李仕林，吐努克·巴合提別克，王德超，巴合提別克·庫(kù)爾班，焦海宏

（ 1.特克斯縣畜牧獸醫(yī)發(fā)展中心，新疆 伊犁 835500 ；2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300 ）

克雷伯氏菌屬（K. lebsiella）目前可分為6種，分別為產(chǎn)酸克雷伯菌（K. oxytoca）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、植生克雷伯菌（K. planticola）、土生克雷伯菌（K. terrigena）和活動(dòng)克雷伯菌（K. mobilis）[1]?？死撞诖笮湍膛?chǎng)患臨床乳房炎病例中的分離率為13.0%，僅次于大腸桿菌（14.4%）[2]。其中產(chǎn)酸克雷伯菌具有較強(qiáng)的內(nèi)毒素釋放能力[3]，為革蘭氏陰性菌，是主要的條件致病菌，存在于人和動(dòng)物的腸道，可導(dǎo)致人畜患病[4]，引起肝膿腫、腹膜炎、腸炎、腹瀉[5]。

隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，由產(chǎn)酸克雷伯菌引起動(dòng)物發(fā)病的概率大大增加，給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過采集腹瀉羔羊糞便，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序、藥敏試驗(yàn)、中藥體外抑菌試驗(yàn)等，旨在為預(yù)防治療由克雷伯菌引起的動(dòng)物疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

樣品為從新疆南疆策勒縣某規(guī)模化羊場(chǎng)無菌采集兩周齡內(nèi)腹瀉羔羊的糞便75份，于實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱保存。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)小鼠均由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院獸醫(yī)系動(dòng)物實(shí)驗(yàn)站提供。

1.1.3 主要試劑

麥康凱瓊脂（MAC）培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）培養(yǎng)基均購(gòu)自杭州生物試劑有限公司，LB肉湯瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，腦心浸液瓊脂（BHI）培養(yǎng)基購(gòu)自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司，5%綿羊血清由塔里木大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)站提供，革蘭氏染色試劑購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

腸道菌科細(xì)菌生化鑒定管購(gòu)自杭州生物試劑有限公司，細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，2×Power Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

麥?zhǔn)媳葷峁苜?gòu)自常德比克曼生物科技有限公司，藥敏紙片購(gòu)自杭州生物試劑有限公司，甘草、艾葉購(gòu)自新疆阿拉爾市郭森中藥房。

1.1.4 主要儀器

BL-75A型立式壓力蒸汽滅菌氣筒（上海東亞壓力容器制造有限公司）、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、CJ-2DF凈化工作臺(tái)（上?？德穬x器設(shè)備有限公司）、XM4008隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、E200生物顯微鏡（上海巴拓儀器有限公司）、ZWY-240臺(tái)式恒溫?fù)u床（上海智城儀器有限公司）、H-1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、DK-80數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州高德儀器制造有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分離培養(yǎng)

無菌采集樣品同時(shí)接種于MAC培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征，將疑似菌株接種于LB固體培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h純化培養(yǎng)；挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h；將菌液進(jìn)一步接種于綿羊血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 革蘭染色鏡檢

挑取MAC培養(yǎng)基單個(gè)疑似菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.2.3 生化試驗(yàn)

將上述細(xì)菌純化物分別接種于生化試驗(yàn)微量發(fā)酵管中37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，按照生化管說明書添加不同試劑，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》判定試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 16S rRNA基因擴(kuò)增

根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書，提取菌體DNA，進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，目的片段大小1 500 bp左右。引物序列為：1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT；27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到的產(chǎn)酸克雷伯菌進(jìn)行排序編號(hào)。

1.2.5 致病性試驗(yàn)

將純化的分離株接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h得到菌液。挑選30只體重15～20 g的小鼠，隨機(jī)分為6組，每組5只。第1～第5組為試驗(yàn)組，第6組為對(duì)照組。各試驗(yàn)組小鼠分別腹腔注射5株分離菌株的菌液0.3 mL/只，對(duì)照組小鼠腹腔注射無菌生理鹽水0.3 mL/只，正常飼喂12 h，觀察結(jié)果。若出現(xiàn)小鼠死亡則進(jìn)行剖解，無菌采取心、肝，取適量心肝滲出液接種于MAC培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落特征并進(jìn)一步染色鏡檢。

1.2.6 藥敏試驗(yàn)

取1.2.5中適量已純化菌液，用生理鹽水稀釋至菌液濃度為1.5×108CFU/mL（0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽?，無菌棉簽蘸取少量稀釋菌液均勻涂布于BHI瓊脂培養(yǎng)基，將20種藥敏片均勻貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果并測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.7 中藥體外抑菌試驗(yàn)

