蘇杭，譚港，高珩邵，劉子湲，趙倩，吳玉，蘇金全，王紹卿*

（ 1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201 ；2.劍川縣老君山青花雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司，云南 大理 671000 ）

滇西地區(qū)山多平地少，規(guī)?；B(yǎng)殖場如何處理大量畜禽糞便成為亟待解決的問題。傳統(tǒng)做法是將大量新鮮糞便直接在平地晾曬之后裝袋販賣，這一做法不但浪費(fèi)土地資源，也成了春夏季節(jié)蒼蠅蚊蟲的重要來源，不僅影響?zhàn)B殖場環(huán)境，且極易造成疾病傳播。將畜禽糞便進(jìn)行生物熱堆肥是解決處理大量畜禽糞便問題的根本途徑。具體做法是在原有微生物的基礎(chǔ)上加入活性強(qiáng)、繁殖速度快的微生物，有利于加快堆肥進(jìn)程，同時(shí)將原本糞便中不易利用的粗蛋白轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，從而被其他生物利用。將畜禽糞便進(jìn)行無害化處理后的可再生利用，不但可最大化利用土地資源，還能夠保氮除臭，減少病原微生物，作為飼料、肥料應(yīng)用均具有很好的經(jīng)濟(jì)效益。青花雞作為滇西地區(qū)大理州劍川縣獨(dú)有品種，僅分布于云南少數(shù)民族聚集地，具有體格適中、肉質(zhì)風(fēng)味好、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性好、外觀獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)選用市售微生物菌劑產(chǎn)品，在青花雞雛雞糞添加3%、4%、5%等3個(gè)梯度的菌液進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，并檢測不同梯度樣品的發(fā)酵效果，以期為滇西特色畜禽品種青花雞糞的可再生利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雞糞收集自劍川縣老君山青花雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司的非用藥期籠養(yǎng)雛雞（0～21日齡），經(jīng)過曬干粉碎處理，共30 kg。雛雞根據(jù)《雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（1986）及參照美國NRC飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制日糧，按常規(guī)方法進(jìn)行免疫接種，自由采食和飲水。

試驗(yàn)菌液選擇市售產(chǎn)品“給它”EM菌液（由佛山市南海禪泰動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），主要成分包括枯草芽孢桿菌、乳酸菌、放線菌、酵母菌、酶等。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒離心柱型（北京天根生化科技有限公司），DNA Marker、Biosharp BL631A 2×Taq PCR MasterMix for PAGE（含染料）、Biosharp BS081-100g瓊脂糖Agarose、TSINGKE TSMD011 LB Lennox培養(yǎng)基干粉、1×TAE速溶顆粒（北京擎科生物科技有限公司），沙門氏菌、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS培養(yǎng)基）、麥康凱瓊脂（杭州百思生物技術(shù)有限公司）。

主要儀器：SKD-1000全自動凱氏定氮儀（上海沛歐分析儀器有限公司）、PHS-3C pH計(jì)（上海儀電可約儀器股份有限公司）、SHA-B恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司）、JK9830自動凱氏定氮儀（濟(jì)南精密科學(xué)儀器儀表有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、JJ-CJJ-1FD潔凈工作臺（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）、迷你高速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）、LBI-80生化培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）、T100梯度PCR儀（Bio-Rad Laboratories）、ZD-85恒溫振蕩箱（常州智博瑞儀器制造有限公司）、手提式高壓蒸汽滅菌鍋（上海力辰儀器科技有限公司）、1600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1）

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design 單位：kg

設(shè)置1個(gè)對照組（A組）和3個(gè)試驗(yàn)組（經(jīng)處理后的雞糞中分別加入3%、4%、5%菌液，即B組、C組、D組），每組兩個(gè)重復(fù)，共8份樣品，每份樣品為3 kg雞糞。將處理好的雞糞與菌種攪拌、混勻，加水至用手握雞糞成團(tuán)，松手即散為止（預(yù)試驗(yàn)測得水分含量為40%）。各組分別裝入塑料容器，裝滿壓實(shí)，排去空氣后覆蓋塑料薄膜，蓋上蓋子密封。試驗(yàn)期90 d[1]。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 感官鑒定

發(fā)酵后檢測雞糞飼料的顏色、氣味和質(zhì)地，評定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[2-3]。

1.4.2 理化鑒定

采用水分測定法（GB/T 6435—2014）測定發(fā)酵后樣品水分含量，凱氏定氮法（GB/T 6432—2018）測定粗蛋白含量。采用精密pH計(jì)測定pH值，溫度計(jì)測定樣品溫度。

