斷VEGF通路治療效果有限,將VEGF抑制劑與其他靶向藥物聯(lián)合可能有助于抗腫瘤治療［32］。

2.4MCV和MCC MCV屬于多瘤病毒科,是一種雙鏈DNA病毒,它可以在大部分健康人皮膚上檢測到,通常為無癥狀感染。MCC是一種罕見的侵襲性皮膚神經(jīng)內(nèi)分泌癌,其發(fā)病率為每年每10萬人0.1～1.6例,具有高度侵襲性,致死率超過30%［33］。MCC可以分為 MCV+和MCV-病例,MCV-MCC細胞比MCV+MCC細胞表現(xiàn)出更多紫外線損傷相關(guān)基因突變。2008年Feng等［34］首次發(fā)現(xiàn),80%的MCC患者可以在腫瘤皮膚組織中檢測到MCV序列,而腫瘤患者的正常皮膚組織僅8%,非腫瘤患者僅16%。其中75%的MCV DNA整合到腫瘤細胞的單個位點,表明MCV感染和整合先于腫瘤細胞的克隆擴增,證明了其在MCC中有致病作用。

為證明維持MCC細胞需要致癌病毒蛋白,Houben等［35］在MCV+MCC細胞系中敲低了MCV T抗原的表達,所有MCV+MCC細胞系在T抗原敲低后都經(jīng)歷了生長停滯或細胞死亡,而MCV-細胞系的增殖不受影響,這證明了腫瘤的維持需要T抗原的表達,即大T抗原(large T ,LT)和小T抗原(small T ,ST)。LT和ST會被克隆整合到MCC基因組中,其中LT會發(fā)生截短突變,保留LXCXE基序而敲除解旋酶結(jié)構(gòu)域,使整合進腫瘤基因組中的病毒喪失復制能力,從而使腫瘤細胞得以存活［36］。MCV LT的LXCXE 基序還可以結(jié)合并使RB1失活,進而釋放和激活E2F,從而使細胞跨越過G1/S檢驗點而發(fā)生無序增殖和永生化［37］。

MCV+MCC 腫瘤也表達ST,且通常完整表達。MCV ST與MYC同源基因MYCL 形成復合物,并招募EP400染色質(zhì),形成ST-MYCL-EP400復合物［38］。MDM2是一種E3泛素連接酶,它特異性結(jié)合p53并促進其泛素化和隨后被蛋白酶體降解。ST-MYCL-EP400 復合物增加了 MDM2的水平,從而降低p53的活性,從而抑制細胞凋亡,促進腫瘤增殖。除了MDM2,ST-MYCL-EP400 復合物增加了MDM4和CK1α的水平,它們協(xié)同激活MDM2的E3泛素連接酶活性,從而促進 p53 的降解及其功能喪失,導致細胞癌變。

目前關(guān)于MCV導致MCC尚有很多問題待進一步研究,包括確定病毒致癌的易感因素和確切機制。在臨床方面,ST-MYCL-EP400復合物的下游靶標可以應用于靶向治療的開發(fā);此外,MCV T抗原抗體只存在于不到1%的健康個體中,而存在于52%MCC患者中,抗體滴度隨時間下降的患者有97%的概率不復發(fā);抗體滴度升高的患者有66%的復發(fā)概率［39］,因此T抗原抗體滴度可以用于跟蹤疾病狀態(tài),判斷疾病復發(fā)風險。

2.5HTLV-1與成人T細胞白血病/淋巴瘤 HTLV-1是逆轉(zhuǎn)錄病毒科Delta逆轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員,在人體內(nèi)主要感染CD4+T細胞,全世界約有10～20萬HTLV-1感染者,小于5%的感染者會發(fā)展為成人T細胞白血病/淋巴瘤(adult T cell leukemia/lymphoma, ATLL)［40］。上世紀80年代,來自美國和日本的研究人員均從ATLL細胞系中分離出來相同序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒,即HTLV-1,他們發(fā)現(xiàn)HTLV-1逆轉(zhuǎn)錄形成的前病毒DNA會克隆整合入ATLL細胞的相同位點中,故證實了HTLV-1感染為ATLL的病因［41］。

