□ 王兆芹 北京勤邦科技股份有限公司

硫丹是一種人工合成的有機(jī)氯化合物，廣泛用作農(nóng)藥殺蟲劑。由于該藥物具有殺蟲范圍廣、價(jià)格低廉、對(duì)蜜蜂低毒等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于防治棉花、果樹、大豆、蔬菜、茶及煙草等各種農(nóng)作物中的害蟲。我國(guó)于20世紀(jì)90年代開始生產(chǎn)硫丹，到2011年，登記使用的硫丹產(chǎn)品有47種，涉及藥企43家，稱為該藥物的第二大生產(chǎn)國(guó)。該藥物有效期長(zhǎng)，但具有生物富集作用，對(duì)魚類、貝類等有較大危害性，對(duì)哺乳動(dòng)物具有累積毒性，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道在蔬菜、水果等農(nóng)作物中檢測(cè)到硫丹殘留。

目前，全球有70多個(gè)國(guó)家禁止生產(chǎn)和使用硫丹。根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)部等五部委聯(lián)合發(fā)布的1586號(hào)公告，撤銷硫丹在蘋果樹和茶樹中的登記。這就意味著硫丹不得繼續(xù)在已撤銷的作物中使用，并將逐步淘汰硫丹的生產(chǎn)和使用。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于硫丹的研究方法多采用固相萃取與氣相色譜法檢測(cè)。與這兩種方法相比，免疫化學(xué)檢測(cè)法對(duì)藥物檢測(cè)具有快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確、可批量檢測(cè)、樣品處理簡(jiǎn)單、能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)。而免疫化學(xué)法檢測(cè)硫丹的前提是需要具備針對(duì)硫丹的抗體，本文研究了硫丹人工抗原制備方法，并將其應(yīng)用于酶聯(lián)免疫試劑盒中，能夠檢測(cè)蔬菜、水果中的硫丹殘留量，且具有用時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，適用于基層單位大批量檢測(cè)樣品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圖1 硫丹半抗原合成

硫丹標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）：北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）（分析純）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）（分析純）：美國(guó)Sigma公司；蔬菜、水果：超市。

MK3酶標(biāo)儀（最大量程為4.0）：購(gòu)自上海雷勃分析儀器有限公司；MX-F渦旋儀：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；HFJ-10均質(zhì)器：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；JA2003電子天平：上海力辰儀器科技有限公司。

1.2 制備抗原

1.2.1 制備半抗原

取硫丹醇3.6 g，加1,4-二氧六環(huán)100 mL溶解，充分?jǐn)嚢?，后加入分子篩3.0 g，加琥珀半醛1.02 g，充分?jǐn)嚢瑁ㄈ臌}酸氣，避光室溫?cái)嚢? h；停止反應(yīng)，加入0.5 mol/L NaOH溶液，200 mL充分震蕩，加乙酸乙酯200 mL，充分震蕩，靜置，分去水相，有機(jī)相加水80 mL洗滌，震蕩后靜置，分去水相，有機(jī)相無(wú)水硫酸鈉干燥蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷/甲醇（v/v，10/1）洗脫純化，得到琥珀縮醛硫丹半抗原產(chǎn)物2.1 g，收率45.75%。

1.2.2 制備免疫原

取琥珀縮醛硫丹16 mg，加DMF 1 mL溶解，加NHS 18.7 mg，DDC 33 mg，室溫反應(yīng)3 h，得到半抗原溶液A液；取牛血清白蛋白（BSA）50 mg，加0.05 M PB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4℃反應(yīng)12 h，0.02 M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到硫丹-BSA偶聯(lián)物，即為免疫原，-20℃保存，備用。

1.2.3 制備包被原

取琥珀縮醛硫丹10 mg，加DMSO 1 mL溶解，加NHS 6.7 mg，EDC 16 mg，室溫反應(yīng)3 h，得到半抗原溶液A液；取卵血清白蛋白（OVA）50 mg，加0.05M PB緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4 ℃反應(yīng)12 h，0.02 M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到硫丹-OVA偶聯(lián)物，即為包被原，-20 ℃保存，備用。

1.3 制備酶標(biāo)記抗抗體

將“1.2”得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生抗血清，脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合、克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株，純化后得到硫丹單克隆抗體，進(jìn)而免疫無(wú)病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體，將其與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)，最終得到酶標(biāo)記抗抗體。