1.4.3 病原微生物

1.4.3.1 細(xì)菌鑒定

（1）細(xì)菌培養(yǎng)與菌落形態(tài)觀察。

發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)取1 g糞便和9 g生理鹽水混勻，制成濃度為10-1的菌液，從中取出1 g稀釋10倍，制成濃度為10-2的菌液，以此類推，最終制成濃度分別為10-1、10-2、10-3、10-4的樣品菌液。取200 μL懸液均勻涂布到已凝固的麥康凱、SS培養(yǎng)基上，將接種好的培養(yǎng)基置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。觀察菌落形態(tài)，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》篩選麥康凱、SS培養(yǎng)基中生長菌落形態(tài)是否與大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌特征相符。

（2）分子生物學(xué)鑒定。

選取上一步驟中篩選出的6份可疑菌落接種于1.5 mL LB液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)7 h。參照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒離心柱型說明書提取DNA，選用通用引物16S rDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列見表2。

表2 通用引物序列Tab.2 Universal primer sequence

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：模板1 μL、引物上下游各0.5 μL、水10.5 μL、Mix 12.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34次循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃降溫。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物送至生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI BLAST上進(jìn)行同源性分析。

（3）菌落計(jì)數(shù)。

根據(jù)前兩個(gè)步驟的結(jié)果，以麥康凱、SS培養(yǎng)基上生長的紅色菌落作為大腸桿菌（Escherichia coli）計(jì)數(shù)，檢測大腸桿菌菌落數(shù)量[4]；麥康凱培養(yǎng)基上生長的無色菌落、SS培養(yǎng)基上生長的無色或中心為黑色的菌落作為沙門氏菌（Salmonella）計(jì)數(shù)，檢測沙門氏菌菌落數(shù)量[5]；SS培養(yǎng)基上生長的無色半透明小菌落作為志賀氏菌（Shigella）計(jì)數(shù)，檢測志賀氏菌菌落數(shù)量[6]。

1.4.3.2 寄生蟲鑒定

參照飽和食鹽水漂浮法鑒定糞便樣品中是否存在雞蛔蟲蟲卵與雞球蟲蟲卵。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS 23軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD法、鄧尼特T3法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官測定結(jié)果（見表3）

表3 感官測定結(jié)果Tab.3 Sensory test results

由表3可知，D組樣品發(fā)酵程度最高，發(fā)酵完成時(shí)具有較濃酸香味且略帶酒香味、質(zhì)地柔軟蓬松且呈較深棕黑色；B組、C組發(fā)酵完成時(shí)均具有較淡酸香味、質(zhì)地柔軟松散且呈棕黑色；A組仍有糞臭味、干燥結(jié)塊且呈棕灰色，即表明未發(fā)酵。

2.2 理化鑒定結(jié)果（見表4）

表4 理化鑒定結(jié)果Tab.4 Physical and chemical identification results

由表4可知，B組、C組發(fā)酵完成后水分含量顯著高于A組（P＜0.05），D組發(fā)酵完成后水分含量極顯著高于A組（P＜0.01）；D組發(fā)酵完成后溫度極顯著高于A組（P＜0.01）；B組、D組發(fā)酵完成后pH值極顯著高于A組（P＜0.01），C組顯著高于A組（P＜0.05）；各組發(fā)酵完成后粗蛋白含量差異均不顯著（P＞0.05）。理化鑒定結(jié)果顯示，B組、C組、D組樣品均達(dá)到發(fā)酵完成標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 病原微生物檢測

2.3.1 菌種鑒定

選擇6份符合大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌菌落形態(tài)的可疑菌株（見圖1）進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果見圖2。

圖1 可疑菌落形態(tài)Fig.1 Suspicious colony morphology

圖2 可疑菌落電泳結(jié)果Fig.2 Suspicious colony electrophoresis results

由圖2可知，6份可疑菌株經(jīng)PCR電泳均得到1 540 bp的條帶，結(jié)果符合預(yù)期。

將回收產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI BLAST上進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，1號樣品與志賀氏菌同源性達(dá)98.33%，2號樣品與大腸桿菌同源性達(dá)99.29%，3號樣品與大腸桿菌同源性達(dá)99.03%，4號樣品與海氏腸球菌同源性達(dá)94.48%，5號樣品與大腸桿菌同源性達(dá)99.39%，6號樣品與大腸桿菌同源性達(dá)99.04%。根據(jù)PCR電泳結(jié)果，參考符合志賀氏菌菌落形態(tài)和符合大腸桿菌菌落形態(tài)（見圖3），采用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)樣本中符合大腸桿菌、志賀氏菌菌落形態(tài)的菌落數(shù)量，結(jié)果見表5。

圖3 符合描述的大腸桿菌與志賀氏菌菌落形態(tài)Fig.3 Morphology of Escherichia coli and Shigella according to the description

表5 樣品發(fā)酵后菌落數(shù)量Tab.5 Statistical table of colony number 單位：個(gè)/mL

由表5可知，D組樣品中大腸桿菌數(shù)量比A組下降了4個(gè)數(shù)量級，C組、D組樣品均未培養(yǎng)出志賀氏菌。綜上所述，D組的發(fā)酵效果最好。