Tax蛋白和HBZ蛋白(HTLV-1 basic zipper protein)為HTLV-1的兩個關(guān)鍵病毒癌蛋白。Tax蛋白可以激活HTLV-1 5′長末端重復序列以促進病毒轉(zhuǎn)錄;可以激活NF-κB、AP1等信號通路從而促進T細胞生長,抑制細胞凋亡;還可以通過促進cyclin-D1表達和p53的功能影響細胞周期和細胞歸巢修復機制,使受感染的T細胞存活［42］。然而同時Tax的免疫原性很強,可以觸發(fā)體內(nèi)細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反應,進而介導受感染T細胞的免疫清除。最新研究表明,Tax表現(xiàn)為間歇性表達模式,可自發(fā)在表達和不表達之間切換,以便于在逃避免疫監(jiān)視的同時促進受感染細胞持續(xù)存活［43］。HBZ是唯一在HTLV-1感染過程中持續(xù)表達的基因,它的表達可將受HTLV-1感染的細胞與未感染的CD4+T細胞區(qū)分開來。HBZ的關(guān)鍵作用是促進被感染細胞的存活,HBZ通過激活轉(zhuǎn)錄因子Jun D以及TGF-β信號通路,促進T細胞增殖［44］。HBZ的免疫原性遠低于Tax,有助于HTLV-1在體內(nèi)的免疫逃避［45］。Tax和HBZ在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同時期發(fā)揮作用,在HTLV-1感染初期,Tax可促進病毒轉(zhuǎn)錄及細胞轉(zhuǎn)化,而在HTLV-1感染中后期,HBZ則維持腫瘤細胞增殖,二者協(xié)同促進ATLL的發(fā)生［42］。

ATLL目前主要治療方法包括多藥化療、干擾素α聯(lián)合齊多夫定、抗CCR4抗體莫加木珠單抗、來那度胺、異基因造血干細胞移植等,但ATLL預后不良,復發(fā)頻繁,且針對惰性ATLL尚無有效療法。來自日本的研究者已開發(fā)Tax多肽脈沖樹突狀細胞疫苗(Tax-DC),由自體樹突狀細胞及Tax多肽組成,可以激活Tax特異性CTL反應,可用于抗腫瘤治療及預防。由于化療會引起免疫抑制,故化療不適用于惰性ATLL,而Tax-DC疫苗可嘗試用于惰性ATLL的治療。Tax-DC疫苗聯(lián)合莫加木珠單抗和來那度胺可進一步增強Tax特異性CTL反應,可用于初始治療后的維持緩解。此外,Tax-DC疫苗還可以應用于HTLV-1攜帶者,預防此類高危人群患ATLL［46］。

3 小結(jié)

病毒被認為是導致皮膚腫瘤的原因之一。在流行病學及分子機制方面均有證據(jù)表明,HPV和cSCC、EBV和皮膚淋巴瘤、KSHV和KS、MCV和MCC、HTLV-1和ATLL之間存在關(guān)聯(lián)。然而,皮膚腫瘤是多種因素共同作用的最終結(jié)果,并且致瘤病毒通常存在于大部分人群中而不會引起疾病,因此,仍然沒有足夠的數(shù)據(jù)證明病毒與皮膚腫瘤的發(fā)展確切相關(guān)。病毒與皮膚腫瘤間的關(guān)系應該引起更廣泛的重視,仍需進一步研究證實病毒與皮膚腫瘤之間的因果關(guān)聯(lián),探尋病毒導致皮膚腫瘤的可能分子機制,將有助于開發(fā)新的用于篩查、診斷、疾病監(jiān)測的潛在標記物,以及預防、治療病毒感染相關(guān)皮膚腫瘤的疫苗和藥物。