佟芳荻，潘曉敏，邱國林，林佳順

（深圳市中鼎檢測技術(shù)有限公司，廣東深圳 518000）

在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中，激素的使用可起到改善產(chǎn)品性狀的作用，促進(jìn)動(dòng)物生長的同時(shí)提高生產(chǎn)效率[1]。而使用抗生素藥物可有效降低養(yǎng)殖成本，使動(dòng)物源性食品供應(yīng)大幅增長。但激素類藥物會(huì)影響人體正常代謝功能，導(dǎo)致早熟、發(fā)育異常等疾病[2]；硝基咪唑類藥物對(duì)人有致癌、致畸、致突變作用[3]；酰胺醇類藥物可抑制骨髓造血功能，引起粒細(xì)胞及血小板生成減少，導(dǎo)致不可逆的再生障礙性貧血。以上3類藥物在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41種獸藥最大殘留限量》（GB 31650.1—2022）[4]以及中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號(hào)公告[5]中禁止使用或限制使用。針對(duì)這3類藥物，我國出臺(tái)了一系列檢測標(biāo)準(zhǔn)，檢測方法有氣相色譜法[6]、酶聯(lián)免疫法[7-8]、高效液相色譜法[9]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]。動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，其中激素類藥物、硝基咪唑類藥物和酰胺醇類藥物含量極低，酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法選擇性和特異性較差，對(duì)于多殘留檢測有較大局限性；氣相色譜法需要對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行衍生，增加了檢測成本；而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法選擇性和特異性好，同時(shí)靈敏度高，適合多殘留檢測。本研究建立了動(dòng)物源性食品中激素類、硝基咪唑類和酰胺醇類藥物多殘留的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，采用基質(zhì)外標(biāo)法定量，以提高檢測效率的同時(shí)提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶、魚肉、豬腎、雞肉、豬肝、雞蛋空白基質(zhì)樣品；地塞米松、氫化可的松、可的松、孕酮、美雄酮、睪酮、洛硝噠唑、甲硝唑、地美硝唑、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于95%，均來自德國Dr公司；乙酸乙酯（分析純）；甲醇（HPLC）；乙腈（HPLC）；甲酸（HPLC）；一級(jí)水（GB/T 6682—2008）；HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL）；0.22 μm親水性濾膜。

1.2 儀器和設(shè)備

XEVO-TQD液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，Water公司；電子天平（十萬分之一）；電子天平（千分之一）；勻漿機(jī)；渦旋混合器；冷凍離心機(jī)；氮吹儀；全自動(dòng)固相萃取儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取12種藥物的標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶內(nèi)，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液。

精密量取12種藥物的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液100 μL，置于10 mL容量瓶內(nèi)，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。

1.3.2 樣品預(yù)處理

稱取5.00 g（精確至0.001 g）試樣，置于50 mL離心管中，加入15 mL乙酸乙酯，均質(zhì)1 min，超聲提取10 min，7 000 r·min-1離心3 min，取上清液，殘?jiān)^續(xù)加入15 mL乙酸乙酯，渦旋提取10 min，7 000 r·min-1離心3 min，合并上清液。40 ℃氮吹至近干，加入3 mL 20%甲醇水溶液復(fù)溶，待凈化。HLB小柱依次用3 mL甲醇和3 mL一級(jí)水活化，復(fù)溶液以1 mL·min-1的流速通過固相萃取小柱，再用3 mL 20%甲醇水溶液淋洗，真空抽干，用10 mL甲醇洗脫。洗脫液在40 ℃氮吹至近干，用50%甲醇水溶液定容至1 mL，過0.22 μm親水性濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測試。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；流動(dòng)相A：5 mmol·L-1乙酸銨水溶液；流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫程序：0～0.2 min，90%A；0.2～2.5 min，90%A→2%A；2.5～3.5 min，2%A；3.5～3.6 min，2%A→90%A；3.6～7.0 min，90%A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：ESI源；掃描方式：正/負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：正離子0.5 kV，負(fù)離子2.5 kV；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣流速：1 000 L·h-1；離子源溫度：150 ℃；各藥物的多反應(yīng)監(jiān)測（Multi Reaction Monitor，MRM）參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取一定量的地塞米松、氫化可的松、可的松、孕酮、美雄酮、睪酮、洛硝噠唑、甲硝唑、地美硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，加入空白基質(zhì)樣品經(jīng)預(yù)處理，得到標(biāo)準(zhǔn)系列混合工作液，地塞米松、氫化可的松、可的松、孕酮、美雄酮、睪酮、洛硝噠唑、甲硝唑和地美硝唑的濃度為2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的濃度為0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)系列混合工作液經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測試，根據(jù)測得的峰面積（Y）與相應(yīng)的濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，12種藥物的相關(guān)系數(shù)在0.995～0.999，曲線方程見表2。

2.2 方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

采用空白樣品添加目標(biāo)化合物的方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到定量離子峰信噪比＞10的最低濃度為方法定量限。地塞米松、氫化可的松、可的松、孕酮、美雄酮、睪酮、洛硝噠唑、甲硝唑、地美硝唑的定量限為1.0 μg·kg-1；氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的定量限為0.1 μg·kg-1。空白基質(zhì)添加定量限濃度目標(biāo)藥物的質(zhì)譜圖見圖1、圖2。

圖2 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的質(zhì)譜圖

在雞蛋、豬肉、豬肝、豬腎、魚肉和牛奶6種空白基質(zhì)中添加1.00 μg·kg-1、2.00 μg·kg-1、10.00 μg·kg-1的地塞米松、氫化可的松、可的松、孕酮、美雄酮、睪酮、洛硝噠唑、甲硝唑和地美硝唑，添加0.10 μg·kg-1、0.20 μg·kg-1、1.00 μg·kg-1的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度進(jìn)行7次平行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。在不同加標(biāo)水平下，回收率在70%～120%，精密度＜10%，回收率和精密度滿足相關(guān)要求。

表3 加標(biāo)回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

（1）前處理?xiàng)l件的優(yōu)化。本研究比較了乙酸乙酯、乙腈和甲醇3種試劑的提取效果，甲醇提取效率最低；用乙腈提取樣品時(shí)，樣品表面的蛋白迅速凝固，導(dǎo)致提取不足；乙酸乙酯提取效率最高。采用HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，可以除去樣品中的大分子蛋白雜質(zhì)以及脂類，可有效減少基質(zhì)效應(yīng)。

（2）儀器條件的優(yōu)化。本研究采用濃度為1 μg·mL-1的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃，優(yōu)化錐孔電壓，確認(rèn)母離子，再對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描，確定碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)，選擇離子豐度較高的一對(duì)子離子，作為定量離子和定性離子。對(duì)流動(dòng)相溶液進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)比了5 mmol·L-1乙酸銨水溶液與乙腈體系和一級(jí)水與乙腈體系的目標(biāo)物響應(yīng)值和峰形，在流動(dòng)相體系中添加少量的電解質(zhì)，可提高ESI離子化效率以及減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。最后選用5 mmol·L-1乙酸銨水溶液與乙腈體系對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離。

4 結(jié)論

本研究建立了動(dòng)物源性食品中激素類藥物、硝基咪唑類藥物和酰胺醇類藥物多殘留的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。采用HLB固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，優(yōu)化流動(dòng)相體系增強(qiáng)目標(biāo)藥物的響應(yīng)，減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，最后使用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量，抵消剩余基質(zhì)效應(yīng)的影響，使檢測方法的準(zhǔn)確度、靈敏度均能滿足要求。