采用水煮法制備藥液，稱取甘草、艾葉各20 g，組成方劑。加入8～10倍純凈水浸泡24 h后，先用大火煎沸，后改用小火煎煮。第1次煎煮30～60 min，過濾藥液；第2次加入5倍純凈水煎煮30 min，過濾藥液；合并兩次濾液，煎煮至藥液終濃度為1 g/mL，3 000 r/min離心取上清，121 ℃高壓滅菌，4 ℃保存。

制備BHI瓊脂培養(yǎng)基，取1.2.5中適量已純化菌液分別均勻涂布于培養(yǎng)基表面，打孔器高溫殺菌，在培養(yǎng)基上打孔，火焰封底。一孔加入40 μL蒸餾水作為對(duì)照，其余3孔添加入相同的藥液40 μL，藥液終濃度為1 g/mL。37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小，并作記錄；抑菌效果評(píng)價(jià)方式參考盧宇[6]的研究：抑菌圈直徑（d）≥20 mm為極敏，20 mm＞d≥15 mm為高敏，15 mm＞d≥10 mm為中敏，10 mm＞d＞6 mm為低敏，d≤6 mm為無抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果（見圖1～圖3）

圖1 分離株在MAC培養(yǎng)基上的特征Fig.1 Characterization of isolates on MAC medium

從新疆某規(guī)?；驁?chǎng)無菌采集樣本75份，共分離出10株疑似產(chǎn)酸克雷伯菌。疑似菌株在MAC培養(yǎng)基上形成粉紅色黏稠菌落（見圖1）；在EMB培養(yǎng)基上形成較大、黏稠、易融合成一片的粉紅色菌落（見圖2）；綿羊血平板上形成較大、凸起、白色黏液狀的菌落，用接種環(huán)蘸取少許菌落可拉成線絲（見圖3），LB液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)日可形成黏稠液體。

圖2 分離株在MBC培養(yǎng)基上的特征Fig.2 Characterization of isolates on MBC medium

圖3 分離株在綿羊血平板培養(yǎng)基上的特征Fig.3 Characterization of isolates on sheep blood plate culture-medium

2.2 分離株革蘭染色鏡檢結(jié)果（見圖4）

圖4 分離株革蘭染色鏡檢結(jié)果Fig.4 Results of gram staining microscopy of isolates

由圖4可知，分離株革蘭染色鏡檢呈陰性粗短的直桿菌，呈單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果（見表1）

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Identification results of biochemical tests

由表1可知，分離株分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；利用枸櫞酸鹽；賴氨酸反應(yīng)陽性；鳥氨酸脫氫酶反應(yīng)陰性；甲基紅陰性；靛基質(zhì)反應(yīng)陽性。理化特性參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]，表明分離菌與產(chǎn)酸克雷伯菌常規(guī)生化反應(yīng)相符。

2.4 16S rRNA基因擴(kuò)增與測(cè)序

10株分離株經(jīng)擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為1 500 bp的條帶，與預(yù)期相符，結(jié)果見圖5。

圖5 分離株16S rRNA電泳結(jié)果Fig.5 Results of 16S rRNA electrophoresis of isolates

將已純化的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST對(duì)照，結(jié)果顯示，分離菌與產(chǎn)酸克雷伯菌SHO-1菌株（登錄號(hào)：GU361112.1）、產(chǎn)酸克雷伯菌SB3051菌株（登錄號(hào)：AJ871863.1）相似度大于98%，表明本研究共鑒定出5株產(chǎn)酸克雷伯菌，編號(hào)為1～5號(hào)菌株。

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

表2 致病性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Pathogenicity test results

由表2可知，第1～第4組小白鼠全部死亡，死亡小鼠無腹瀉現(xiàn)象。第5組小白鼠生長(zhǎng)良好，對(duì)照組（第6組）小白鼠生長(zhǎng)良好。結(jié)果表明，所分離的5株產(chǎn)酸克雷伯菌中1～4號(hào)菌株具有致病性。

死亡小白鼠解剖無菌采集肺、肝接種于MAC培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取菌落染色鏡檢呈短鏈或成對(duì)球形，與上述鏡檢形態(tài)一致。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見表3）