1.4 檢測(cè)性能

1.4.1 計(jì)算檢測(cè)限

分別檢測(cè)20份黃瓜、蘋果空白樣本，利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算檢測(cè)限（LOD），即檢測(cè)方法可檢測(cè)出的最低被測(cè)物濃度。

1.4.2 精密度和準(zhǔn)確度

分別對(duì)黃瓜、蘋果樣本添加硫丹，使黃瓜濃度達(dá)到50 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg，使蘋果濃度達(dá)到100 μg/kg、200 μg/kg和400 μg/kg，測(cè)定添加回收率，以此評(píng)價(jià)該試劑盒的準(zhǔn)確度。同時(shí)，每個(gè)樣本做4個(gè)平行，按照上述“1.4”制備3批酶標(biāo)板，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%），以此評(píng)價(jià)該試劑盒的精密度。

1.4.3 測(cè)定穩(wěn)定性

通過(guò)測(cè)定試劑盒的保存條件，評(píng)價(jià)該試劑盒的穩(wěn)定性。將試劑盒保存于4℃，每個(gè)月測(cè)定一次最大吸光度值（0 μg/L）、IC50以及黃瓜、蘋果樣本的回收率，連續(xù)測(cè)定12個(gè)月。

1.4.4 測(cè)定抗體特異性

滴滴涕、水胺硫磷與硫丹同屬于有機(jī)氯農(nóng)藥，結(jié)構(gòu)類似，測(cè)定上述藥物的IC50，根據(jù)下式計(jì)算該試劑盒對(duì)于滴滴涕、水胺硫磷的交叉反應(yīng)率：

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)算檢測(cè)限

本研究對(duì)黃瓜樣本的檢測(cè)限為41.4 μg/kg，對(duì)蘋果樣本的檢測(cè)限為85.1 μg/kg，見表1和表2。

表1 黃瓜的檢測(cè)限測(cè)定（μg/kg）

表2 蘋果的檢測(cè)限測(cè)定（μg/kg）

2.2 精密度和準(zhǔn)確度

按50 μg/kg、100 μg/kg兩個(gè)濃度的硫丹對(duì)蔬菜樣品進(jìn)行添加回收測(cè)定，按100 μg/kg、200 μg/kg兩個(gè)濃度的硫丹對(duì)水果樣品進(jìn)行添加回收測(cè)定，平均回收率分別為81.2%～92.3%，74.8%～87.9%；批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。

2.3 測(cè)定穩(wěn)定性

將試劑盒保存在4℃，測(cè)定的試劑盒的最大吸光度值（0μg/L）范圍是1.55～1.83，50%抑制濃度范圍是4.5～7.5 μg/L，硫丹添加回收率范圍是71.8%～96.6%，由此可見，各指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)。從測(cè)定結(jié)果可知，該試劑盒在4℃至少能夠保存12個(gè)月。

2.4 測(cè)定抗體特異性

硫丹抗體與滴滴涕、水胺硫磷的交叉反應(yīng)率見表3。由表3可知，硫丹抗體與滴滴涕、水胺硫磷的交叉反應(yīng)率小于1%。

表3 交叉反應(yīng)率試驗(yàn)

3 討論

圖2 勤邦制備的硫丹殘留酶聯(lián)免疫試劑盒

本研究制備了抗硫丹單克隆抗體，并研發(fā)出相應(yīng)的ELISA試劑盒，本試劑盒對(duì)黃瓜的檢測(cè)限為41.4 μg/kg，對(duì)蘋果樣本的檢測(cè)限為85.1 μg/kg；回收率分別為81.2%～92.3%，74.8%～87.9%；批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。硫丹單克隆抗體的特異性較好，與滴滴涕、水胺硫磷的交叉反應(yīng)率小于1%。ELISA試劑盒能夠在4℃下保存12個(gè)月，主要指標(biāo)在正常范圍內(nèi)，可見穩(wěn)定性較好。勤邦制備的硫丹殘留酶聯(lián)免疫試劑盒已投入市場(chǎng)，目前來(lái)看產(chǎn)品性能穩(wěn)定，能夠達(dá)到客戶要求，為基層單位大批量地檢測(cè)樣品中是否殘留農(nóng)藥硫丹提供了便捷的快速檢測(cè)方法。