2.3.2 寄生蟲鑒定結(jié)果（見圖4）

圖4 寄生蟲鑒定結(jié)果Fig.4 Parasitic identification result

由圖4可知，各組樣品鏡檢寄生蟲結(jié)果均為陰性。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，不同梯度的微生物菌劑均能夠促進(jìn)雞糞發(fā)酵過程，D組發(fā)酵效果最好，該梯度樣品發(fā)酵完成后帶有酸香味、酒香味，質(zhì)地松軟均勻，顏色為較深的棕黑色，水分增多，溫度升高，pH值處于5.5～8.5，這與李尚民等[7]的研究結(jié)果相同。本試驗(yàn)中樣品發(fā)酵完成后的溫度低于李尚民等[7]、張玉鳳等[8]試驗(yàn)溫度，原因可能是本研究中的發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)值冬春交替，且位于高海拔山區(qū)，故發(fā)酵完成時(shí)溫度較低，所需時(shí)間也較長。因此，可根據(jù)畜禽糞便堆肥過程中不同溫度下的優(yōu)勢菌種，選擇適用于滇西片區(qū)畜禽糞便發(fā)酵的微生物。如Jiang等[9]分離出的一種適用于中國寒冷地區(qū)畜禽糞便高效性低溫發(fā)酵的嗜冷真菌，不但能夠快速降解纖維素也可用于低溫發(fā)酵，極其適用于高海拔山區(qū)的畜禽糞便發(fā)酵。何凌[10]研究發(fā)現(xiàn)，以1∶1∶1比例混合米曲霉、釀酒酵母、白地霉混合發(fā)酵鴨糞產(chǎn)生菌體蛋白的產(chǎn)量最高，這一研究結(jié)果提示可將發(fā)酵畜禽糞便作為有機(jī)肥料，促進(jìn)畜禽糞便的可再生利用。

本試驗(yàn)中，發(fā)酵完成后，D組樣品中的大腸桿菌數(shù)相比A組下降了63.59%～76.82%，且未檢出志賀氏菌，這與劉小飛[2]、張玉鳳等[8]的結(jié)果相同。原因可能是本試驗(yàn)選擇的青花雞養(yǎng)殖場未流行傷寒、副傷寒等禽沙門氏菌病[11]，但部分雛雞出現(xiàn)輕微腹瀉，存在選取的6份可疑菌落未包含沙門氏菌的可能。本研究中，分離自A組樣品的1號可疑菌株可能為福氏或宋內(nèi)氏志賀氏菌。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，樣本來源的部分7～14日齡雛雞發(fā)生不嚴(yán)重的腹瀉[12]。因此，后續(xù)可進(jìn)一步開展試驗(yàn)，重新對該養(yǎng)殖場采樣并設(shè)計(jì)特異性引物，結(jié)合生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等方法[13]分離鑒定分離自青花雞糞的雞源性志賀氏菌，對滇西片區(qū)云南地方雞種志賀氏菌病防治具有重要意義。

養(yǎng)殖過程中結(jié)合臨床癥狀發(fā)現(xiàn)，有個(gè)別青花雞出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、咳嗽、啰音、腹瀉、產(chǎn)軟殼蛋等禽大腸桿菌病癥狀[14]，但也可能為多種病原體混合感染或營養(yǎng)代謝病等，可采用黃芩散、芩柏龍膽散、抗生素等進(jìn)行防治[15]。近年來，臨床常采用噬菌體治療禽大腸桿菌病及沙門氏菌，Pantoja-Don等[16]、Kittler等[17]研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體可改善腸道菌群，減少疾病發(fā)生并提高機(jī)體免疫力。Maslov等[18]的噬菌體“殺死勝利者假說”也促進(jìn)了噬菌體應(yīng)用于畜禽糞便發(fā)酵過程的相關(guān)研究。本研究中，各組樣品鏡檢均未檢出雞球蟲、雞蛔蟲的蟲卵，原因可能是發(fā)酵前青花雞雛雞糞經(jīng)曬干粉碎處理導(dǎo)致蟲卵死亡，且試驗(yàn)所選為籠養(yǎng)雛雞，糞便中無雞蛔蟲、雞球蟲感染。但結(jié)合臨床癥狀及病理剖檢結(jié)果可知，個(gè)別散養(yǎng)青花雞腸道內(nèi)存在寄生蟲蟲體，應(yīng)進(jìn)一步確定蟲種再進(jìn)行治療。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，使用EM菌劑發(fā)酵雞糞時(shí)，應(yīng)選擇添加量至少為5%的菌液進(jìn)行發(fā)酵,并根據(jù)滇西片區(qū)氣候特點(diǎn)選擇適合畜禽糞便發(fā)酵的優(yōu)勢微生物。后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步測定雞糞發(fā)酵前后真蛋白（菌體蛋白）含量，并對青花雞腸道志賀氏菌群的具體感染情況及分型、沙門氏菌群和其他腸道致病菌群感染情況及耐藥性分析開展進(jìn)一步研究。