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of drug sensitivity test

由表3可知，產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)米諾環(huán)素、多西環(huán)素、四環(huán)素、慶大霉素、頭孢哌酮、丁胺卡那、頭孢曲松、呋喃唑酮、復(fù)方新諾明、氯霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星高度敏感，對(duì)多黏菌素B中度敏感，對(duì)紅霉素、新霉素、卡那霉素、克林霉素、諾氟沙星、麥迪霉素、萬古霉素低度敏感或耐藥。

2.7 中藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果（見表4）

表4 中藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Antibacterial test results of traditional Chinese medicine in vitro 單位：mm

由表4可知，甘草、艾葉組成的方劑對(duì)5株產(chǎn)酸克雷伯菌均產(chǎn)生了抑菌效果，且對(duì)不同菌株抑菌效果有所不同。

3 討論

產(chǎn)酸克雷伯菌屬于條件致病菌，曾經(jīng)從植物及水生環(huán)境中檢出，也存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)，可導(dǎo)致人畜患病。本試驗(yàn)從腹瀉羔羊糞便中分離出10株具有產(chǎn)酸克雷伯菌特征的細(xì)菌，經(jīng)PCR測(cè)序得到5株產(chǎn)酸克雷伯菌，之后進(jìn)一步進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)及中藥體外抑菌試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)分離的產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)米諾環(huán)素、多西環(huán)素、四環(huán)素、慶大霉素、頭孢哌酮、丁胺卡那、頭孢曲松、呋喃唑酮、復(fù)方新諾明、氯霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星高度敏感，對(duì)多黏菌素B中度敏感，對(duì)萬古霉素等藥物低度敏感或耐藥，這與曾家瓊等[9]研究的結(jié)果一致，可能是研究中的產(chǎn)酸克雷伯菌均分離自動(dòng)物糞便。李月等[10]研究表明，產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)頭孢曲松、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星、環(huán)丙沙星耐藥，與本試驗(yàn)結(jié)果差異顯著。出現(xiàn)這種差異的原因可能是：李月等[10]研究中的豬場(chǎng)病原混合感染嚴(yán)重，大量不合理使用抗生素，導(dǎo)致抗生素耐藥性增強(qiáng)以及豬場(chǎng)疾病復(fù)雜多樣；病原未明確，導(dǎo)致無法合理篩選抗菌藥；且李月等[10]研究中的菌株為豬源性，而本研究所分離菌株來自羔羊，具有一定種屬差異。

目前抗生素價(jià)格相對(duì)低廉、使用方便，但生產(chǎn)過程中由于抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性[11]，已經(jīng)成為動(dòng)物疫病防控治療中的難題，動(dòng)物疫病防控面臨巨大挑戰(zhàn)。中草藥作為中國(guó)傳統(tǒng)藥材，來源廣泛，資源豐富，毒副作用低，使用方便，同時(shí)具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、提高生產(chǎn)性能的功效[12]。本試驗(yàn)根據(jù)綿羊采食草料特性，選用綿羊可采食中草藥（甘草、艾葉）進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，由甘草和艾葉組成的方劑對(duì)試驗(yàn)分離的5株產(chǎn)酸克雷伯菌產(chǎn)生了抑菌作用。艾葉抑菌成分為揮發(fā)油、黃酮，甘草的主要抑菌成分包括甘草黃酮、甘草查爾酮、甘草酸等，這與張召興等[13]研究中甘草素、甘草查爾酮A為甘草中主要抑菌成分的結(jié)果相符。王華等[14]研究表明，艾葉水提液對(duì)葡萄球菌、大腸桿菌等菌均具有抑制作用。甘草酸能夠抑制變形鏈球菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、黏附及生物膜形成[15]，艾葉的有效成分艾葉揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌均具有抑菌作用[16]。上述文獻(xiàn)也證實(shí)了甘草和艾葉具有一定的抑菌效果。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從南疆規(guī)模化羊場(chǎng)共采集腹瀉羔羊糞便75份，經(jīng)細(xì)菌分類培養(yǎng)、PCR鑒定共得到5株產(chǎn)酸克雷伯菌，且具有一定的致病性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)酸克雷伯菌對(duì)米諾環(huán)素、多西環(huán)素、四環(huán)素、慶大霉素、頭孢哌酮、丁胺卡那、頭孢曲松、呋喃唑酮、復(fù)方新諾明、氯霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星高度敏感，對(duì)多黏菌素B中度敏感，對(duì)紅霉素、新霉素、卡那霉素、克林霉素、諾氟沙星、麥迪霉素、萬古霉素低度敏感或耐藥。中藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，甘草、艾葉組成的方劑對(duì)本研究分離的產(chǎn)酸克雷伯菌產(chǎn)生了一定抑菌效果。